Name: Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Synergismen zwischen Antikrebs-Antikörpern und Zytostatika in präklinischen Modellen mit der Kombinationsindex-Gleichung nach Chou und Talalay quantitativ bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Optimierung von Krebstherapien.

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Unterstützung gewähren: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, Les Bagouz' À Manon, La Ligue Contre le Cancer Comité de Loire-Atlantique, Comité du Morbihan und Comité de Vendée, Une rose Gießen S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin und la Société Française de Lutte Contre Les Krebsarten et Les Leucémies de l ' Enfant et de L'adolescent (SFCE). M.b. und j. F. werden von La Ligue Contre Le Cancer unterstützt. Die Autoren danken die UTE-Anlage von der Struktur Fédérative de Recherche François Bonamy. Die Autoren danken auch Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) für die Bereitstellung der IMR5 Zellen und Frau H. Estéphan für ihre technische Unterstützung.

Tierhaltung und experimentelle Verfahren wurden von der französischen Regierung (Vereinbarungen #C44-278 und #APAFIS 03479.01) genehmigt. Tierbetreuung und Verfahren wurden unter Richtlinie EU 2010/63/EU und Französisch Gesetz #2013-118 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt.
1. Bewertung der Droge Interaktion zwischen mAb 8B6 und Topotecan In Vitro
<ol><li>96-Well-Probenvorbereitung Achtung: Wenden Sie sich an die Institution Arbeitsschutzausschuss und lokale Vorschriften Regeln im Zusammenhang mit Sicherheit im Labor. Überprüfen Sie die Material- und Sicherheitsdatenblatt Informationen vor der Arbeit mit Medien, Zell-Linien oder Reagenzien. Verwenden Sie korrekten sterilen Technik und arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube. Alle Lösungen/Geräte, die verwendet werden, um Zellen zu manipulieren müssen steril sein. Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die Verwendung mit adhärenten Zellen entwickelt. Änderungen sind erforderlich, um die Methode auf nonadherent Zellen in Suspension wachsen anzuwenden; Dieses Protokoll verwendet für jede Versuchsbedingung vervierfacht.<ol>
<li>Wachsen Sie IMR5 Zellen in einem T75 Kolben.</li>
		<li>Am ersten Tag (Tag 0) beobachten Sie die Zellkultur unter dem Mikroskop, die Zelle Konfluenz zu überprüfen. Aspirieren der Zelle Medium aus der Flasche, waschen Sie es mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 3 mL 0,05 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) / PBS-Lösung. Den Kolben in den Inkubator für 3 min (37 ° C, 5 % CO2) zurück.</li>
		<li>Prüfen der Zellkultur unter dem Mikroskop für Zelle ablösen. Hinweis: Bei Bedarf zurück der Küvette in den Inkubator für eine zusätzliche 3 bis 5 min, je nach Zelltyp Tumor.</li>
		<li>Die Flasche 10 mL Medium vollständige Zelle hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 300 X g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
		<li>Entfernen und entsorgen des Überstands. Die Zelle Pellet in komplette Wachstumsmedium aufzuwirbeln. Die mittlere Lautstärke um eine Endkonzentration von 1 x 105 Zellen/mL zu erhalten.</li>
		<li>Samen 84 Brunnen einer 96-Well-Kultur-Platte mit 104 Zellen jeweils 100 µL Zellsuspension ist. Folgen Sie der experimentellen Layout in Abbildung 2dargestellt.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 18 h in der Zelle-Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Droge-Lösung Hinweis: Für Drogen/mAb Sensibilisierung Studien, ändern Sie das Timing, die Länge und die Konzentration Behandlung entsprechend der bestimmten Medikament/mAb in Frage. Beachten Sie, dass die Ausgangskonzentration 3 x die Endkonzentration.<ol>
<li>Bereiten Sie am nächsten Morgen (Tag 1), die folgenden Medikament Lösungen mit vollständigen Wachstumsmedium.<ol>
<li>
Vorbereitung der mAb-Lösung
			<ol>
<li>Verdünnen Sie mAb in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Antikörper funktionierende Lösung mit einer Konzentration von mAb von 240 µg/mL zu erhalten.</li>
				<li>Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Vorbereitung der Topotecan-Lösung
			<ol>
<li>Verdünnte, als über das Medikament in 500 µL des vollständigen Wachstumsmedium zu einem Medikament funktionierende Lösung mit einer Endkonzentration von 120 nM.</li>
				<li>Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Antikörper und Drogen Vorbereitung der Lösung
			<ol>
<li>Verdünnen Sie die Droge und mAb Lösungen in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Lösung auf 120 nM Drogen- und 240 µg/mL mAb (Arbeitslösung) zu erhalten.</li>
