Name: Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung antigener Liposomen zur B-Zell-Aktivierung in vitro und in vivo. Diese Methode ermöglicht robuste Antikörperantworten in einem neuen Maus-Allergie-Modell mit geringerer Varianz.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 und W81XWH-16-1-0303).

<ol><li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence%2C+severity%2C+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li>
<li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((US+prevalence+of+self-reported+peanut%2C+tree+nut%2C+and+sesame+allergy%3A+11-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy%3A+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li>
<li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).</li>
<li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).</li>
<li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy%3A+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li>
<li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+%28STOP+II%29%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li>
<li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li>
<li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li>
<li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li>
<li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li>
<li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea%2C+Ara+h+2+and+Ara+h+6%2C+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li>
<li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li>
<li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li>
<li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li>
<li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li>
<li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).</li>
<li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG%2Fpeanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li>
<li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
<li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+myasthenia+gravis%3A+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+General+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li>
<li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebenen Methoden sind ein allgemeines Protokoll für die Konjugation eines Proteins, ein Lipid ermöglicht die Anzeige des Proteins auf liposomalen Nanopartikel. Für sehr große Multi-Untereinheit Proteine kann dieses Protokoll Dienstprogramm begrenzt. Die ideale Methode wäre die Einführung eines Site-spezifische Tags, mit dem ein Biorthogonal chemische Verknüpfungsstrategie verwendet werden können. Wenn das Protein rekombinant zum Ausdruck zu bringen, ist dies möglich mit verfügbaren standortspezifische Stra...

Nahrungsmittel-Allergie betrifft 8 % der Kinder in den Vereinigten Staaten, und stieg in der Prävalenz in den vergangenen zehn Jahren1. Allergie gegen Erdnuss betrifft 1 % der Kinder und ist nicht in der Regel entwachsen2. Obwohl mehrere vielversprechende klinische Studien sind im Gange für die Behandlung von Nahrungsmittelallergien, einschließlich oraler Immuntherapie (OIT), sublinguale Immuntherapie (SLIT) und Epicutan Immuntherapie (EPIT), gibt es derzeit keine FDA-zugelassene Behandlungsstrategien für die Desensibilisierung Erdnuss-Allergiker3,4,5,6,7,8. Daher müssen allergische Personen Allergene zur Vermeidung von Anaphylaxie strikt vermeiden. Es bleiben viele Fragen in Bezug auf Routen der Sensibilisierung und zugrundeliegende Mechanismen der Lebensmittel-Allergie-Entwicklung.
Maus-Modellen sind ein wertvolles Werkzeug für die Mechanismen der Allergie zu studieren sowie die Entwicklung neuer tolerogene und Desensibilisierung Therapien9,10,11,12. Dies gilt vor allem weil die großen Erdnuss Allergen (Ara h 2; Ah2) beim Menschen ist auch das dominierende Allergen in mehreren beschrieben Maus Modelle13,14. Während Mausmodelle der Erdnuss-Allergie bei der Untersuchung der Mechanismen der Sensibilisierung und Toleranz von unschätzbarem Wert sind, ist ein Nachteil, dass sie können variabel sein und erfordern den Einsatz von Hilfsstoffen. Potentere immunogenen wäre eine Möglichkeit, die innere Variabilität solcher Modelle zu minimieren. Da B-Zellen stark durch multivalente Antigene aktiviert sind, sind Antigene Liposomen anzeigen das Allergen eine gute Wahl wegen ihrer Fähigkeit, potentiell B-Zellen durch die B-Zell-Rezeptor (BCR) aktivieren, während auch die Eigenschaft des effizient Grundieren die T-Zell-Fach durch unspezifisch durch Antigen-präsentierenden aufgegriffen wird Zellen.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Konjugation Protein-Antigene, liposomale Nanopartikel mit einer einfache und modulare Strategie. Mit einem Ersatz-Antigen, Anti-IgM-Fab-Fragment, wir zeigen wie stark solche Antigenen Liposomen können in anregenden B-Zell-Aktivierung werden. Antigene Liposomen anzeigen Ah2 Antigen wurden verwendet, um ein neues Mausmodell der übertragenen Sensibilität zu entwickeln. In diesem Modell sind Splenocyten von verifizierten Erdnuss allergische Mäuse, mit Erdnuss-spezifische Speicher B- und T-Zellen, in naiven Congenic Mäuse übertragen. Speicher-Antikörper-Reaktionen werden durch Injektion von Liposomen in den Empfänger Mäuse, um Antikörper gegen Ah2 induzieren mit Ah2 konjugierten induziert. Gefolgt von nur einen Schub mit löslichen Ah2, geben Ah2-spezifische Antikörper Anlass zu einer starken anaphylaktischen Reaktion, wenn diese Mäuse anschließend mit Ah2 herausgefordert werden. Wie Mäuse durchläuft die allergische Reaktion sehr einheitlich reagieren und Adjuvans nicht erhalten haben, dieser Ansatz ist eine wünschenswerte Erdnuss-Allergie-Modell und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in anderen getrieben durch Antigene gerichtet an Mausmodellen Dienstprogramm möglicherweise Allergene und möglicherweise Autoantigene.

