Name: Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit modifizierten Baculovirus-Vektoren pflanzliche sekretierte Proteine in Insektenzellen herstellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Produktion großer Mengen rekombinanter Proteine für strukturbiologische Studien und Kristallisation.

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Diese Arbeit wurde durch die neue Fakultät Start Fonds an der North Carolina State University Guozhou Xu unterstützt.

Hinweis: Eine Insekt Zelle/Baculovirus-System mit veränderten Expressionsvektoren sekretorischen Pflanze Proteinexpression und Kristallisation wird verwendet.
1. Änderung eines Baculovirus Ausdruck Vektors mit der GP67-Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion
<ol><li>Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite13, die GP67 Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1A) zu synthetisieren. Hinweis: Da BglII und BamHI verdaut DNA führte in den gleichen Klebstoffen enden, der linearisierte Vektor kann auf das verdaute DNA-Fragment verbinden, während die BglII und BamHI Seiten nacheinander geglühten Ligatur zu einer Sequenz mutiert werden werden, die nicht von spaltbaren entweder BglII oder BamHI14.</li>
	<li>Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI14. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.<ol>
<li>Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.</li>
	<li>Extrahieren Sie jedes Plasmid DNA mit einem DNA-Miniprep Kit17 und bestätigen Sie die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-verstärken das A. Thaliana TDR gen fragment Codierung Rückstände 30-642 von einem synthetischen TDR-gen zu konstruieren (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, rückwärts-Primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl2und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.<ol>
<li>Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min, mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 5 min glühen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.</li>
</ol>(2) Änderung des Baculovirus Ausdruck Vektor mit der Insekten Hemolin Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion
<ol><li>Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite13, das Insekt Hemolin Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1 b) zu synthetisieren.</li>
	<li>Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI14. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.<ol>
<li>Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL kompetente Zellen DH5α, und wählen Sie die Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in einem 2-mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.</li>
	<li>Plasmid-DNA mit einem DNA-Miniprep Kit17 extrahieren und die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG bestätigen.</li>
	<li>PCR-verstärken A. Thaliana Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) Gen Fragment Codierung Rückstände 20-237 aus einem synthetischen PRK3 genkonstrukt (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, rückwärts-Primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl2und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.<ol>
<li>Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Glühen bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 30 s in jedem Zyklus, und die letzte Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.</li>
</ol>3. Produktion und Verstärkung des Baculovirus baut das rekombinante Protein Expressionskassette beherbergen
<ol><li>Einsatz 100 ng des Plasmids Konstrukt, 40 µL kompetente Zellen DH10Bac nach dem Protokoll des Baculovirus Ausdruck System1zu verwandeln. Inkubieren Sie die Verwandlung-Platten bei 37 ° C für 48 h.</li>
	<li>Zwei weiße Kolonien von jeder Transformation Platte abholen, jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin, 7 µg/mL Gentamicin und 10 µg/mL Tetracyclin zu impfen. Folgen Sie das Protokoll des Baculovirus Ausdruck System1 zu extrahieren und die Bacmid DNA zu überprüfen. Aliquoten jedes DNA in zwei Röhren mit jeweils 20 µL und speichern Sie die Rohre bei-20 ° C. Hinweis: Die folgenden Schritte erfordern eine aseptische Operation.</li>
	<li>Wachsen einer Monoschicht Sf9 Zellen in der Kultur Medien mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika bei 27 ° C bis 80 % Zusammenfluss in einem 6-Well-Platte. Schätzen Sie den Prozentsatz der Mündung ausgehend vom prozentualen Anteil der überdachte Fläche auf der Gewebekultur-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen in zwei sterile 1,5 mL Zentrifuge Röhren.<ol>
<li>Röhre 1: Für jede Transfektion verdünnen Sie 20 µL Bacmid DNA in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von flicking die Seite des Röhrchens vorsichtig.</li>