				<li>Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Um die Endkonzentration ankommen, übertragen Sie 50 µL jeder Medikamentenlösung in die entsprechenden Vertiefungen, wie angegeben im experimentellen Layout ( Abbildung 2). Hinweis: Übertragen Sie 50 µL kompletten Wachstumsmedium in den unbehandelten Zellen Vertiefungen, wie in Abbildung 2gezeigt.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 72 h im Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>MTT-assay
	<ol>
<li>Fügen Sie 10 µL MTT Reagenzlösung in jede Vertiefung.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C für 4 h.</li>
		<li>100 µL der Lyse-Lösung (10 % SDS in 0,01 M HCl) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette, und gründlich mischen durch pipettieren.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C für 4 h in eine feuchte Kammer (95 % Feuchtigkeit).</li>
		<li>Lesen Sie die Extinktion bei 570 nm (eine570) und 620 nm (ein620) mit einem Spektralphotometer. Hinweis: Mischen Sie jede Probe wieder durch Pipettieren vor dem Lesen der Extinktion; Extinktion bei 620 nm ermöglicht die Korrektur von unspezifischen Hintergrund Werten.</li>
		<li>Berechnen Sie die korrigierte Extinktion: korrigierte Extinktion = eine570- ein620.</li>
		<li>Die Zellviabilität wie folgt zu berechnen: Zelle überleben = 100 X (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).</li>
		<li>Der Bruchteil betroffen Werte (Fa) unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: 1 - (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).</li>
	</ol></li>
	<li>Droge Interaktion analytische Simulationssoftware für Single und Kombination Medikamentenstudien
	<ol>
<li>Starten Sie die Simulationssoftware um das Startfenster zu öffnen.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Experiment , das Main -Fenster zu öffnen.</li>
		<li>Geben Sie den Namen des Experiments im Fenster " Namen ". Hinweis: Im Fenster " Datum " kann ein Datum hinzugefügt werden.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue einziges Medikament ".</li>
		<li>Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".</li>
		<li>Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .</li>
		<li>Geben Sie das Medikament Konzentration Gerät im Fenster " Einheiten ".</li>
		<li>Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis und Fa Wert, drücken Sie die Eingabetaste.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ".</li>
		<li>Die gleichen Schritte zum mAb-Daten-Punkte eingeben. Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Konzentration Einheit wie durch Medikament verwendet wird.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue Droge-Combo ".</li>
		<li>Wählen Sie Droge und mAb.</li>
		<li>Wählen Sie Konstantes Verhältnis , und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".</li>
		<li>Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .</li>
		<li>Geben Sie das Medikament/mAb-Verhältnis im Verhältnis der Fenster.</li>
		<li>Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis ein und drücken Sie die Eingabetaste. Hinweis: Das Programm berechnet automatisch die Dosen von mAb und Combo.</li>
		<li>Geben Sie die Daten Punkt 1 Fa -Wert, und drücken Sie die Eingabetaste.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " Bericht erstellen ".</li>
		<li>Wählen Sie Medikament und mAb aus, und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Wählen Sie Combo , und klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Header, CI-Tabelleund zusammenfassende Tabelleauswählen. Klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Geben Sie den Dateinamen des Analyse-Datei und klicken Sie auf Speichern , um den Bericht zu generieren. Hinweis: Nach einem Klick auf "OK", wird der Bericht im Standard-Webbrowser des Computers automatisch geöffnet.</li>
		<li>Um den Bericht zu drucken, wählen Sie Drucken aus dem Web-Browser-Menü "Datei". Der Bericht enthält eine Zusammenfassung Tabellenabschnitt, die Titel, Datum, Dateiname, Beschreibung Hinweis, Parameter ("m", "Dm" und "R"), ED50 für entweder Agent verwendet in Monotherapie oder in Kombination und der CI-Tabelle für jede Kombination bei ED50, ED enthält 75, ED90und ED95. Hinweis: Ein CI-Wert von < 1 zeigt Synergismus, CI Wert = 1 bedeutet Additivität und einem CI-Wert von > 1 bedeutet Antagonismus.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Generation des menschlichen Neuroblastoma Xenotransplantate in Nonobese diabetische NOD Scid Gamma Mäuse (NSG Mäuse)
Anmerkung: Ohne jegliche Verunreinigung der Zellkultur. Da die Basalmembran Matrix eine Gel über 5 ° C bildet, sollten alle Cultureware oder Medien kommen in Kontakt mit der Basalmembran Matrix Reagenz prechilled/Eis-kalt sein. Halten Sie die Basalmembran Matrix auf dem Eis während des gesamten Prozesses.
