Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine PID verwendet, bei der es sich um ein proportionales integrales Ableitungssystem handelt, um Protokolle mit kontrollierter Kraft auf Proteinhydrogelproben anzuwenden, und dass ein kleines Probenvolumen verwendet wird. Die Protokolle für die Forces-Clamp ermöglichen eine einfache Interpretation der Daten, während geringe Volumina entscheidend sind, wenn mit schwer herzustellenden Proteinen gearbeitet wird, die nur in kleinen Mengen verfügbar sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung und Charakterisierung neuer biometrischer Materialien mit dauerhafter Elastizität unter Verwendung der für Proteine charakteristischen Abfaltungs- und Rückfaltungsübergänge.

Diese Methode kann Fragen in der Gewebe- und Biomaterialmechanik beantworten, indem sie die Messung von Milliarden von Proteinmolekülen in einem Zug ermöglicht und überfüllte Umgebungen simuliert, die für biologische Gewebe spezifisch sind. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Reagenzienlösungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das proteinbasierte Hydrogel zu synthetisieren, fixieren Sie zunächst eine 23-Gauge-Nadel mit einem gepressten Kolben auf einer Ein-Milliliter-Spritze.

Schneide dann mit einer Rasierklinge einen 10 Zentimeter langen Schlauch aus Polytetrafluorethylen oder PTFE ab. Befestigen Sie die Nadel und die Spritze an einem Ende des PTFE-Schlauchs. Führen Sie das zweite Ende des Röhrchens in eine Silanlösung ein und füllen Sie das Röhrchen, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen.

Lassen Sie die Tube ca. 30 Minuten einwirken. Entfernen Sie dann die Silanlösung und trocknen Sie das Rohr mit Druckluft. Mischen Sie nun die Proteinlösung mit APS und Tris(bipyridin)ruthenium(II)chlorid in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen unter Verwendung eines konstanten Volumenverhältnisses.

Wirbeln Sie die photoaktive Lösung, bis sie vollständig vermischt ist. Zentrifugieren Sie dann die Mischung bei maximaler Geschwindigkeit, um alle Blasen aus der Lösung zu entfernen. Beim Laden der photoaktiven Hydrogelmischung in das Teflonröhrchen können sich Blasen bilden, die zu Probenschäden führen.

Um Blasenbildung zu vermeiden, lassen Sie das Ende des Teflonschlauchs während des Ladevorgangs in der Lösungsmischung und ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zurück. Führen Sie das offene Ende des behandelten PTFE-Schlauchs in das photoaktive Gemisch ein und ziehen Sie die Lösung in den Schlauch, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen. Stellen Sie nun die geladene Röhre etwa 10 Zentimeter von einer 100-Watt-Quecksilberlampe entfernt auf, um eine Erwärmung zu verhindern, und halten Sie sie dort bis zu 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entferne die Tube von der Nadel und schneide die Ränder der Tube in der Nähe der Hydrogelenden mit einer Rasierklinge ab. Verwenden Sie dann eine abgestumpfte 24-Gauge-Nadel, um das Hydrogel in die Tris-Lösung zu extrudieren. Überprüfen Sie die Gele visuell auf Defekte, die sich während der Extrusion oder aufgrund von Blasen bilden könnten, und entsorgen Sie defekte Gele.

Starten Sie das Instrumentensteuerungsprogramm und schalten Sie den Schwingspulenmotor ein. Legen Sie dann die Spulenposition auf einen Wert am Ende des Bereichs fest. Verschieben Sie die Haken in Z-Richtung und richten Sie sie an der Biegung in X-Richtung aus.

Notieren Sie dann die Werte der Mikrometerschrauben für die X-Richtung. Binden Sie nun einen losen Doppel-Überhandknoten am Ende des Nahtstrangs, so dass der Durchmesser der Schlaufe etwa vier Millimeter beträgt. Schneide dann die Schlaufe vom Faden ab.

Wiederholen Sie den Vorgang, um eine zweite Schlaufe zu bilden. Platzieren Sie dann die beiden Schlaufen auf dem Haken, der mit dem Kraftsensor verbunden ist. Füllen Sie die Versuchskammer mit Tris-Puffer und überführen Sie die Hydrogelprobe mit einer medizinischen Pinzette in die gefüllte Kammer.

Platzieren Sie die Haken der Schwingspule und des Kraftsensors nahe an der Lösungsoberfläche und richten Sie die Haken in alle Richtungen mit den XYZ-Positioniermanipulatoren aus. Hängen Sie mit einer medizinischen Pinzette beide Seiten der Proteinhydrogelprobe an die Haken, die mit der Schwingspule und dem Kraftsensor verbunden sind. Ein typischer Fehler ist eine zu starke Straffung der Nahtschlaufen um die Hydrogelproben während des Befestigungsprozesses.

Dies kann zu einer Kerbbildung und einem Durchschneiden der Hydrogelprobe führen. Ziehen Sie vorsichtig eine Nahtschlaufe um die Hydrogelprobe auf dem Schwingspulenhaken fest, indem Sie beide Enden der Nahtschlaufe mit einer medizinischen Pinzette festhalten und gleichzeitig daran ziehen. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Schleife, die mit dem Kraftsensor verbunden ist.

