Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden
5. September 2018
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im morphologischen Bereich zu beantworten, wie z.B. die Paraffinschnitte. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Schneiden und der Faltvorgang kulminiert werden und der Übertragungsprozess vermieden wird, der bei der herkömmlichen Methode erforderlich ist. Sammeln Sie zunächst alle vorgefertigten Teile in einem Abzug.
Verwenden Sie Chloroform, um die sieben Acrylplatten zu kombinieren, wie hier gezeigt. Das Endprodukt wird ein Tank sein, der mit einem Schnittkanal und einem Wasserbad ausgestattet ist. Installieren Sie das röhrenförmige elektrische Heizelement durch das Loch in der Acrylplatte Nummer zwei.
Bohren Sie mit einer elektrischen Bohrmaschine ein kleines Loch in die Acrylplatte Nummer sieben und installieren Sie ein digitales Thermostat am Tank, wobei Sie darauf achten, dass er mindestens einen Zentimeter unter dem Niveau der vorgesehenen Wasseroberfläche liegt, was durch den schwarzen Punkt auf dem Tank angezeigt wird. Stellen Sie die Spannung so ein, dass sie unter 24 Volt liegt, bevor Sie das Gerät einschalten. Nehmen Sie die Ablaufschale aus dem Mikrotom.
Verwenden Sie anschließend einen neutralen Silikondichtstoff, um den Kanal der Abschnitte mit dem Mikrotom-Klingenhalter zu verbinden, und achten Sie darauf, dass kein Dichtmittel über die Oberseite der Klinge gelangt. Lassen Sie das Setup über Nacht trocknen, damit das Chloroform und der neutrale Silikondichtstoff Zeit haben, sich zu verfestigen. Setzen Sie die Klinge am nächsten Tag in den Klingenhalter ein.
Gib Wasser in das Wasserbad und achte darauf, dass die Wasseroberfläche nur die Oberseite der Klinge berührt. Schalten Sie nach der herkömmlichen Paraffinsektion das Gerät ein, um eine verbesserte Paraffinsektion zu starten. Verwenden Sie den Temperaturerkennungsschalter, um die Heizung zu öffnen.
Stellen Sie die Zieltemperatur für eine Stunde zwischen 38 Grad Celsius und 40 Grad Celsius ein, um das Wasser zu erwärmen. Verwenden Sie ein Messer, um den durch die Paraffineinbettung erworbenen Paraffinblock zu modifizieren. Setzen Sie dann den Block auf die Kassettenklemme des Mikrotoms und verriegeln Sie ihn.
Schneiden Sie die dickeren Abschnitte, um sich der Probe schnell zu nähern. Stellen Sie die Dicke auf eine geeignete Querschnittsdicke für die Proben ein. Durch Drehen des Handrads werden die Sektionen automatisch in Sektionen, Kanal und Bad geladen.
Anschließend wird die Probe in einem langsamen und gleichmäßigen Schnitthub geschnitten. Führen Sie die Abschnitte so in die Badkammer, dass sie in einer Linie schwimmen. Wenn das Kopfteil an der Kammerwand haftet, verwenden Sie eine Bürstenführung, um es schwebend zu halten.
Nachdem sich die Abschnitte im Wasserbad vollständig entfaltet haben, trenne sie mit einer Pinzette und nimm sie dann auf einem Objektträger auf. Schieben Sie die Objektträger in einen auf 42 Grad Celsius eingestellten Ofen, um sie über Nacht zu trocknen. Die Objektträger können dann unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, bis sie zur Analyse bereit sind.
Wenn Sie zur Analyse bereit sind, verwenden Sie die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, um die Schnitte mit der verbesserten Methode zu bewerten. In dieser Studie wird eine verbesserte Methode zur Präparation von Paraffinschnitten für adultes Maus-Hippocampusgewebe, adulte Mausnieren, embryonale Mausgehirne und Zebrafischaugen verwendet. Wie hier gezeigt, vermeidet die neue Methode Schnittverluste und erhöht den Anteil intakter Schnitte in jeder Art von untersuchtem Gewebe.
Bei der Durchführung von Schnitten ganzer Serien wird diese Methode als Beschleunigung der Paraffinschnittgeschwindigkeit in allen getesteten Proben angesehen. Mit anderen Worten, diese Methode bietet eine qualitativ hochwertigere Paraffintrennung in kürzerer Zeit als die herkömmliche Methode. Serienschnitte der optischen Netzhaut des Zebrafisches werden dann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung beobachtet.
Die Schnitte, die mit der verbesserten Methode entnommen werden, weisen eine bessere Integrität auf als diejenigen, die mit der herkömmlichen Paraffin-Schnittmethode entnommen werden. Während es beim Vergleich dieser beiden Methoden keine signifikanten Unterschiede in der Qualität der meisten geernteten Abschnitte gibt, wird festgestellt, dass einige Abschnitte, die mit der konventionellen Methode geerntet wurden, von relativ geringer Qualität sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Abzüge getroffen werden sollten.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig Wasser hinzuzufügen und eine Überfüllung zu vermeiden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, das darauf abzielt, das Schneiden von Paraffinschnitten zu verbessern, indem Schneiden und Auflegen in einer thermostatischen Kammer kombiniert werden, wodurch der traditionelle Übertragungsprozess entfällt. Diese Modifikation verbessert deutlich sowohl die Effizienz als auch die Integrität der Paraffinschnitte.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Feingewebekunde
- Neurowissenschaft
- Paraffinschnitttechniken
Hintergrund
- Die konventionelle Paraffinschnitttechnik umfasst mehrere Übertragungsschritte, die häufig zum Verlust von Schnitten führen.
