Name: Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse mit Sauerstoff-Elektrode zur Untersuchung der DesB-Dioxygenase-Aktivität. Diese Methode ermöglicht die Stabilisierung sauerstoffsensitiver Enzyme.

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Wir möchten Dr. Camille Keller der Wesleyan University für technische Unterstützung zu danken. Besonderer Dank geht an Professor Lindsay D. Eltis sowie Jenna K. Capyk von der University of British Columbia und Christian Whitman von der University of Texas at Austin, für ihre Beratung über anaerobe Protein Reinigungsverfahren und die Verwendung von einem O2 -empfindliche Elektrode.

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.

Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien wi...

Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakterisierung unter Beibehaltung der anaerobe Bedingungen notwendig, sie vollständig zu charakterisieren. Dies hat dazu geführt, Forscher, gesamte Labor Aufbauten innerhalb der Grenzen des anaeroben Kammern für Studien von Protein-Expression durch Kristallographie5,6,7,8 bis hin zu entwickeln .
Hier berichten wir über Methoden zur anaeroben Reinigung und kinetischen Charakterisierung des Enzyms DesB mit einem Sauerstoff-Elektrode-System. DesB ist ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6, die mit LigAB, eine Protocatecuate-Dioxygenase aus dem gleichen Organismus zusammenhängt. Beide Enzyme gehören zu den Typ II Protocatechuate Dioxygenase (PCAD)-Superfamilie, die bis Datum9, wahrscheinlich teilweise durch Enzyme dieser Superfamilie wird anfällig für Inaktivierung wenn gereinigt, mit Standard-aerobic nicht umfassend untersucht worden Protein-Reinigungsverfahren. Da einige der PCAD Enzyme Substrat Promiskuität angezeigt, während andere Substrat-spezifische2,10, muss weitere Charakterisierung dieser Superfamilie Spezifität Determinanten identifizieren. Wie in mehreren Enzym Superfamilies11,12,13,14,15festgestellt wurde, können kleine Moleküle Aktivität über direkte wettbewerbsfähig Hemmung oder die Bindung von ändern Moleküle zu trennen allosterische Taschen, wodurch eine Zunahme oder Abnahme der Enzymaktivität16. Während Kinetik allein die bindende Lage ein Modulator unterscheiden kann, ist das Bestimmen der Größe der Änderung einer Aktivität wichtig für das Verständnis der Auswirkungen. Als solcher, Methoden zur kinetischen Charakterisierung von native DesB Tätigkeit und seine Tätigkeit in Gegenwart von 4-Nitrocatechol (4NC), eine Substanz, die häufig verwendet, um zu charakterisieren und hemmen Dioxygenase Enzyme2,17, 18, werden angezeigt.
DesB ist in der Lage zu brechen in welcher Ring Eröffnung katalysiert wird mit Sauerstoff als einem der Substrate10,19Gallat, eine Lignin-abgeleitete aromatische Verbindung, über eine Extradiol-Dioxygenase (EDO)-Reaktion. Diese enzymatische Reaktion tritt im Rahmen der den Abbau von Lignin, einem aromatischen Heteropolymer gefunden in der Zellwand von Pflanzen. Lignin depolymerisiert werden kann, einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, die nachgeben kann weiter unterteilt werden in zentralen Metaboliten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol Dioxygenases (EDO) katalysieren einen Ring Eröffnung Reaktion auf Dihydroxylated aromatischen Verbindungen, wo Spaltung angrenzend an ein Metall koordiniert Diol auftritt; im Gegensatz dazu Spalten Intradiol Dioxygenases analoge aromatische Verbindungen zwischen den beiden Hydroxylgruppen (Abbildung 1). EDOs, wie viele andere mechanistische haben eine zweiwertige Metallzentrum für koordinierende Fe(II), bestehend aus einem zwei-Histidin, eins-carboxylat Triade9,34,35. Diese mechanistische werden entweder durch Autoxidation oder Mechanismen basierenden Inaktivierung, oxidiert, während das Enzym inaktiv2,36,37,38gerendert wird.
In der experimentellen Verfahren, die in dieser Handschrift beschrieben nutzen wir DesB, ein Mitglied der PCAD-Superfamilie aus dem Bakterium Sphingobium SP. SYK-6, um die Zufuhr von Sauerstoff über die C4-C5-Anleihe der Gallat (Abbildung 2A) katalysieren. Die Regiochemistry der dieser Spaltung ist analog zum LigAB, ein Protocatechuate-4,5-Dioxygenase (Abb. 2 b). Bisher gehören Untersuchungen zu diesem Gallat Dioxygenase keine Berichte von Verbindungen, die DesB10,19,39hemmen. Mit dem Einsatz von aeroben Reinigungsverfahren ausgestellt DesB schwankende Aktivität, während wir mit dem Einsatz von anaeroben Methoden konsequent Protein mit reproduzierbaren Aktivität erhalten konnten. Die kinetischen Untersuchungen beschrieben hier zeigen die Methoden für die anaerobe Reinigung von DesB, kinetischen Charakterisierung von der Reaktion des DesB mit Gallat und die Hemmung der DesB von 4-Nitrocatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranodise</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'Tetramethyl-ethylendiamin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Amylose-Harz High Flow</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli-Zellen</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Gallussäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrocatechol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Eisen Ammoniumsulfat</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdithionit</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Serumflaschen</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Spritzenfilter mit Supor Membrane</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Rührzellenkonzentrator</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa Cutoff-Filter für rekonstituierte Zellulosemembran</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Grobentsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2-ml-Bördelfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Elektrodensteuergerät</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff-Eletrodenkammer</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenscheibe</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mmX25mm) 30m Rolle</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenreinigungsset</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Abstandspapier</td><td>Zick-Zack</td><td>an jeder Tankstelle</td><td></td>erhältlich</tr><tr><td>He-Serie Dri-Lab Handschuhfach</td><td>Vakuum/Atmosphären Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vakuum/Atmosphären Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiger mikrokonischer Edelstahlspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Säule Economy Säule</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L, Modell 701 N SYR, Zementiert NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2</td><td>Spritze Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Säule</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 Hochdruck-Homogenisator</td><td>Avestin</td> B-PER Reagenz <td></td><td></td></tr><tr><td>zur vollständigen bakteriellen Proteinextraktion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobe proteinreinigung und kinetische analyse über sauerstoff-elektrode für das studium desb dioxygenase aktivität und hemmung

