Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen
19. November 2018
Wir beschreiben ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildgebung und ein maschinelles lernen-Algorithmus. Messungen der 3D Brechungsindex Schichtbilder von Lymphozyten präsentieren 3D morphologische und biochemische Informationen für einzelne Zellen, die dann mit einem Computerlernen Algorithmus zur Identifizierung von Zelltypen analysiert wird.
Diese Methode bietet eine Alternative zur herkömmlichen Fluoreszenzkennzeichnung und dem Prozess der Durchflusszytometrie, die zeitaufwändig, kostspielig und das Risiko einer Änderung der zellulären Funktion der Proben darstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die dreidimensionale Refractive Index Tomographie und maschinelles Lernen sind etikettenfreie und quantitative Methoden, die eine schnelle und genaue Lymphozytenidentifikation ermöglichen. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Blutkrebs und Autoimmunerkrankungen, da die Identifizierung von Lymphozyten für die Diagnose von Krankheiten und die angemessene Anwendung der Behandlung von entscheidender Bedeutung sein kann.
Obwohl diese Methode Einblick in Lymphozytenpopulationen geben kann, kann sie auch auf die Analyse anderer einzelner Voninteresseer Zellen, einschließlich Bakterien, angewendet werden. Die visuelle Demonstration der quantitativen 3D-Phasenbildgebungstechnologie ist von entscheidender Bedeutung, da sie eine klare Anleitung zur Ausführung der Technik ermöglicht und Einblicke in ihre Anwendungen geben kann. Beginnen Sie mit dem Sammeln jeder Lymphozyten-Submenge durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung.
Für eine optimale Bildgebung verdünnen Sie jede Zellprobe auf eine Konzentration von 180 Zellen pro Mikroliter RPMI-Medium und injizieren Sie langsam 120 Mikroliter der ersten verdünnten Probe in eine Bildkammer. Nachdem Sie einen Mangel an Blasen in der Kammer bestätigt haben, legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse eines 3D-quantitativen Phasenmikroskops und legen Sie die Bildkammer auf die Übersetzungsstufe des Mikroskops. Passen Sie die Stufe so an, dass die Probe an der Objektivlinse ausgerichtet ist, und klicken Sie auf Fokus und Oberfläche in der Kalibrierungsregisterkarte der Mikroskopperspektive der Bildgebungssoftware, um die axialen Positionen der Objektiv- bzw. Kondensatorlinsen anzupassen.
Klicken Sie auf Auto-Modus, um die Objektiv- und Kondensatorlinsen auszurichten. Um die Ausrichtung zu optimieren, öffnen Sie den Scanmodus, und passen Sie die Linsen manuell an, um das digitale Mikrospiegel-Gerätemuster an der Mitte auszurichten. Kehren Sie dann in den Modus Normal zurück, und passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Zelle im Sichtfeld zu finden.
Passen Sie die axiale Position der Objektivlinse an, um die Brennebene zu finden, bis die im Bildschirm visualisierte Probengrenze fast unsichtbar ist. Es ist wichtig, den Fokus der Zelle perfekt einzustellen, um ein optimales 3DRI-Tomogramm zu erzeugen. Wenn das Bild nicht richtig aufgenommen wird, wird die 3D-Rekonstruktion beeinträchtigt, was zu einem lauten Tomogramm führt.
Passen Sie die Übersetzungsstufe an, um eine Position ohne Zelle zu finden, und klicken Sie auf Kalibrieren, um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu messen. Passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Zelle in der Mitte des Sichtfelds zu finden. Und benennen Sie unter der Registerkarte "Anschaffung" das abbildende Beispiel.
Klicken Sie auf 3D-Snapshot, um die Hologramme der Zelle mit den gleichen Beleuchtungswinkeln wie bei den gerade gemessenen 2D-Hologrammen zu messen. Wenn die erfassten Daten im Datenverwaltungsfenster angezeigt werden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Prozess, um ein 3D-Refractive-Indextomogramm aus den 2D-Hologrammen mithilfe des in der Bildverarbeitungssoftware implementierten Defraktionstomographiealgorithmus zu rekonstruieren. Klicken Sie nach der Abbildung im Bedienfeld Datenmanagement mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Öffnen, um die Daten zu visualisieren.
Klicken Sie auf die Mitte der Zelle, um sie neu zu positionieren, und klicken Sie im Bedienfeld "Daten-Manager" auf RI Tomogramm. Klicken Sie auf der Registerkarte Voreinstellung auf Laden und doppelklicken Sie auf Lymphozyte. xml, eine vordefinierte Übertragungsfunktion, die von der Imaging-Software zur Visualisierung des Tomogramms gemäß den 3DRI-Verteilungen bereitgestellt wird.