Ziehen Sie die Nahtschlaufen an den Biegungen jedes Hakens fest, um ein Verrutschen zu verhindern. Verwenden Sie diese Biegungen als Referenzpunkte, um den Nullabstand zwischen den Haken zu ermitteln. Schneiden Sie die überschüssigen Längen der Nähte mit einer medizinischen Schere ab.

Bewegen Sie das angehängte Hydrogel mit Z-Manipulatoren entlang der Z-Achse in Richtung der Experimentierkammer, um das Hydrogel in die experimentelle Lösung einzutauchen. Richten Sie die Hydrogelprobe in YZ mit den Manipulatoren so aus, dass das Gel keiner Belastung ausgesetzt ist. Stellen Sie den Kraftsensor auf Null und trennen Sie die beiden Haken mit den X-Mikrometer-Schritten, bis das Gel anfängt, Kraft zu erfahren.

Sobald dies geschehen ist, drehen Sie die Mikrometerschraube leicht in X-Richtung zurück. Notieren Sie die Position beider Manipulatoren für den Schwingspulenmotor und den Sensor. Verwenden Sie dann die Differenz zwischen diesen Werten und den zuvor gemessenen, um den genauen Abstand zwischen den Anbindehaken zu Beginn des Experiments zu berechnen.

Um einen Kraft-Rampen-Zyklus durchzuführen, indem die Kraft mit der gewünschten Belastungsrate erhöht wird, geben Sie die Start- und Endkraftwerte sowie die Dauer des Protokolls ein, die als umgedrehtes V erscheint, gefolgt von einer konstanten niedrigen Kraft für etwa 200 Sekunden, damit sich die Proteindomänen vor dem nächsten Zyklus wieder falten können. Führen Sie ein Protokoll mit konstanter Kraft durch, indem Sie 30 Sekunden lang eine geringe Kraft anwenden. Erhöhen Sie dann die Kraft für eine definierte Zeit auf eine konstante Kraft, gefolgt von einem Abschrecken der Kraft auf denselben niedrigen Wert für mehr als 300 Sekunden, damit sich die Proteindomänen wieder falten und die Gelelastizität wiederherstellen kann.

Führen Sie abschließend die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Jede Messung beginnt mit einer Slack-Kurve. Durch das Anfügen von zwei Leitungen wird die Nullkraft auf den Sensor und die wahre Gellänge bestimmt.

Die wahre Gellänge wird aus dem Schnittpunkt der Passungen und der Position der Mikrometerschrauben berechnet. Das Force-Clamp-Rheometriesystem kann zwei verschiedene Arten von Protokollen anwenden. Im Kraftrampenmodus erfährt die Hydrogelprobe mit der Zeit ein Kraftänderungsprotokoll, das einem umgekehrten V.In konstanten Kraftmodus ähnelt, wobei sich die aufgebrachte Spannung in einem stufenartigen Muster ändert.

Während der Messungen passt das PID-System die Hydrogelausdehnung an, indem es die Position der Spule so ändert, dass sie dem vordefinierten Sollwert aus dem Kraftprotokoll folgt. Die Dehnung wird dann berechnet, indem die gemessene Ausdehnung durch die wahre Gellänge dividiert wird. Die Spannung wird bestimmt, indem die aufgebrachte Kraft auf die Querschnittsfläche der Hydrogelprobe dividiert wird.

Leiterbahnen für Kraftrampen werden am besten als Spannung gegen Dehnung dargestellt. Der Elastizitätsmodul kann aus dem Neigungsmaß während der Belastungsphase berechnet werden. Die Hysterese gibt die Energiedissipation an, die durch die Entfaltung und Wiederfaltung des Proteins entsteht.

Konstante Kraftspuren lassen sich am besten als Funktion der Zeit darstellen. Die Dehnungsänderung kann verwendet werden, um die Entfaltungs- und Wiederfaltungsraten zu messen, indem eine doppelte Exponentialfunktion angepasst wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Silan aus dem Röhrchen zu trocknen, bevor das Protein hinzugefügt wird, das Proteingemisch zu zentrifugieren, um Blasen zu entfernen, die Blasen nach dem Injizieren des Proteingemisches in das Röhrchen zu überprüfen und mechanisch beschädigte Hydrogele nach der Extrusion aus dem Röhrchen zu entsorgen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, zunächst Schwierigkeiten haben, die Gele mit den chirurgischen Nähten an den Haken zu befestigen, ohne die Hydrogelprobe zu beschädigen. Das Extrudieren des Gels aus der Tube kann das Hydrogel ebenfalls beschädigen. Diese Methode ermöglicht die Anwendung von Protokollen mit konstanter Kraft auf Hydrogelproben mit geringem Volumen.

Diese Experimente ermöglichen die Entkopplung des elastischen und des viskoelastischen Verhaltens und die Untersuchung der Proteinentfaltungs- und -faltungsmechanik in einem Bulk-Ansatz. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Materialwissenschaften, neue weiche Biomaterialien zu erforschen, wie z. B. auf Polyproteinen basierende Hydrogele, die ein hervorragendes Potenzial haben, als Tissue-Engineering-Gerüste, Arzneimittelabgabesysteme und biologische Tinte für den 3D-Druck zu dienen. Diese Methode bietet nicht nur Einblicke in die Mechanik von proteinbasierten Hydrogelen, sondern kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Messung der isometrischen Reaktion von Muskelfasern oder der Elastizität von Geweben wie der Haut.