		<li>Rohr 2: Für jede Transfektion verdünnen Sie 8 µL Lipid Transfection Reagens in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von oben und unten für 6 X pipettieren gründlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie die beiden Lösungen, mischen Sie sie sanft durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X und inkubieren sie 20-40 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen jede Vertiefung der Monolage Sf9 Zellen 2 X mit 3 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Fügen Sie für jede Transfektion 0,8 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika zu jedes Röhrchen enthält die Lipid-DNA-Mischung hinzu. Mischen Sie der Inhalt der Röhren durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X vorsichtig. Aspirieren Sie waschen Medien von den Platten und überlagern Sie die Proben mit der Transfektion Mischung zu.</li>
	<li>Nach der Zugabe der Transfektion Mischung inkubieren der transfizierten Platte für 5 h bei 27 ° C. Ersetzen Sie die Transfektion Medien mit der kompletten Sf9 Zellkulturmedium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die transfizierte Platte bei 27 ° C für 4D.</li>
	<li>Ernte und verstärken die rekombinante Baculovirus.<ol>
<li>Den überstand der infizierten Platte in ein steriles 15 mL konische Röhrchen nach 4D Inkubation abholen. Drehen Sie den Überstand bei 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Verwerfen Sie das Pellet zu und Dekantieren Sie den überstand in ein sauberes Röhrchen und bewahren sie bei 4 ° C für bis zu 1 Jahr. Hinweis: Dies ist der P0-Virus. Es kann für einen längeren Zeitraum hinweg regelmäñig und bei-80 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Um jede rekombinanten Virus zu verstärken, wird eine Monolage Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte 80 % Zusammenfluss. Aspirieren Sie die Medien von der Platte, der Zellen-Anhänger auf die Platte 2 mL des P0 Virus hinzu und inkubieren Sie die Platte für 1 h in einem Inkubator 27 ° C. Rocken Sie die Platte alle 15 min um das Medium mit den Zellen zu mischen.<ol>
<li>Fügen Sie 25 mL des kompletten Graces Medium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die Platte für 3-d in einem Inkubator 27 ° C, die P1-Passage-Virus zu erhalten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sammeln des Überstands der infizierten Platte in ein steriles 50 mL konische Röhrchen und Spin 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Den überstand in ein sauberes Röhrchen dekantieren und bis zu 1 Jahr bei 4 ° C lagern. Hinweis: Das P1-Virus kann regelmäñig und bei-80 ° C gelagert für einen längeren Zeitraum hinweg sein.</li>
		<li>Um den Virus von P1 auf P2 Passage zu verstärken, wachsen Sie einem monomolekularen Film Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte zu 90 % Zusammenfluss, Aspirieren Sie die Medien der Platte, Platte 2 mL des P1-Virus hinzu, und 1 h in einem Inkubator 27 ° C inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.8.2 und 3.8.3, P2 und P3 Passagen der Viren zu erhalten. Lagern Sie die P3-Virus nicht mehr als 2 Monate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Protein-Expression, Reinigung mit NiNTA und Kristallisation
<ol><li>Kultur 1 L Hi5 Insektenzellen in der Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika zu einer Dichte von 2 x 106 bei 100 u/min in einem Inkubator Shaker 27 ° C. Spin-down der Zellen bei 570 X g für 5 min, Dekantieren des Überstandes, Aufschwemmen der Zellen in 20 mL des frisch hergestellten P3-Virus und bei Zimmertemperatur aufbewahren, denn 1 h. sanft schütteln Spin auf die Zellen 1 x alle 15 min aufzuwirbeln.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf 1 L von Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika, Kulturzellen bei 100 u/min in einem 27 ° C Inkubator Shaker für 72 h Spin die Zellen bei 1.010 X g für 5 min und den überstand zu sammeln.</li>
	<li>Einsatz-pH-Indikator Streifen passen den pH-Wert des Überstands bis 8,0 durch Zugabe von 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH und Bindung Puffer auf eine Endkonzentration, mit 20 mM Tris-Puffer bei pH 8.0, 100 mM NaCl, und 5 mM Imidazol hinzufügen. Fügen Sie ein gewisses Maß an NiNTA Harz (10-40 mL) basierend auf den geschätzten Ertrag des His-Tags rekombinanten Proteins ausgedrückt.<ol>
<li>Mischen Sie die Lösung auf eine magnetische rühren bei niedriger Drehzahl bei 4 ° C für 1 h waschen das Harz und eluieren Sie gebundenen Proteins nach dem standard NiNTA Reinigung Protokoll18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbehaltlich der gereinigten Proteins Ionenaustausch und gel Filtration Chromatographie sowie andere Protein Reinigungsmethoden, um eine homogene Probe zu erzielen. Hinweis: Für die TDR ektodomäne, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl dienten als Gel Filtration Puffer. Für die PRK3 ektodomäne, 20 mM Bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl dienten als bevorzugte Gel Filtration Puffer.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Angesichts der Vielfalt in Größe und Stabilität von den Tausenden der Proteine in den biologischen Systemen vorhanden, ist es oft für eine Forschung empirische Labor zu entscheiden, welche heterologen Expressionssystem muss für den Ausdruck eines spezifischen Proteins gewählt werden. E. Coli Expressionssystems ist oft die erste Wahl für Protein-Expression durch die kurze Lebensdauer der Bakterien, low-cost der Nährmedien und relativer Leichtigkeit Scale-up19. Für den Ausdruck der großen e...