<ol><li>
Vorbereitung der Zellsuspension IMR5
	<ol>
<li>Tauen Sie die Basalmembran Matrix Reagenz über Nacht durch Eintauchen der Durchstechflasche im Eis im Kühlschrank 4 ° C vor dem Gebrauch auf.</li>
		<li>Am Tag 0 ernten Sie die kultivierten IMR5 Zellen wie oben.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen 2 X mit 15 mL eiskaltem PBS und bereiten eine Zellsuspension von 5 x 107 Zellen/mL in eiskaltem PBS. Hinweis: Bei Bedarf übertragen Sie die Zellsuspension zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Schwenken Sie die Basalmembran Matrix Durchstechflasche. Hinweis: Die Basalmembran Matrix Reagenz sollte aufgetaut und zerstreut werden.</li>
		<li>1 Volumenteil Basalmembran Matrix Reagenz und mischen Sie es durch Pipettieren um eine Zellsuspension von 2,5 x 107 Zellen /mL zu erhalten.</li>
		<li>Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Mäuse Hinweis: Die Mäuse sollte sechs bis sieben Wochen alt sein.<ol>
<li>Pflegen Sie Mäuse unter einer bestimmten Bedingung Pathogen-freies.</li>
		<li>Lassen Sie ein drei bis fünf Tagen Eingewöhnungszeit, nachdem die Mäuse angekommen sind.</li>
		<li>Am Tag der Impfung, rasieren die Flanke, wo werden die Injektion (siehe Punkt 2.3.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Tumor Zelle Injektion Hinweis: Halten Sie die eiskalte Basalmembran Matrix Zellsuspension aseptischen während des Verfahrens.<ol>
<li>Mischen Sie die Zellen und ziehen Sie vorsichtig die Zellsuspension in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 21 G montiert.</li>
		<li>Vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen in der Spritze befinden.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.</li>
		<li>Drücken Sie vorsichtig die Maus Haut an der Flanke zwischen den Fingern, an der Injektionsstelle.</li>
		<li>Stechen Sie die Nadel genau in die Hautfalte. Stellen Sie die Nadel nicht tief in das Gewebe um eine subkutane Injektion zu gewährleisten.</li>
		<li>Injizieren Sie 100 µL Zellsuspension IMR5 (d.h., 2,5 x 106 -Zellen) in der unteren rechten Flanke der Mäuse subkutan.</li>
		<li>Drehen Sie die Spritze um auslaufen zu verhindern und ziehen Sie die Nadel heraus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überwachung von Gewichtsveränderungen und Tumorwachstum
	<ol>
<li>Messen Sie die Länge (A) und die Breite (B) des Tumors mit einer Zange.</li>
		<li>Berechnen Sie das Tumorvolumen mit Hilfe der Formel (A x B2) x 0,5.</li>
		<li>Therapie zu beginnen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von ~ 50-60 mm3erreicht haben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Drogen und Antikörper-Verwaltung bei Mäusen
<ol><li>
Die intravenöse Gabe von mAb 8B6
	<ol>
<li>Füllen Sie vorsichtig eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel mit mAb Lösung montiert.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer Wärmelampe für 10 min, die Rute Vene zu dehnen.</li>
		<li>Die Maus in einem Nagetier Restrainer zurückhalten.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.</li>
		<li>Stechen Sie die Nadel parallel zur Rute Vene, durchdringenden 2-4 mm in das Lumen unter Beibehaltung der Schräge der Nadel Gesicht nach oben (Abb. 3A).</li>
		<li>100 µL Antikörper-Lösung intravenös zu injizieren (i.v.).</li>
		<li>Nach Beendigung die Injektion sanft Druck der Injektionsstelle Blutungen zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intraperitoneale Gabe von topotecan
	<ol>