<table><tbody><tr><td>Modell 2110 Fraktionssammler</td><td>BioRad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Sigma Klasse 99%</td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21857</td><td></td></tr><tr><td>DSPC</td><td>Avanti</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG 18:0</td><td>Avanti</td><td>880120</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG Maleimid</td><td></td><td>Avanti 880126</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td>1 mL Spritze mit Halter/Heizblock</td></tr><tr><td>Filter 0,1 & Mikro; m</td><td>Avanti</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0,8 &Mikro; m</td><td>Avanti</td><td>610009</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Filterhalterungen</td><td>Avanti</td><td>6100014</td><td></td></tr><tr><td>Glas Rundkolben</td><td>Sigma</td><td>Z100633</td><td></td></tr><tr><td>Wendestopfen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-301398</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-198194</td><td></td></tr><tr><td>Leur Lock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>k4201634503</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50 Perlen</td><td>GE Life Sciences</td><td>17004201</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G100 Perlen</td><td>GE Life Sciences</td><td>17006001</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Indo-1</td><td>Invitrogen</td><td>I1203</td><td></td></tr><tr><td>CD5-PE</td><td>BioLegend</td><td>100608</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td>ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Fab Anti-Maus</td><td>IgM Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-020</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 Anti-Maus</td><td>IgM Jackson ImmunoResearch</td><td>115-006-020</td><td></td></tr><tr><td>Erdnussmehl</td><td>Golden Peanut Co.</td><td>521271</td><td>12% Fett hell geröstet, 50% Eiweiß</td></tr><tr><td>Fütterungsnadeln</td><td>Cadence Science</td><td>7920</td><td>22g x 1.5", 1.25 mm - gerade</td></tr><tr><td>Mikrosonde Thermometer</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Rektumsonde für Mäuse</td><td>Physitemp</td><td>Ret-3</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin, von Vibrio cholera</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>100B</td><td>Azidfreies</td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Karbonat-Bicarbonat-Puffer</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>TMB Stopplösung</td><td>KPL</td><td>50-85-06</td><td></td></tr><tr><td>SureBlue TMB Mikrotiter-Peroxidase-Substrat</td><td>KPL</td><td>5120-0077</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Immulon 4HBX-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigtes lösliches Ara h 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>gereinigt wie in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td></tr><tr><td>HSA-DNP</td><td>Sigma</td><td>A-6661</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgE anti-DNP</td><td>Genaue Chemikalie</td><td>BYA60251</td><td></td></tr><tr><td>Schaf anti-Maus IgE</td><td>Die Bindungsstelle</td><td>PC284</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Esel Anti-Schaf</td><td>IgG Genaue chemische JNS065003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Protein, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 Anti-DNP</td><td>Genaue chemische</td><td>MADNP105</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Maus IgG1</td><td>Southern Biotech</td><td>1070-05</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>329412</td><td>U-100 Insulin, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-14</td><td>25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>70 &mu; m Nylon, weiß, steril, einzeln verpackt</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>10 Gele</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Puffer, 4x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Vorgefärbt Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>500 & micro; L</td></tr><tr><td>NuPAGE MES/SDS Laufpuffer, 20x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>24590</td><td>500 mL</td></tr></tbody></table>