- Die neue Methode vereinfacht den Prozess und erhöht die Ausbeute an intakten Schnitten.
- Eine verbesserte Schnitttechnik ist entscheidend für eine genaue morphologische Analyse verschiedener biologischer Gewebe.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll vorstellen, das die Anzahl intakter Paraffinschnitte erhöht.
- Die für die Paraffinschnitt-Herstellung in der biologischen Forschung benötigte Zeit verkürzen.
- Eine verbesserte Analyse von Maus- und Zebrafisch-Geweben ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Der Artikel beschreibt eine Methode, die eine thermostatische Kammer für das Schneiden von Schnitten beinhaltet.
- Die Paraffineinbettung und das Schneiden von Geweben des adulten Maushippocampus, Nieren, embryonalen Maushirns sowie Zebrafischaugen wurden durchgeführt.
- Temperaturvorgaben und spezifische Installationsanleitungen für die Apparatur werden erläutert.
- Kritische Schritte umfassen die sorgfältige Einrichtung der Heizelemente und die Prozeduren zum Schneiden der Schnitte.
- Die Schnitte werden anschließend mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um sie zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Es wird gezeigt, dass das Protokoll im Vergleich zu herkömmlichen Methoden Schnitte von höherer Qualität mit geringeren Verlusten liefert.
- Eine verbesserte Integrität der Schnitte wurde bei verschiedenen Gewebetypen beobachtet, insbesondere beim Zebrafisch-Optikretina und bei Mausgeweben.
- Die Methode beschleunigt den Paraffinschneidprozess, während gleichzeitig die Qualität erhalten bleibt.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt ein effizienteres Protokoll für die Paraffinschnitttechnik bereit, das die Integrität von Gewebeproben fördert.
- Sie verbessert morphologische Untersuchungen, indem sie in kürzerer Zeit qualitativ hochwertigere Ergebnisse ermöglicht.
- Die Auswirkungen sind bedeutend für Forschende, die auf präzise Schnitttechniken für die histologische Analyse angewiesen sind.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die Paraffinschnitttechnik stellt nach wie vor eine Engstelle in histologischen Arbeitsabläufen dar, insbesondere bei der Hochdurchsatz-Validierung von Zielstrukturen und der phänotypischen Bildschirmung in der entdeckungsorientierten Biologie. Diese Methode verbessert die Integrität und den Durchsatz der Schnitte und verringert technische Variabilitäten, die die Auswertung nachgeschalteter Assays und Bemühungen zur mechnismusbasierten Entschärfung von Risiken beeinträchtigen können. Durch die Möglichkeit einer zuverlässigen und reproduzierbaren Gewebepräparation unterstützt sie die Vorhersagekraft von Target-Engagement-Studien in Modellen der Neurowissenschaften und Onkologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Untersuchung von Gewebemorphologie mit hoher Integrität zur Lokalisation von Zielstrukturen und Analyse von Signalwegen.
- Operativer Wert: Verringert den Verlust von Schnitten und manuelle Transferschritte und erhöht somit die nutzbare Gewebeausbeute pro Experiment.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt konsistente histologische Analyseergebnisse, die für Untersuchungen zur Zielstrukturenbindung und Wirkmechanismen unerlässlich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, intakte Schnitte, die für Immunhistochemie- und In-situ-Hybridisierungsanalysen geeignet sind.
- Operativer Wert: Optimiert den Schnittablauf und ermöglicht es weniger erfahrenen Bedienern, Qualität und Konsistenz aufrechtzuerhalten.
- Eignung für Analysen: Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen, indem Gewebeartefakte, die die Signalerfassung stören, minimiert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die morphologische Treue über krankheitsrelevante Systeme hinweg, einschließlich muriner und Zebrafischtissue.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mit reduziertem technischem Versagen.
- Risikominderung: Verringert biologisches Rauschen in Längsschnittstudien und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein, wobei zuverlässige Histologie Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch informiert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mithilfe intakter Gewebeschnitte zur Zielstrukturvalidierung und zur Ko-Lokalisation von Biomarkern.
- Screening: Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays durch die Bereitstellung einheitlicher Schnitte für die quantitative Bildgebung und Färbung.
- Analytik: Erzeugt hochwertige morphologische Daten, die einen genauen Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Fördert die Kontinuität in der präklinischen Forschung durch eine konsistente Gewebepräparation über verschiedene Arten und Entwicklungsstadien hinweg.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine skalierbare, kostengünstige Methode dar, die auf mehrere Projekte und therapeutische Bereiche anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem der Schnittverlust verringert und die morphologische Integrität verbessert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert das Schneiden durch vereinfalte Ausrüstung und verringerte Abhängigkeit vom Bediener.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem histologische Arbeitsabläufe beschleunigt und Reagenzienverschwendung durch fehlgeschlagene Schnitte reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch zuverlässige histologische Daten für die Zielvalidierung und die sicherheitspharmakologische Bewertung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert grundlegende histologische Kenntnisse sowie Vertrautheit mit der Bedienung eines Mikrotoms und der Paraffineinbettung.
- Benötigt Standardlaborgeräte wie Mikrotom, Ofen und Färbelösungen sowie eine spezielle Acryl-Kammerkonstruktion.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg hinsichtlich Schnittdicke, Temperaturkontrolle und Vorbereitung des Wasserbades, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die gewebespezifische Optimierung der Schneidgeschwindigkeit und Schnittdicke bei unterschiedlichen Probendichten.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die sichere Handhabung von Chloroform während der Montage, die die Nutzung einer Abzugshaube und eine geeignete Belüftung erfordert.