Scrollen Sie mit der Maus, um zu vergrößern, und ziehen Sie die Zelle, um sie in eine beliebige Richtung zu drehen. Für quantitative morphologische und biochemische Merkmalsextraktion platzieren Sie alle tomographischen Daten in einem einzigen Ordner und teilen Sie die Zelltypen in einzelne Unterordner im Hauptordner auf. Öffnen Sie als Nächstes die zusätzliche Feature-Extraktionsdatei in der entsprechenden Bildverarbeitungssoftware, und bearbeiten Sie Zeile 14, um den Tomogrammordner anzugeben, aus dem die Daten extrahiert werden sollen.
Bearbeiten Sie Zeile 15, um den Ordner festzulegen, in dem die extrahierten Feature-Daten gespeichert werden sollen, und führen Sie den Code aus. Für jedes Tomogramm im Dataset berechnet der Code die Oberfläche, das Zellvolumen, die Sphärizität, die Proteindichte und die Trockenmasse pro Brechungsindexschwelle. Verwenden Sie für das überwachte Lernen und die Identifizierung den einfachen Zufallssplitting-Algorithmus in MATLAB, um die extrahierten Feature-Daten nach dem Zufallsprinzip in separate Trainings- und Testsatzordner aufzuteilen.
Öffnen Sie die Zusatztrainingsdatei, und bearbeiten Sie Zeile 14, um den Schulungssatzordner, Zeile 16 zum Speichern des trainierten Klassifiierers und Zeile 17 zum Festlegen eines Dateinamens für den Klassifier festzulegen. Führen Sie dann den Code aus. Mithilfe der ausgewählten Features des Trainingssatzes trainiert der Code einen Klassifier mit dem K-Nächstenalgorithmus und speichert den Klassifier im angegebenen Ordner.
Öffnen Sie anschließend die zusätzliche Testdatei drei, und bearbeiten Sie die Zeilen 14 bis 15, um den zu testenden trainierten Klassifier und Zeile 17 zum Festlegen des trainierten Testsatzes anzugeben. Führen Sie dann den Code aus. Der Klassifier identifiziert die Zelltypen der einzelnen Lymphozyten im Testsatz.
Hier werden repräsentative 3D-gerenderte Brechungsindex-Tomogramme von B-Lymphozyten, CD4-positiven T-Lymphozyten und CD8-positiven T-Lymphozyten mit unterschiedlichen Farbschemata gezeigt, die gemäß den über die Bildgebungssoftware zugewiesenen Brechungsindexwerten zugeordnet sind. Aus den Brechungsindexwerten können quantitative morphologische und biochemische Merkmale berechnet werden. In diesem Experiment betrug die Genauigkeit der T- und B-Lymphozytenklassifikation 93,15 % bzw. 89,81 % für die Trainings- und Testfälle.
Die CD4-positiven und CD8-positiven T-Lymphozyten wurden statistisch klassifiziert, und die Genauigkeit betrug 87,41 % bzw. 84,38 % für die Trainings- und Testsätze. Schließlich betrug die Genauigkeit des mehrklassigen Zelltypklassifiers 80,65 % bzw. 75,93 % für die Trainings- und Testphasen. Die Qualität und Anzahl der Bilder ist entscheidend für den Erfolg dieser Technik.
Je besser die Bildqualität und je höher das Datenvolumen, desto besser ist die Genauigkeit der Identifikation. Deep Learning kann verwendet werden, um die komplexen Daten der Tomogramme vollständiger zu analysieren und so die Identifikationsleistung zu verbessern. Darüber hinaus können Fluoreszenz und 3D-quantitative Phasenbildgebung verwendet werden, um den Weg der physiologischen Rollen der identifizierten Lymphozyten zu untersuchen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Zellbiologie und Biomedizin, um spezifische Krankheiten von Interesse in verschiedenen Organismen zu erforschen. Insbesondere Immunologen können von der Nutzung dieser neuen Technologie zur Identifizierung der Bevölkerung von Interesse profitieren.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine etikettierungsfreie Methode zur Identifizierung von Lymphozytenuntertypen unter Verwendung quantitativer Phasenbildgebung in Kombination mit maschinellem Lernen. Die Technik bietet eine schnelle und genaue Alternative zur herkömmlichen Fluoreszenzmarkierung und Durchflusszytometrie.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Herkömmliche Methoden zur Lymphozytenidentifizierung können zeitaufwendig und kostspielig sein.