antigenen liposomen für generation krankheitsspezifische antikörper

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antikörperantworten bieten wichtige schützende Immunität auf ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Es bleibt ein hohes Interesse bei der Schaffung von robusten Antikörper für die Impfung sowie wie pathogenen Antikörper verstehen, Antworten zu Allergien und Autoimmunkrankheiten zu entwickeln. Robuste Antigen-spezifischen Antikörper-Reaktionen zu erzeugen, ist nicht trivial. In Mausmodellen bedarf es oft mehrere Runden von Impfungen mit Adjuvans, die zu viel Variabilität in der Höhe der induzierten Antikörper führt. Ein Beispiel ist in Mausmodellen von Erdnuss-Allergien wo stabile und reproduzierbare Modelle, die Maus Zahlen und den Einsatz der adjuvanten minimieren vorteilhaft wäre. Präsentiert hier ist eine hoch reproduzierbare Mausmodell der Erdnuss-Allergie Anaphylaxie. Dieses neue Modell stützt sich auf zwei Faktoren: (1) Antigen-spezifische Splenocyten sind adoptively von einer Erdnuss sensibilisiert Maus übertragen, in eine naive Empfänger Maus, normalisieren die Anzahl von Antigen-spezifische B- und T-Zellen über eine große Anzahl von Mäusen; und (2) Empfänger Mäuse anschließend mit einem starken multivalente Immunogen in Form von liposomalen Nanopartikel, die Anzeige der wichtigsten Erdnuss Allergens (Ara h 2) gesteigert werden. Der große Vorteil dieses Modells ist die Reproduzierbarkeit, die letztlich die Anzahl der verwendeten Tiere in jeder Studie, bei gleichzeitiger Minimierung der Anzahl der Tiere erhalten mehrere Injektionen der adjuvanten senkt. Der modulare Aufbau dieser immunogenen Liposomen bietet relativ einfache Anpassungsfähigkeit zu anderen allergischen oder Autoimmun-Modelle, die pathogenen Antikörper beinhalten.

Konjugation des Proteins des Interesses mit DSPE-PEG(2000) nachgewiesen werden kann, indem man eine Verringerung mit einem Anstieg im Vergleich zu dem unconjugated Protein Molekulargewicht. Abbildung 1A zeigt eine repräsentativen Gel Anti-Maus IgM F(ab) Fragment Konjugation, PEG-DSPE, die eine 2 – 3-kDa-Bandshift für das denaturierte Protein zeigt. Beachten Sie, dass ca. 50 % des Proteins angezeigt wird geändert werden, das dürfte angesichts der Tatsache, das...

Beschrieben, ist die Vorbereitung von Antigenen liposomalen Nanopartikeln und ihre Verwendung in anregenden B-Zell Aktivierung in Vitro und in Vivo. Konsistente und robuste Antikörperantworten führte zur Entwicklung eines neuen Modells der Erdnuss-Allergie. Das Protokoll zur Erzeugung von Antigenen Liposomen kann auf verschiedene Antigene und Immunisierung Modelle ausgedehnt werden.