<li>Zeichnen Sie die Wirkstofflösung in eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel montiert.</li>
		<li>Halten Sie die Maus in Rückenlage, mit seinem hinteren Ende leicht erhöht.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.</li>
		<li>Suchen Sie die Maus Bauch Mittellinie und geistig teilen Sie sich den Bauch in Quadranten. Suchen Sie die Injektionsstelle im rechten oder linken unteren Quadranten (Abb. 3 b).</li>
		<li>Stechen Sie die Nadel in die Bauchhöhle (5 mm tief) in ~ 10°-Winkel, im rechten oder linken unteren Quadranten.</li>
		<li>100 µL Medikamentenlösung intraperitoneale Injektion (i.p.).</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Impfung-Website.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
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<li>Zahreddine, H., Borden, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+insights+into+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and insights into drug resistance in cancer.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 28(2013).</li>
<li>Martin, T. P., Baguley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re%3A+%22Postoperative+validation+of+bone-anchored+implants+in+the+single-sided+deafness+population.%22+Snapp+et+al.+Otol+Neurotol+2012%3A+33%3B291-6%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).</li>
<li>Choi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+lung+cancer+cells+by+altered+dimerization+of+HSP27%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27.</a> Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).</li>
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<li>Retter, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+proapoptotic+antiganglioside+GM2+monoclonal+antibody+and+evaluation+of+its+therapeutic+effect+on+melanoma+and+small+cell+lung+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts.</a> Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).</li>
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</ol>

S.Fa., j.f. und S.B. werden als Erfinder des angemeldeten Patenten für die klinische Anwendung von therapeutischen Antikörpern Anti-O-Acetyl-GD2 bezeichnet.

Um die Auswirkungen von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten vorherzusagen, drei Methoden können verwendet werden: die Isobologram Methodik17, nichtlineare Mischung Modell18und die Kombination index1. Indexanalyse Kombination wird am häufigsten verwendet, da seine Anwendung durch die Verfügbarkeit eines benutzerfreundlichen Computerprogramms vereinfacht wird. Zu diesem Zweck gekennzeichnet wir zuerst die Dosis-Wirkungs-Antwort von jeder Agent ve...

Der konventionelle Ansatz bei der Behandlung einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Krebs beruhte auf Monotherapie. Auch wenn es noch in vielen Fällen verwendet wird, erfüllt diese Methode mehrere Hindernisse zu entscheiden sich für kombinierte Therapien2. Insbesondere sind Krebszellen anfälliger für Widerstand, wenn ein einzelnes Medikament behandelt, durch Induktion alternative überleben Mechanismen3, was zu therapeutischen Scheitern in Patienten4zu entwickeln. Darüber hinaus werden in Monotherapie, Medikamente in der Regel in einer hohen Dosis verwaltet. Diese Situation oft führt das Auftreten von starken dosisabhängige Nebenwirkungen, die Ärzte die Behandlung2stoppen erzwingen und unerträglich werden können. Aus diesen Gründen ist der Verband der Anti-Krebs-Moleküle nun lieber Monotherapie.