- Fluoreszenzmarkierung kann die Zellfunktion verändern.
- 3D-Brechungsindextomographie liefert detaillierte morphologische und biochemische Einblicke.
- Maschinelles Lernen erhöht die Genauigkeit der Zelltypidentifizierung.
Ziel der Studie
- Entwicklung einer etikettierungsfreien Technik zur Identifizierung von Lymphozytenuntertypen.
- Verbesserung der Geschwindigkeit und Genauigkeit der Lymphozytenanalyse.
- Erforschung von Anwendungen in der Therapie von Blutkrebs und Autoimmunerkrankungen.
Verwendete Methoden
- Quantitative Phasenbildgebung für 3D-Brechungsindextomographie.
- Maschinelle Lernalgorithmen zur Zelltypidentifizierung.
- Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zur Sammlung von Lymphozytenuntergruppen.
- Visuelle Demonstrationen zur Erleichterung des Verständnisses der Technik.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Identifizierung von Lymphozytenuntertypen.
- Sie liefert Einblicke in Lymphozytenpopulationen und andere einzelne Zellen.
- Die Technik ist auf verschiedene Bereiche über die Immunologie hinaus anwendbar.
- Visuelle Demonstrationen verbessern die Lehrqualität des Protokolls.
Schlussfolgerungen
- Diese etikettierungsfreie Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Lymphozytenanalyse dar.
- Sie hat potenzielle Auswirkungen auf die Diagnose und Behandlung von Blutkrebs und Autoimmunerkrankungen.
- Der Ansatz kann auf andere Zelltypen angepasst werden, was seine Anwendbarkeit erweitert.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Label-free identification of lymphocyte subtypes addresses a key bottleneck in immunology and immuno-oncology research by eliminating the need for fluorescent labeling, which can perturb cellular function and introduce variability. This method enables rapid, quantitative, and reproducible phenotypic profiling of immune cells at single-cell resolution, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The integration of 3D refractive index tomography with machine learning provides a scalable platform for immune monitoring in preclinical models of blood cancers and autoimmune diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lymphocyte subpopulations without exogenous labels, preserving native phenotype and function for accurate target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces assay complexity and variability associated with antibody staining, improving reproducibility across laboratories and timepoints.
- Predictive Value: Supports functional validation of immunomodulatory targets by linking morphological and biochemical features to cell identity in a label-free context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative morphological and biochemical features (e.g., volume, sphericity, protein density) from 3D RI tomograms, enabling multiparametric immune cell phenotyping.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through intrinsic optical contrast, eliminating batch effects from antibody labeling and instrument variability.
- Scalability: Compatible with high-content imaging workflows and machine learning pipelines for large-scale immune profiling in drug screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of lymphocyte subtypes in preclinical disease models without perturbing cellular physiology, supporting biomarker-aligned efficacy readouts.
- Mechanistic De-risking: Provides label-free validation of immune cell responses to therapeutic candidates, reducing false positives from labeling artifacts.
- Predictive Confidence: Achieves over 80% accuracy in multiclass lymphocyte classification, supporting reliable immune monitoring in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from immune target engagement to functional validation, enabling label-free immune monitoring between hit identification and lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immunomodulatory mechanisms by providing quantitative, label-free immune cell phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., dry mass, surface area) that enable comparison of compound effects on lymphocyte morphology and density.
- Analytics: Generates structured feature datasets compatible with machine learning classifiers, enabling objective, data-driven cell type identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing non-invasive monitoring of immune cell dynamics in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable label-free immune profiling platform applicable across therapeutic areas and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from labeling-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized, label-free imaging and automated feature extraction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable immune response data, reducing late-stage failure risk in immuno-oncology and autoimmune disease programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on quantitative, label-free immune cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative phase imaging, 3D tomogram reconstruction, and machine learning workflows for feature extraction and classification.
- Dependent on access to a 3D quantitative phase microscope and software capable of refractive index tomography and tomogram visualization.
- Necessitates standardized cell preparation and imaging protocols to ensure tomogram quality and reproducibility across users and sites.
- Involves adaptation of feature extraction pipelines to different lymphocyte subsets or model systems based on refractive index distributions.
- Limited by the need for high-quality 3D RI tomograms; suboptimal focus or sample preparation can impair reconstruction and reduce classification accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
3D Quantitative Phase Imaging
4:34
Quantitative Morphological and Biochemical Feature Extraction and Supervised Learning and Identification
6:42
Results: Representative Label-Free Lymphocyte Subtype 3D Phase Imaging Identification
7:56
Conclusion