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie z. B. wie werden weiße Blutkörperchen aktiviert und wie entwickeln sich Allergien gegen einzelne Allergene? Der Hauptvorteil dieses robusten und reproduzierbaren Allergiemausmodells besteht darin, dass weniger Mäuse verwendet werden können, um eine geringere Varianz mit einer experimentellen Population zu erzielen. Neue Immuntherapien zur Kontrolle der Immunantworten erfordern robuste Mausmodelle als erstes Mittel zur Prüfung der In-vivo-Wirksamkeit.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich somit auf die Immuntherapie der Allergie. Obwohl diese Methode Einblick in Allergien geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie Autoimmunität, bei der unerwünschte Antikörperreaktionen eine Schlüsselrolle bei Krankheiten spielen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mangelnder Erfahrung in der Arbeit mit liposomalen Nanopartikeln oder einer Unerfahrenheit mit den in der Mausarbeit erforderlichen Techniken schwierigkeiten.Beginnen Sie mit 2,5 Moläquivalent des heterobifunktionellen Verklinkers zum Protein und platzieren Sie die Reaktion auf einem oszillierenden Shaker bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde. Nach einer einstündigen Inkubation mit SPDP das Protein auf einer Säule, die in 100-Millimolar-Natriumacetat ausgeglichen wird, entsalzen und die Fraktionen sammeln. Bestimmen Sie die Absorptionsfähigkeit von 280 Nanometern und bündeln Sie die oberen Fraktionen.Waschen Sie die Säule in PBS, und fügen Sie 25-Millimolar Dithiothreitol, oder DTT, zu den gepoolten Proteinfraktionen für eine fünf- bis zehnminütige Inkubation hinzu. Messen Sie dann die 280- und 343-Nanometer-Absorptionen des Proteins, um die Berechnung des Verknüpfungsverhältnisses basierend auf der Molarität des Proteins und des Linkers zu ermöglichen. Führen Sie anschließend die gepoolten Fraktionen der PBS-gewaschenen Säule aus, und sammeln Sie die Fraktionen für die Messung des 280-Nanometer- und oberen Fraction-Poolings, wie gezeigt.Fügen Sie das entsprechende Volumen von 100x DSPE-PEG2000-Maleimid zum Protein hinzu, um eine 1x, 10-fache molarüberschüssige Endkonzentration mit sanftem Wirbeln zu erreichen. Dann führen Sie die Reaktion über Nacht unter Stickstoff in einem versiegelten Rundbodenkolben. Führen Sie das Protein am nächsten Tag über eine vernetzte Dextran-Gel-Perlensäule und speichern Sie die letzten gepoolten Fraktionen des lipidgebundenen Proteins bei vier Grad Celsius bis zu ihrer Verwendung.Sobald die richtige Menge jedes Lipids berechnet wurde, kombinieren Sie alle Lipide zu einem 12-Milliliter Borosilikatglas-Reagenzglas und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze und Schläuche, um die Chloroform vorsichtig mit Stickstoff abzublasen. Dann lyophilisieren Sie die Lösung mit 100 Mikroliter DMSO über Nacht. Am nächsten Morgen einen Milliliter Lipid-gebundenes Protein in das 12-Milliliter-Lipidrohr geben und die Lösung drei- bis viermal für 30 bis 60 Sekunden pro Beschallung in einem Beschallungswasserbad mit mindestens fünfminütigen Pausen zwischen den Beschallungen beschallen.Nach der letzten Beschallung die Probe in eine der in den Extruder gelegten Extruderspritzen laden und die Extruderspritze in das andere Ende des Extruders legen. Die leere Spritze füllt sich, wenn das Lipid durch die Polycarbonat-Membran 0,8 Mikrometer extrudiert wird. Legen Sie den vollständig montierten Extruder in einen Heizblock und drücken Sie den Kolben vorsichtig, um die Spritze zu entleeren.Nach der letzten Extrusion die Liposomen in eine saubere Durchstechflasche übertragen und die Lipide durch Polycarbonat-0,2- und 0,1-Mikrometer-Membranen extrudieren, wie gerade