Herstellung von refraktiven Index passende Geräte für biomedizinische Mikrofluidik

Diese Methode kann dazu beitragen, eine wichtige Herausforderung bei der Kombination von Mikroskopie und Mikrofluidik zu lösen, indem sie die Anpassung des Brechungsindex zwischen der Mikrokanalstruktur und den wässrigen Medien im Kanal ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit Herstellungsmethoden kompatibel ist, die üblicherweise zur Herstellung mikrofluidischer Geräte verwendet werden. Ein weiterer wesentlicher Vorteil unseres Ansatzes ist die Methode zur Abdichtung von Mikrokanälen aus Materialien mit geringer Adhäsion, die ein häufiges Problem bei Polymeren mit gut brechendem Index darstellt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Schritte zum Abdichten des Kanals richtig zu machen. So ist es beispielsweise wichtig, dass die Behälter beim Spannen frei sind. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung von Polydimethylsiloxan oder PDMS, negativ, wie im Textprotokoll beschrieben.

Füllen Sie dann das PDMS-Negativ mit 400 Mikrolitern MY-133-V-2000. Das Negativ muss leicht überfüllt sein. Legen Sie das mit MY-133-V-2000 gefüllte PDMS-Negativ für zwei Stunden in die Vakuumkammer, um alle Blasen zu entfernen.

Nachdem Sie das MY-133-V-2000 aus der Vakuumkammer genommen haben, drücken Sie einen Objektträger gegen die Oberseite des leicht überfüllten Negativs, um eine ebene Oberfläche von MY-133-V-2000 zu erzeugen und zu verhindern, dass Sauerstoff die Polymerisation hemmt. Setzen Sie anschließend den MY-133-V-2000 in einen 400-Watt-UV-Ofen ein. Stellen Sie die UV-Strahlung 300 Sekunden lang auf 50 % der maximalen Intensität ein, um den Mikrokanal auszuhärten.

Dies entspricht einer Leistung von etwa 4,5 Joule pro Quadratzentimeter, was in etwa dem Doppelten der vom Hersteller empfohlenen Mindestaushärtungsleistung entspricht. Nachdem Sie das Acryl wie im Textprotokoll beschrieben geschnitten haben, geben Sie zwei kleine Tropfen auf den Rand des Acryls und verteilen Sie dann mit einem Einwegwerkzeug den Kleber gleichmäßig. Legen Sie das Glassubstrat auf das Acryl und lassen Sie den Kleber trocknen, indem Sie das Gewicht des Glases verwenden, um ihn an Ort und Stelle zu halten.

Beschichten Sie das freiliegende Glas mit 100 Mikrolitern PDMS unter Verwendung einer Verdrängerpipette. Legen Sie dann die Basisschicht in einen Vakuum-Schleudercoater ein, um das Glas zwei Minuten lang gleichmäßig mit einer etwa 10 Mikrometer dicken PDMS-Folie bei einer Geschwindigkeit von 1500 U/min zu beschichten. Entfernen Sie die Basisschicht aus dem Schleuderlack und wischen Sie vorsichtig überschüssiges PDMS ab, das das Acryl mit Aceton und Papiertuch beschichtet hat.

Achten Sie darauf, das nicht ausgehärtete PDMS nicht zu stören. Backen Sie nun die Basisschicht mit dem PDMS im Ofen bei 65 Grad Celsius für zwei Stunden, um das PDMS auszuhärten. Pipettieren Sie einen Milliliter PDMS auf einen Objektträger und verwenden Sie dann einen anderen Objektträger, um das PDMS gleichmäßig zu verteilen, bis es an den Seiten herauszuquillen beginnt.

Härten Sie dies auf einer heißen Platte bei 150 Grad Celsius 10 Minuten lang aus. Schneiden Sie das ausgehärtete PDMS in ein Rechteck mit den gleichen Abmessungen wie das Gerät MY-133-V-2000. Stanzen Sie dann die mittlere Schicht des Acryls als Form in die Löcher für das Reservoir und schneiden Sie ein quadratisches Sichtfenster in das PDMS, um die PDMS-Dichtung herzustellen.

Nehmen Sie nun den ausgehärteten MY-133-V-2000 aus dem UV-Ofen, entfernen Sie den Kanal vom Negativ und legen Sie ihn mit der Kanalseite nach oben auf ein flaches Substrat. Entfernen Sie die Basisschicht mit dem ausgehärteten PDMS aus dem 65-Grad-Ofen und legen Sie sie auf den Untergrund. Legen Sie dann das Substrat sowohl mit dem MY-133-V-2000-Kanal als auch mit der Basisschicht in den Sauerstoffplasmareiniger

Stellen Sie den Vakuumdruck auf 200 Millitorr und den Radiofrequenzpegel auf hoch ein. Fahren Sie mit der Oberflächenbehandlung des Kanals und des Glassubstrats für 30 Sekunden fort. Das Sauerstoffplasma sollte blau leuchten, wenn der Plasmareiniger eingeschaltet wird.

Entfernen Sie nach 30 Sekunden sowohl den Mikrokanal als auch die Basisschicht aus dem Plasmareiniger. Platzieren Sie den MY-133-V-2000 sofort mit einer Pinzette mit der Kanalseite nach unten in den rechteckigen Ausschnitt der Basisschicht Acryl, so dass er das PDMS berührt. Platzieren Sie nun die PDMS-Dichtung auf dem MY-133-V-2000-Gerät, und richten Sie die Löcher in der Dichtung mit den Behältern im Gerät aus.