Ideale Wirkstoffkombinationen wäre diejenigen, die in Synergie gegen Tumorzellen, ohne erhöhte Toxizität gegen normale Zellen handeln. Synergismus bezieht sich auf die Interaktion von zwei oder mehr Medikamenten, die eine therapeutische Wirkung mehr als die Summe jedes einzelne Medikament handeln separat produziert. Solche Interaktionen können erweiterte klinische therapeutische Wirksamkeit2führen. Es begrenzt Therapieresistenz, erhöht die Wirksamkeit und Toxizität2auch verringern kann. In der Tat kann die Dosierung der einzelnen Drogen reduziert werden, um ihre Nebenwirkungen zu senken, indem Sie auf verschiedenen Wegen. Darüber hinaus kann eines der Moleküle auch als eine sensibilisierende Mittel gegen Krebszellen dienen. Die Wirkung des zweiten Medikaments kann auf sensibilisierte Zellen verstärkt werden und weniger Dosierungen können gebrauchte5.
Kombinierte Therapie kann zwei oder mehrere Chemotherapeutika und/oder Biologics wie monoklonale Antikörper6enthalten. Diese mAbs gezielt Zellen mit dem Ausdruck einer Zelle Oberflächenantigen von Interesse und sind in der Lage, Tumorzellen durch immunologische Wege einschließlich Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC), töten unter Einbeziehung der immun Effektorzellen 7und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC)6. Sie können auch über einen nicht-immunologischen Mechanismus vermittelt durch Apoptose8,9,10,11agieren. In diesem Fall kann die Induktion des Prozesses des programmierten Zelltods Krebszellen zu sensibilisieren, Schwächen ihre Funktion und der damit verbundenen Chemotherapeutikum mit einer niedrigeren Dosierung effektiver zu gestalten. Als solche Proapoptotic mAb sind gute Kandidaten für die Gestaltung von Kombination Therapien mit Zytostatika.
Verschiedene mathematische Modelle sind beschrieben worden, um Droge Synergismus zu beurteilen; eine davon basiert auf der Kombination Index Methode1. Diese Methode basiert auf dem Median-Wirkung-Prinzip von Chou1entwickelt. Die Median-Effekt-Gleichung korreliert die Medikamentendosis und Drogenwirkung wie folgt.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg">
Dabei ist D die Medikamentendosis; DM ist die Median-Effekt-Dosis; FA ist der Bruchteil der Dosis davon betroffen; m ist ein Exponent, die die Form der Dosis-Wirkungs-Plot-1bedeutet. Die Median-Effekt-Dosis wird verwendet, um die Dosis Dx eines Medikaments zu berechnen, die hemmt oder tötet "X" Prozent der Zellen. Der CI-Wert errechnet dann um die additive Wirkung der Droge Kombination,1folgendermaßen zu bewerten.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;">
CI der Wert 1 gibt an, eine additive Wirkung und einem CI-Wert von &lt; 1 zeigt einen synergistischen Effekt, während ein CI-Wert von &gt; 1 zeigt Antagonismus1. Die Anwendung dieser Methode wird weiter durch die Verfügbarkeit eines Computerprogramms, CompuSyn, die bestimmt Synergismus und Antagonismus bei allen Dosen erleichtert oder Effektstufen simulierte automatisch12.