Es ist unerlässlich für ein Forschungslabor in der Lage, große Mengen an homogene rekombinante Proteine für Biochemische und biophysikalische Charakterisierungen, speziell für x-ray kristallographischen Studien sein. Es gibt viele etablierte heterologen Expressionssysteme wie Escherichia coli, Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen, etc. unter ihnen, das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der wichtigsten häufig verwendeten Techniken, große Mengen von strukturell gefalteten großformatigen rekombinante eukaryotic Proteine für Protein Kristallisation1produzieren.
Expressionsvektoren des Expressionssystems Baculovirus wurden entwickelt, um eine starke Polyhedrin oder P10-Promoter zu produzieren eine hohe Ausbeute an rekombinanten intrazelluläre Proteine2,3enthalten. Um eine rekombinante Baculovirus zu machen, ist das Gen des Interesses in ein Insekt Vektor mit den Polyhedrin (Polh) Locus des Genoms Autographa Californica Multi-Nucleopolyhedroviral geklont. Das entstehende Konstrukt dann sequenziert und seine korrekte offenen Leserahmen (ORF) überprüft. Das richtige Konstrukt wird dann in die Wirtszelle Insekt durch den Prozess der Transfektion eingeführt. Das Gen des Interesses wird durch homologe Rekombination in das virale Genom eingefügt. Dieses Ereignis führt zu die Produktion von das rekombinante virale Genom, welche dann repliziert, rekombinante produzieren Virus Partikel1treibt.
Die Insekten, die am häufigsten in Expressionssystems dienen Sf9 und hoch fünf (Hi5) Zellen sind. Sf9 Zellen eine klonale Isolat Sf21, abgeleitet aus den pupal Eierstockkrebs Zellen von Spodoptera Frugiperda, und Hi5 Zellen eine klonale isolieren die elterliche Trichoplusia ni Eierstock Zelle Zeile TN-3684,5abgeleitet. Co Transfektionen, Virus-Verstärkung und Plaque-Assays sind auf Sf9 Zellen durchgeführt, während Hi5 Zellen in der Regel ausgewählt werden, um größere Mengen von rekombinanten Proteinen6zu produzieren. Es ist erwähnenswert, dass die Hi5-Zellen nicht geeignet für die Erzeugung und Verstärkung des Virus Stammarten wegen ihrer Tendenz, mutierte Viren zu produzieren. Traditionell gilt ein Temperaturbereich von 25-30 ° C gut für den Anbau von Insektenzellen. Allerdings wurde berichtet, dass 27-28 ° C die optimale Temperatur für die Insekten Zelle Wachstum und Infektion7,8 ist.
Die Einführung einer starken Signal-Sequenz vor das Gen ist für die hohe Expression von die sekretierten Proteine erforderlich. Die Signalsequenz würde effizient übersetzten rekombinanten Proteins in das endoplasmatische Retikulum für Protein Sekretion und Post-translationalen Modifikationen notwendig für die korrekte Faltung und Stabilisierung3führen. Signal-Peptid-Sequenzen, wurden wie z. B. das Baculovirus Protein GP64/67, Honigbiene Melittin, und andere, umhüllen ausgewählt, um den Ausdruck des sekretorischen rekombinante Proteine in das Baculovirus-vermittelten Expression Systeme3zu erleichtern. Die Einführung der Signalpeptid des GP67 hat sich gezeigt, um den Ausdruck Ertrag eines sekretierten rekombinanten Proteins, im Vergleich mit der intrinsischen Signalpeptid des Ziel-gen9zu verbessern. Hemolin ist ein Hämolymphe Protein der riesigen Seide Motte Hyalophora Cecropia, Bakterien-Infektion10induziert. Die Signal-Peptid-Sequenz des Gens ist aufgrund der relativ hohen induzierten Ausdruck lässt sich Sekretion Expression rekombinanter Proteine in das Baculovirus-Insekt Zellsystem zu vermitteln.
Die A. Thaliana Tracheary Elements Differenzierung hemmenden Faktor-Rezeptor (TDR) und Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) beide zu der Leucin-reiche Wiederholung Rezeptor-wie Kinase (LRR-RLK) Pflanzenfamilie der Proteine11,12 gehören . Um die Struktur und Funktion dieser Familie der Pflanze die Rezeptor-Proteine, sowie die strukturelle und biochemische Charakterisierung von anderen abgesondert Pflanzeneiweiß zu erleichtern zu studieren, hat das Baculovirus-Insekt Zelle Ausdruck System, modifiziert Protein-Qualität und Ertrag zu verbessern. Die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 wurden erfolgreich mit zwei modifizierte Expressionsvektoren in dem Ausdruck Baculovirus-Insekt Zellsystem geäußert. Sowohl die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 Proteine haben kristallisiert. Dieser Artikel berichtet der Ausdruck und die Reinigung von großen Mengen von rekombinanten sekretierten Pflanzeneiweiß mit zwei modifizierte Baculovirus Expressionsvektoren durch den Einbau eines GP67 oder einer Hemolin Signalsequenz zwischen dem Projektträger und mehreren Klonen Seiten.