Die Verwendung dieser PDMS-Dichtung ist von entscheidender Bedeutung, da PDMS elastischer ist als MY-133-V-2000 und daher stärker komprimiert werden kann. Dadurch kann die Kraft vom Acryl auf den Mikrokanal übertragen werden, ohne dass das Glas zerbricht. Stellen Sie an dieser Stelle das unfertige Gerät auf eine erhöhte Plattform über der Bank, um eine Klemmfläche für die Montage der Vorrichtung zu schaffen.

Extrahieren Sie dann drei Milliliter Acrylzement mit einer Spritze. Verteilen Sie genügend Acrylkleber auf der Basisschicht, um eine dünne Beschichtung zu erhalten. Machen Sie die Beschichtung so gleichmäßig wie möglich und lassen Sie das Material nicht in die Rinne sickern.

Lege nun das Acrylstück der mittleren Schicht auf die Basisschicht Acryl. Stellen Sie sicher, dass die Löcher mit den Behältern des MY-133-V-2000-Kanals ausgerichtet sind. Klemmen Sie die mittlere Schicht so fest wie möglich auf die Basisschicht und halten Sie sie zwei Minuten lang, während der Zement aushärtet, um die Acrylstücke miteinander zu verbinden.

Stellen Sie sicher, dass die Behälter während dieses Schritts nicht verstopft sind, um zu verhindern, dass Luft unter dem MY-133-V-2000-Gerät eingeschlossen wird. Lufteinschlüsse zwischen dem MY-133-V-2000 und dem Substrat bleiben eingeschlossen, wenn die Behälter verstopft sind. Dies führt zu Undichtigkeiten im fertigen Gerät.

Daher ist es wichtig, dass die Löcher während dieses Schritts nicht verstopft werden. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, nehmen Sie den Druck vom Gerät. Platzieren Sie den Acrylzement auf der Mittelschicht an den Stellen, an denen der Kontakt mit der obersten Schicht des Acryls zu erwarten ist.

Lege nun die oberste Schicht des Acryls auf das mittlere Schichtstück des Acryls und achte darauf, dass die Löcher mit den Reservoirs ausgerichtet sind. Lassen Sie es zwei Minuten auf der Bank ruhen, während der Acrylzement trocknet. Testen Sie das MY-133-V-2000-Gerät, indem Sie 10 Mikroliter Lebensmittelfarbe oder entionisiertes Wasser in eines der Reservoirlöcher geben, um die Haftung und den Fluss zu testen.

Führen Sie einen Schlauch in den gegenüberliegenden Behälter ein und verbinden Sie das andere Ende mit einer Vakuumfalle. Schalten Sie das Vakuum ein, um den Farbstoff oder das Wasser durch den Kanal zu ziehen und sicherzustellen, dass ein erfolgreiches Gerät erstellt wurde. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob der Kanal oder das Reservoir undicht ist.

Entfernen Sie mit dem Vakuum den Farbstoff aus beiden Behältern. Spülen Sie dann die Behälter mit Ethanol aus. Geben Sie das Ethanol in einen Behälter.

Ziehen Sie das Ethanol mit dem Vakuum durch. Lassen Sie das Ethanol 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Besprühen Sie den Kanal gründlich mit Ethanol und geben Sie ihn in eine sterile Styroporschale.

Wickeln Sie es fest mit Parafilm ein und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf. Die hier gezeigte Heatmap stellt die Masse der FOD-adhärenten MCF-7-Zellen in einem Mikrokanal dar. In der Nähe der Wände des Mikrokanals sind nur wenige Artefakte sichtbar.

Bei dieser Messung ist eine einzelne ADERENT MCF-7-Zelle am Rand des Mikrokanals neben der Wand zu sehen. Das Fehlen von Artefakten in der Nähe der Wand ermöglicht es, präzise quantitative Messungen zu erhalten, selbst wenn sich die Zellen in unmittelbarer Nähe der Kanalwand befinden. Diese letzte Abbildung zeigt ein Paar MCF-7-Zellen, die in der Nähe der Mikrokanalwand sitzen.

Die Masse dieser Zellen an jedem Pixel kann mit Hilfe der quantitativen Phasenmikroskopie präzise gemessen werden. Während Sie dieses Protokoll befolgen, ist es wichtig, die Behälter nicht zu verstopfen, wenn Sie das Gerät festklemmen, während der Acrylzement trocknet. Durch das Verstopfen der Löcher wird Luft zwischen dem MY-133-V-2000 und dem Substrat eingeschlossen.

Dies führt während des Durchflusses zu Undichtigkeiten im Kanal. Die Verwendung von MY-133-V-2000 als Herstellungsmaterial für mikrofluidische Bauelemente bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Materialien, da Artefakte in der Nähe von Mikrokanalwänden erheblich reduziert werden. Dies ermöglicht quantitative Messungen in unmittelbarer Nähe von Mikrokanalstrukturen.

Geräte, die mit diesem Protokoll hergestellt werden, sind mit allen gängigen Mikroskopietechniken kompatibel. Dieses Protokoll basiert auf der Zellpathologie und ist daher mit anderen fortschrittlichen mikrofluidischen Techniken wie Zellsortierern oder Gradientengeneratoren zur Untersuchung des Zellverhaltens kompatibel. Insgesamt gibt diese Technik den Forschern ein neues Werkzeug für biomedizinische mikrofluidische Assays an die Hand, die auf Mikroskopie basieren.

Die zusätzliche Präzision, die es für quantitative Messungen in Mikrokanälen bietet, hat wichtige Anwendungen in vielen Bereichen, einschließlich der Wirkstoffforschung und der Einzelzellanalyse.