Unsere Gruppe entwickelt die mAb 8B6 speziell für O-Acetyl-GD2 Gangliosid (OAcGD2) Neuroblastom Antigen13 und weiter gezeigt, dass diese mAb Zelltod mit Attributen der Apoptose11induzieren kann. Um zu testen ob mAb 8B6 Neuroblastom-Zellen, die antineoplastische Agenten Topotecan sensibilisieren können, haben wir die oben genannten Methode, entwickelt von Chou1angepasst. Zunächst bestimmen wir die wirksame Dosis 50 (ED50) Werte der mAb 8B6 und Topotecan. Als nächstes sind die Neuroblastom-Zellen mit zwar Verhältnisse der beiden Wirkstoffe basierend auf ED50 Werte ausgesetzt, um die CI-Werte mit den oben genannten Simulations-Software zu ermitteln. Diese Methode ermöglicht uns, Synergien zwischen mAb 8B6 und Topotecan in Vitrozu demonstrieren. Wir beschreiben Sie anschließend ein Protokoll, um weiter die Wirksamkeit und die Sicherheit dieser Kombination Therapie in Vivozu beurteilen. Dieses Protokoll kann leicht angewendet werden, um starke und sichere Anti-Krebs-mAb und Chemotherapeutikum Kombinationen in präklinischen Studien auszuwählen. Eine schematische Darstellung dieser Studie ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

<table><tbody><tr><td>Cell Proliferation Kit (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>CompuSyn Software</td><td>ComboSyn</td><td></td><td>Combosyn kann kostenlos heruntergeladen werden bei http://www.combosyn.com</td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox&nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox kann kostenlos heruntergeladen werden unter http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Wärmelampe</td><td>Verre& Quarz</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>IMR-5-Zelllinie für humanes Neuroblastom</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 ist ein Klon der humanen Neuroblastom-Zelllinie IMR32 5459762. IMR-5-Zellen wurden großzügig von Dr. Santos Susin (U.872, Paris, Frankreich) zur Verfügung</td></tr> <tr><td>gestellt.L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Lyselösung&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>Universität Nantes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>Nadel 21G 1 &frac12; &nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Needle 25G 1</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>NSG Mäuse</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well-Mikrotiterplatten</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC, der läuft Windows 7</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 kann bei http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 erworben werden</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>Nagetier-Zurückhalter</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

potenzierung der anti-krebs-antikörper-wirksamkeit von zytostatika: nachweis von antikörper-wirkstoff-synergismus mit der kombination-index-gleichung

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potenzierung der feindlichen monoklonaler Antikörper (mAb) durch Chemotherapeutika stellt eine sinnvolle Strategie für die Gestaltung effektiver und sicherer Therapie gegen Krebs. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine vernünftige Kombination in der präklinischen Phase zu identifizieren. Zunächst beschreiben wir eine zellbasierte Assays um den Synergismus zwischen Anti-Krebs-mAb und Zytostatika, zu beurteilen, der die Kombination Index Gleichsetzung von Chou und Talalay1verwendet. Dazu gehören die Messung des Tumor Zelle Droge - und Antikörper-Empfindlichkeit mit einem MTT-Assay, gefolgt von einer automatisierten Computeranalyse die Kombination Index (CI) Werte berechnen. CI-Werte der < 1 Synergismus zwischen getesteten mAbs und Zytostatika1anzugeben. Um die in-vitro- Ergebnisse in Vivobestätigen, beschreiben wir weiter eine Methode zur Bestimmung der Kombination Therapie Wirksamkeit in einem Xenograft-Tumor-Modell. In diesem Modell verzögert die kombinierte Therapie deutlich Tumorwachstum, führt zu einer erweiterten signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zu Single-Agent-Steuerelemente. Wichtig ist, zeigt der in-Vivo -Experimente, dass die Kombinationstherapie gut vertragen wird. Dieses Protokoll ermöglicht die effektive Bewertung der Anti-Krebs-Medikamenten-Kombinationen in präklinischen Modellen und die Identifizierung von rationalen Kombination, in klinischen Studien zu bewerten.

Die repräsentative Ergebnisse und Zahlen werden mit freundlicher Genehmigung von früher veröffentlichten Arbeit14angepasst.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 fördert synergistisch hemmende Effekte von Topotecan auf Neuroblastom Zellwachstum Linie:
Herstellen der Droge und die Antikörper-Konzentrationen verwendet werden, für die Beurteilung de...