<table><tbody><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>VWR</td><td>Modell Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>Modell 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>BECKMAN</td><td>Modell J-6</td><td>mit einem Ausschwingrotor</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA-Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>Für die PCR-Amplifikation von DNA-Thermocycler</td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>Modell C1000 Touch</td><td>Für die PCR-Amplifikation von DNA</td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modell I 24</td><td>Für die Züchtung von Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Kunden-DNA-Synthese</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Restriktionsendonuklease</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Restriktionsendonuklease</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restriktionsendonuklease</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restriktionsendonuklease</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA-Ligation</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA-Aufreinigung aus Agorase-Gel</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmid-DNA-Aufreinigung aus Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Für DNA-Gel-Elektropherose</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH5&alpha; competen cell</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Für die Transformation von DNA-Ligationsmischung</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Zur Herstellung von Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH10Bac kompetente Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Zur Herstellung von Bacmid</td></tr><tr><td>DNA S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Für die DNA-Transformation</td></tr><tr><td>CellFECTIN II Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Reagenz zur Transfektion von Insektenzellen</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Expression System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Baculovirus-Insektenzellen Expressionskit</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Für die Isolierung von rekomminanter Bacmid-DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Für die Isolierung von rekomminanter Bacmid-DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Baculorirus-Expressionsvektor</td></tr><tr><td>Sf9-Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 Monolayer-Zellen</td></tr><tr><td>Hi5-Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five Insektenzellen</td></tr><tr><td>Grace' s Insektenmedium, unergänzt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 Zelltransfektion minimales Medium</td></tr><tr><td>Grace' s Insektenmedium, ergänzt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 Monolayer-Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 Suspension Zellkulturmedium ohne FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 I.E./ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS-zertifiziert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>150-mm-Platten mit flachem Boden</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/Karton</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 Röhrchen/Beutel</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen mit konischem Schraubverschluss</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 Röhrchen/Beutel</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen mit konischem Schraubverschluss</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 Röhrchen/Beutel</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA</td></tr><tr><td>Harz pH-Indikatorstreifen</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH-Wert 0 - 14</td></tr></tbody></table>

pflanzliche proteine in insektenzellen abgesondert ändern baculovirus expressionsvektoren herstellen