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.

Gezeigt wird die SDS-PAGE Gelanalyse der einzelnen Fraktionen von Reinigung des DesB-Maltose Binding Protein (MBP) Fusion Konstrukts (Abbildung 3). Das Gel zeigt, dass das Protein pur (MW = 91.22 kDa), mit Ausnahme der Anwesenheit von DesB (MW = 49.22 kDa) und MBP Protein-Domäne (42 kDa) voneinander gespalten. Brüche-E2 und E3 wurden für Konzentration (Schritt 4.2) ausgewählt.
Reproduzierbare Ergebn...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Diese Methode wurde entwickelt, um wichtige Fragen im Bereich der anorganischen Biochemie zu beantworten, wie die Enzymaktivität in Proteinen, die sauerstoffempfindliche Metalle enthalten, aufrechterhalten werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie Ihnen hilft, Möglichkeiten zu visualisieren, wie Sie das Metall eines Proteins in seinem reduzierten Zustand erhalten können. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, weil es schwierig ist, Materialien und Reagenzien zu erhalten, um vollständig anaerobe zu sein.24 Stunden nach induzieren der Proteinexpression, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das bakterielle Zellpellet in 20 Milliliter Amylose-Säulenpuffer pro 1,5 Liter Wachstum aus. Fügen Sie ein Milligramm Lysozym in die Zellsuspension und rühren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation lysieren Sie die resuspendierte Zelllösung über Hochdruckhomogenisierung mit drei bis fünf Durchgängen bei ca. 15.000 psi und übertragen Sie das Protein in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.Spülen Sie den Kopfraum für eine Minute mit Stickstoff, und zentrifugieren Sie die Zelle lysieren, um die unlöslichen Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf mindestens ein 50-Milliliter-Rohr und kappen Sie das Lysat mit einem Gummiseptum. Mit einer 20-Spur-Nadel, langsam Blase Stickstoffgas durch die Lösung für zwei Minuten, um den Sauerstoff zu verdrängen.Dann wickeln Sie das Septum mit Paraffinfolie, sichern Sie den Parafilm mit Kupferdraht und legen Sie den Überstand mit den Säulenmaterialien in den Handschuhkasten. Wenn sich das Lösungsmittel knapp über dem Harzbett befindet, in einer zuvor vorbereiteten Amylosesäule, 50 Milliliter Proteinüberstand auf die Säule laden und den Durchfluss in Fünf-Milliliter-Fraktionen unter mäßig unter Druck stehendem Stickstoff mit etwa fünf Millilitern pro Minute sammeln. Wenn der gesamte Durchfluss eluiert wurde, waschen Sie die Spalte mit einem weiteren dreispaltigen Volumen des Amylose-Spaltenpuffers.Fügen Sie fünf CV Elutionspuffer hinzu und sammeln Sie dann manuell Drei-Milliliter-Fraktionen in Glas-Reagenzgläsern unter mäßig unter Druck stehendem Stickstoff. Testen Sie die Lösungen auf Sauerstoffpräsenz mit Eisenammoniumsulfat und Dithiothreitol. Die Lösung wird dunkelblau oder schwarz, wenn Sauerstoff vorhanden ist, wie das Rohr auf der rechten Seite.Das Vorhandensein von Sauerstoff führt zu gereinigtem Protein mit geringer katalytischer Aktivität. Lösungen mit minimalem Sauerstoff vorhanden wird Lavendel oder hellblau transluzente Farbe sein, wie die Röhre auf der linken Seite. Als nächstes verwenden Sie eine externe Stickstoffleitung, um die gerührte Zellkammer unter Druck zu setzen, und konzentrieren Sie das Protein auf 50 Milliliter bei einer moderaten Rührgeschwindigkeit zweimal.Anschließend das Protein auf 10 Milliliter konzentrieren und das konzentrierte