gezeigt. Dann lagern Sie die Liposomen bei vier Grad Celsius. Um die B-Zell-Reaktion auf die antigene Liposomenaktivierung zu überwachen, setzen Sie 1,5-mal 10 bis zu den siebten Geschnetagen im Calciumfluss-Ladepuffer aus, und fügen Sie 1,5-Mikromolindo-1 zu den Zellen hinzu, wodurch die Lösung in der Röhre mehrmals zum Mischen invertiert wird.Nach einer 30-minütigen Wasserbad-Inkubation bei 37 Grad Celsius, geschützt vor Licht, fügen Sie das Fünffache des Volumens des Kalziumfluss-Ladepuffers hinzu und zentrieren die Indo-1-markierten Zellen. Für B-Zell-Gating, Fleckenzellen mit Anti-CD5 und Anti-B220-Antikörper in 0,5 Milliliter Ladepuffer bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Zellen in einem frischen Kalziumfluss-Ladepuffer waschen und das Pellet ein bis zwei Mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter frischer Kalziumfluss-Laufpuffer für die Lagerung auf Eis, geschützt vor Licht bis zur Analyse, wieder aufsetzen.Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter Zellen zu einem gekappten, fünf Milliliter, runden Boden, Polystyrol-Rohr, und erwärmen Sie die Zellen auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Nach drei bis fünf Minuten das Rohr in eine 37-Grad-Celsius-Wasserhülle nen, die mit einem umlaufenden Wasserbad verbunden ist, und führen Sie das Rohr im Wassermantel auf dem Durchflusszytometer. Nach dem Sammeln von 5 000 bis 10.000 Ereignissen pro Sekunde können sich die Zellen 15 bis 30 Sekunden lang stabilisieren und die Datenerfassung erneut starten, indem die Daten mindestens 10 Sekunden lang gesammelt werden, um einen Hintergrundwert zu erstellen.Bei der 10-Sekunden-Marke entfernen Sie schnell das Rohr aus dem Durchflusszytometer und fügen Sie die entsprechende experimentelle Konzentration antigener Liposomen hinzu. Dann pulsieren Wirbel die Zellen, und lesen Sie die Röhre auf dem Zytometer für weitere drei bis fünf Minuten. Um die Tiere zu sensibilisieren, liefern Sie 200 Mikroliter Erdnussextrakt, der Choleratoxin enthält, per Oralgavage an jeden vier- bis fünf Wochen alten BALB/c weiblichen Mausempfänger einmal pro Woche für drei Wochen und 300 Mikroliter verdünnten Erdnussextrakts in der vierten Woche.Am 28. Tag bereiten Sie Erdnussextrakt auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter in PBS vor und verwenden Sie ein rektales Thermometer, um die Körpertemperatur jedes sensibilisierten Tieres zu messen. Wenn alle Temperaturen gemessen wurden, verabreichen Sie jedem Empfänger 200 Mikroliter Erdnussextrakt per intraperitonealer Injektion und messen Sie die Körpertemperatur mit dem Rektalthermometer alle 15 Minuten für eine Stunde nach der Injektion. Ein Rückgang der Körpertemperatur deutet auf eine Erdnussallergie hin.Nachdem Sie Splenozyten von den Erdnuss-allergischen Mäusen isoliert haben, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, die mit einer 27-Spur- und 5/8-Zoll-Nadel ausgestattet ist, um 1,5-mal 10 bis zum siebten der extrahierten allergischen Splenozyten in die Schwanzvenen naiver, nicht entsiver Tiere injiziert zu werden. Einen Tag nach der Adoptivübertragung injizieren Sie intravenös 200 Mikroliter Ara h 2 antigene Liposomen in die Schwanzvene jeder BALB/c-Maus, die die allergischen Splenozyten erhalten hat. Zwei Wochen nach der Liposomeninjektion die Mäuse mit einem i.p.Injektion von löslichen Ara h 2, gefolgt von einer 200-Mikroliter Ara h 2 Herausforderung am Tag 61. Messen Sie dann die Körpertemperaturen mit der Rektalsonde alle 15 Minuten, wie gezeigt. Die Proteinkonjugation kann durch das Ausführen eines reduzierenden Gels nachgewiesen werden, das eine Zunahme des Molekulargewichts im Vergleich zum nicht konjugierten Protein zeigt.Um den