Dieses Protokoll beschreibt die Synergien zwischen einem Anti-Krebs-Antikörper und Zytostatika in präklinischen Modellen zu bewerten, indem Sie unter Verwendung der Kombination Index Gleichung von Chou und Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Immuntherapie in Kombination mit Chemotherapie stellt einen innovativen Ansatz zur Entwicklung einer effizienten Therapie bei Krebs dar. Die Hauptziele sind, synergistische, therapeutische Effekte, Dosis- und Toxizitätsreduktion zu erreichen und die Induktion von Arzneimittelresistenzen zu minimieren oder zu verzögern. Aus praktischen und ethischen Gründen ist es jedoch nicht möglich, Synergismus bei Patienten zu bestimmen. Daher sollten vor der direkten Kombination in klinischen Studien Prenicaptor-Kombinationsstudien in vitro und/oder bei Tieren durchgeführt werden, um die Gründe für klinische Studien zu erhalten. Eine einfache robuste Methode zur Quantifizierung des Synergismus zwischen Medikamenten basiert auf einer von Shouan Talale entwickelten Kombinationsindexgleichung, wie in diesem Video dargestellt. Mit dieser Methode und ihrer computergestützten Simulation belegen wir hier den Synergismus zwischen monoklonalem Antikörper 8B6, der spezifisch für das O-Acetyl-GD2 Gangliosid-Neuroblastom-Antigen und das Chemotherapeutikum Topotecan auf Neuroblastomzellen ist. Kurz, nach der Bestimmung der effektiven Dosis 50 Werte jeder Verbindung in der menschlichen IMO, 5 Neuroblastom-Zelllinie, wurden diese Zellen mit gerechten Verhältnissen der beiden Verbindungen intubiert, und die Kombinationsindexwerte wurden mit hilfe einer automatisierten Computersimulation berechnet. Als nächstes bestätigten wir diese Ergebnisse in Vivo, in einem IMO, 5 Tumor xenographed Modell. Wir bauten IMR-5-Zellen in einem T75-Kolben an, beobachteten sie unter dem Mikroskop, um die Zellkonfluenknz zu überprüfen. Asperate Zellmedium aus dem Kolben, mit 5 ml PBS waschen. Fügen Sie 3 ml 0,05%EDTA/PBS-Lösung hinzu. Geben Sie den Kolben für 3 Minuten zum Inkubator zurück. Untersuchen Sie die Zellkultur unter dem Mikroskop auf Zellablösung. Fügen Sie dem Kolben 10 ml komplettes Zellmedium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles, 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300 g.Count-Zellen mit einem Hämozytometer. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Re suspend Zellen in Complete Growth Medium.Anpassen des mittleren Volumens, um eine endgültige Konzentration von 100, 000 Zellen/ml.Seed 84 Brunnen, 96 Brunnenkulturplatte mit je 10.000 Zellen zu erhalten, was 100 Mikroliter Zellsuspension ist. Inkubieren Sie Zellen für 18 Stunden im Cell Incubator.Dilute monoklonalen Antikörper in 500 Mikroliter Complete Growth Medium, um eine Antikörper-Arbeitslösung mit einer monoklonalen Antikörperkonzentration von 240 Mikrogramm pro ml zu erhalten. Führen Sie 5 zweifache serielle Wahnvorstellungen durch, wie im Protokoll angegeben. Verdünnen Sie das Medikament in 500 Mikroliter Complete Growth Medium, um eine medikamentöse Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von 120 Nanomolar zu erhalten. Führen Sie 5, zweifache serielle Wahnvorstellungen durch, wie im Protokoll angegeben. Verdünnen Sie auf die gleiche Weise das Medikament plus monoklonale Anikörper Lösungen. Um zur endgültigen Konzentration zu gelangen, übertragen Sie 50 Mikroliter jeder Wirkstofflösung in die entsprechenden Brunnen, wie auf diesem experimentellen Layout gezeigt. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang im Inkubator. Fügen Sie 10 Mikroliter MTT-Reagenzlösung in jeden Brunnen ein. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden. Fügen Sie 100 Mikroliter Lycine-Lösung in jeden Brunnen mit einer Mehrkanal-Pipette und mischen Sie gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden in einer befeuchteten Kammer. Befreien Sie die Absorber mit einem Spektralphotometer auf 570 und 620 Nanometern. Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit wie folgt. Berechnen Sie die beeinflussten Werte des Bruchs mit der folgenden Gleichung. Führen Sie die Simulationssoftware aus, klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche, um das Hauptfenster zu erhalten. Geben Sie den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf neue einzelne Droge. Geben Sie den Namen ein. Geben Sie die Abkürzung ein. Geben Sie die Arzneimittelkonzentrationseinheit ein. Geben Sie Daten 1 Dosis und FA-Wert ein. Drücken Sie Enter.Repeat diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingegeben sind. Klicken Sie auf Fertig.Folgen Sie den gleichen Schritten, um monoklonale Antikörperdatenpunkte einzugeben. Klicken Sie auf Neue Droge Combo.Select Medikament und monoklonale Antikörper. Wählen Sie Konstantes Verhältnis.Klicken Sie auf OK. Geben Sie den Namen ein. Geben Sie die Abkürzung ein. Geben Sie das monoklonale Antikörperverhältnis des Arzneimittels ein. Geben Sie Daten 1 Dosis ein. Drücken Sie Enter.Das Programm berechnet automatisch die Dosen von Monoklonal Antikörper 8B6 und Combo. Geben Sie daten 1 ANLAGENwert ein.Drücken Sie Enter.Repeat diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingegeben sind. Klicken Sie auf Fertig.Dann klicken Sie auf Bericht generieren.Wählen Sie Das Medikament und den monoklonalen Antikörper aus und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Combo und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Kopf-, CI-Tabelle und Zusammenfassungstabelle aus, und klicken Sie dann auf OK. Geben Sie den Dateinamen und die Analyse ein, und klicken Sie auf Speichern, um den Bericht zu generieren. Der Bericht wird automatisch im Standard-Webbrowser geöffnet. Der Bericht enthält einen zusammenfassenden Tabellenabschnitt, der Titel, Datum, endgültigen Namen, Beschreibungshinweis, m- und r-Parameter, effektive Dosis 50 für entweder als Monotherapie oder in Kombination verwendete Wirkstoff enthält, und die Kombinationsindextabelle für jede Kombination mit der effektiven Dosis 50, 75, 90 und 95.A-Kombinationsindexwert kleiner als 1 gibt Synergismus an. Ein Wert, der gleich eins ist, gibt die Additivität an. Ein Wert größer als 1 gibt an den Antagonismus an. Kellermembranmatrix über Nacht auftauen, indem Sie die Durchstechflasche vor Gebrauch in einen 4-Grad-C-Kühlschrank tauchen. Alle Kulturverschleiß oder Medien, die mit der Kellermembran-Metrik in Berührung kommen, sollten vorgechillt werden. Ernte die Kultur IMR5. Übertragen Sie die Zellen 5 Minuten lang in ein 15 ml konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 300 g. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie Zellen mit 15 ml eiskaltem PBS zweimal. Bereiten Sie eine Zellsuspension für 5 Millionen Zellen pro ml in eiskaltem PBS vor. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 ml Mikrorohr. Schwenkbare Kellermembran Matrix durchfläge. Fügen Sie 1 Volumen des Kellermembran-Matrix-Reagenzes hinzu, das durch Pipettieren gemischt wird, um eine Zellsuspension von 2,5 Millionen Zellen pro ml zu erhalten. Rasieren Sie die Flanke, wo die Injektion durchgeführt wird. Mischen Sie Zellen und ziehen Sie die Zellsuspension vorsichtig in eine 1 ml Spritze, die mit einer 21 g Nadel montiert ist. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden. Desinfizieren Sie den Impfbereich der Mäuse mit einer antiseptischen Lösung. Drücken Sie die Maushaut vorsichtig auf die Flanke zwischen den Fingern an der Injektionsstelle. Setzen Sie die Nadel genau in die Hautfalte ein. Legen Sie die Nadel nicht tief in das Gewebe, um eine subkutane Injektion zu versichern. 100 Mikroliter IMR5-Zellsuspension subkutan injizieren. Drehen Sie die Spritze, um eine Flüssigkeitsausbreitung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel ab. Überwachen Sie Mäuse auf Körpergewicht und Tumorwachstum. Messen Sie die Länge und Breite des Tumors mit einem Kaliber. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit dieser Formel. Beginnen Sie mit der Therapie, wenn Tumore ein durchschnittsvolumen von 50 bis 60 mm erreicht haben

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

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