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Es war eine Herausforderung für die Wissenschaftler rekombinante sekretorischen eukaryotic Proteine für strukturelle und biochemische Studien zum Ausdruck bringen. Das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der Systeme verwendet, um rekombinante eukaryotic sekretorische Proteine mit einigen Post-translationalen Modifikationen auszudrücken. Die sekretorischen Proteine müssen durch die sekretorischen Wege für Protein Glycosylation, Disulfid-Bindungen-Bildung und andere Post-translationalen Modifikationen weitergeleitet werden. Um die vorhandenen Insekten Zelle Ausdruck von sekretorischen Pflanzeneiweiß zu verbessern, wird ein Baculovirus Expressionsvektor durch die Zugabe von entweder ein GP67 oder ein Hemolin Signal Peptidsequenz zwischen dem Veranstalter und Klonen von mehreren Seiten geändert. Dieses neu gestaltete modifizierte vektorsystem produziert erfolgreich eine hohe Ausbeute an löslichen recombinant sekretierten Pflanze Rezeptorproteine von Arabidopsis Thaliana. Zwei der zum Ausdruck gebrachten pflanzlichen Proteinen, die extrazellulären Domänen von Arabidopsis TDR und PRK3 Plasma Membranrezeptoren, wurden für x-ray kristallographische Untersuchungen kristallisiert. Das modifizierte vektorsystem ist ein verbessertes Werkzeug, das potentiell für die Expression rekombinanter sekretorische Proteine im Tierreich als auch verwendet werden kann.

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden zwei modifizierte pFastBac1 Baculovirus Expressionsvektoren verwendet, um auszudrücken die sekretierten Proteine mit der GP67 oder der Hemolin Signalsequenz, die intrinsische Signalsequenz des Zielgens zu ersetzen. Die virale GP67 haben Insekt Hemolin Gene nachgewiesen und zu hohen Sekretion Ausdruck Niveaus in den Zellen haben. Fusionsproteine mit einem dieser beiden Signalsequenzen sollen Sekretion Ausdruck Ebenen verbe...

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Biochemie und Strukturbiologie sezernierter Proteine zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Proteinstruktur durch Kristallographie und Kryo-EM. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine große Menge an rekombinanten sekretierten Proteinen mit relativ geringen Kosten für die Bestimmung der Proteinstruktur produziert. Zuerst wird ein DNA-Fragment synthetisiert, das eine BglII-Schneidstelle mit fünf Primzahlen enthält, die Sekretionssignalsequenz von Interesse an einer Multiklonierungsstelle, wie im Textprotokoll beschrieben.Als nächstes verdauen Sie vier Mikrogramm der DNA mit BglII und X1 und vier Mikrogramm einer Expressionsvektor-DNA mit BamH1 und X1. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzyms mit der DNA in einem Reaktionspuffer mit 1X-Konzentration. Inkubieren Sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Mikroliter eines Ligationsreaktionsgemisches, das 1X T4 DNA Ligase-Reaktionspuffer und fünf Einheiten T4 DNA Ligase enthält, in ein frisches 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.Fügen Sie dann 100 Nanogramm der linearisierten Vektor-DNA und 400 Nanogramm des verdauten DNA-Fra

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält,...

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine ​​exprimieren.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Kindlins sind von grundlegender Bedeutung für die Zelladhäsion durch Integrine aber Studien von ihnen von der Schwierigkeit, sie rekombinante Expression in bakteriellen Wirten angetroffen behindert. Wir beschreiben hier Methoden für die effiziente Produktion in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Erfahren Sie, wie Sie mit modifizierten Baculovirus-Vektoren pflanzliche sekretierte Proteine in Insektenzellen herstellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Produktion großer Mengen rekombinanter Proteine für strukturbiologische Studien und Kristallisation.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

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