antigenen liposomenstimulierten B-Zell-Calciumfluss zu bewerten, gate die lebenden Einzelzellen, um die Auswahl der B220-positiven CD5-negativen B-Zellen zu ermöglichen. Das Verhältnis von Indo-1 violett versus Indo-1 blaue Fluoreszenz im Laufe der Zeit kann dann analysiert werden, um die Menge der Liposomen-induzierten B-Zell-Aktivierung zu bewerten. Die Quantifizierung von Ara h 2-spezifischen IgE und IgG1 im Serum von Erdnussextrakt-sensibilisierten Mäusen durch ELISA zeigt, dass Mäuse mit übertragener Empfindlichkeit, die mit Ara h 2 verstärkt werden, messbare Ara h 2-spezifische IgE und IgG1 in ihrem Serum aufweisen.Die während der Ara h 2-Herausforderung aufgezeichneten Körpertemperaturen zeigen, dass allergische Mäuse nach der Herausforderung verminderte Körpertemperaturen aufweisen, während die Körpertemperaturen bei naiven Mäusen konstant bleiben. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sorgfältig zu verfolgen, wie viel Lipid-gebundenes Protein in die Liposomen eingearbeitet wird, da zu viel Protein die Extrusion erschweren kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Tracking und Sortieren allergenspezifischer B- und T-Zellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie diese allergenspezifischen Zellen auf Therapien reagieren.Diese Technik wird den Weg für Forscher im Allergiebereich ebnen, um neue Immuntherapien zu erforschen, die allergische Krankheiten mit diesem Mausmodell bekämpfen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Cholera-Toxin gefährlich sein kann und dass die Richtlinien für seine Verwendung gemäß Ihren lokalen institutionellen biologischen Sicherheitsstandards befolgt werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die technischen Aspekte der Durchführung LIPS (Luciferase Immunpräzipitation Systems) beschrieben sind. Das Gesamtkonzept beinhaltet Ausdruck chimären Gene Antigene fusioniert an Renilla Luziferase (RUC) in Säugerzellen. Crude Ruc-Antigen-Extrakte werden dann aufbereitet und ohne Reinigung eingesetzt in Immunpräzipitationsassays, um Antikörper zu quantifizieren.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Dieses Video zeigt die Beurteilung der B-Zell-Aktivierung durch die Verwendung von antigenen Liposomen. B-Zellen, die mit dem calciumsensitiven Indo-1-Farbstoff behandelt wurden, werden mittels Durchflusszytometrie unterschieden und ihr Fluoreszenzverhältnis von Violett zu Blau analysiert. Wenn die Zellen auf antigene Liposomen treffen, löst es die B-Zell-Aktivierung durch Kalziumeinstrom aus, wodurch das Fluoreszenzsignalverhältnis von Violett zu Blau im Laufe der Zeit schrittweise verbessert...

Überwachung der B-Zell-Aktivierung mit antigenen Liposomen mit einem Calcium-Flux-Assay

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann.  Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern auf Basis der Hybridom-Technologie vorgestellt. Die Mäuse wurden mit einem Immunkonjugat immunisiert. Milzzellen wurden durch PEG und einen elektrischen Impuls mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Antikörper-produzierende Hybridomzellen wurden mittels HAT und antigenspezifischem ELISA-Screening selektiert.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler...

Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in Antigenen, die auf VLP-basierten Impfstoffen (Virus Like Particle) mit einem Capture-Assay angezeigt werden

Erfahren Sie die Herstellung antigener Liposomen zur B-Zell-Aktivierung in vitro und in vivo. Diese Methode ermöglicht robuste Antikörperantworten in einem neuen Maus-Allergie-Modell mit geringerer Varianz.

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

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