Protein durch einen 0,45-Mikrometer-Porenspritzenfilter filtern. Aliquot 150 Mikroliter Protein in einzelne 200-Mikroliter Polymerase-Kettenreaktionsröhren. Dann entfernen Sie die gekappten Aliquots aus dem Handschuhkasten für sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.Für DesB-Entsalzung zunächst drei Milliliter Sephadex G-25 Grobentsalzungsgel zu einer Neun-Milliliter-Borosilikatsäule hinzufügen und die Säule mit zwei Säulenvolumen entgastem Entsalzungspuffer waschen. Wenn der DesB aufgetaut ist, laden Sie das gereinigte Protein über einen schwerkraftgesteuerten Prozess auf die Säule und entsorgen Sie den Durchfluss, bevor Sie drei Tropfen Protein in jeden der 12 Durchstechflaschen mit etwa fünf Millilitern Entsalzungspuffer elutieren. Um die Sauerstoffelektrode vorzubereiten, verwenden Sie eine Schere, um ein etwa 1,5-Zoll-Quadrat von Spacer-Papier zu schneiden, und schneiden Sie kleine Dreiecke auf jede Fläche des Quadrats, mit Schlitzen in den Ecken, um bei der Umhüllung der Elektrode zu helfen.Fügen Sie fünf Tropfen einer 50%Kaliumchlorid-Lösung auf die silberne Anodennut der Elektrode und verbinden Sie die Tropfen, so dass sie einen kontinuierlichen Ring der Lösung bilden. Fügen Sie zwei Tropfen der Kaliumchloridlösung an die Oberseite der Platinelektrode und legen Sie das Abstandspapier vorsichtig auf die Platinelektrode, wodurch das Abstandspapier geglättet wird, sodass keine Luftblasen entstehen. Schneiden Sie ein etwa zwei Zoll langes Stück S4 30m PTFE-Membran, und legen Sie es auf das Abstandspapier, wodurch die Ränder der Membran entfernt werden, sodass sie am äußeren Ring der Elektrode ausgerichtet sind.Mit einem O-Ring-Applikator einen kleinen O-Ring über die Elektrode schieben, um das Abstandspapier und die Membran auf die Elektrode zu befestigen, und legen Sie einen größeren O-Ring auf die kreisförmige Nut der Elektrode, wobei darauf zu achten ist, dass sich keine Membran darunter befindet. Schieben Sie die obere Kammer der Elektrode auf die Basis und schrauben Sie die beiden Teile zusammen. Legen Sie die montierte Elektrode auf ihre Basis und schließen Sie die Elektrode an das Überwachungssystem an.Um die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion zu bestimmen, verwenden Sie eine sauerstoffempfindliche Clark-Elektrode mit Computerintegration, um den Sauerstoffverbrauch über die Elektrodensteuereinheit zu messen. Fügen Sie einen Milliliter Tris-Puffer in das entsprechende Substratvolumen in die Elektrodenkammer und rühren Sie die Lösung 10 Sekunden lang. Nach 10 Sekunden die Kammer langsam mit dem Kolben versiegeln und die Oberseite nach unten schrauben.Verwenden Sie ein sauberes Gewebe, um die überschüssige Flüssigkeit, die aus der Kammer verdrängt wird, aufzusaugen, und lassen Sie die Elektrode auslagern, wo sie eine stabile Messung der Sauerstoffkonzentration in der Lösung für mindestens eine Minute erzeugen kann. Als nächstes verwenden Sie eine gasdichte 10-Mikroliter-Spritze, um etwa einen Mikroliter Enzym durch den Kolben in die Elektrodenkammer zu geben, und sammeln Sie die Ratedaten. Wenn die gesamte Rate für eine gegebene Substratkonzentration gesammelt wurde, verwenden Sie ein Kunststoffrohr, das mit einem Seitenarm-Vakuumkolben verbunden ist, um die Elektrodenkammer zu entleeren, und spülen Sie die Kammer wiederholt für vier bis sechs Zyklen mit Wasser.Richten Sie dann die Lösung in der Elektrode ein, wie gerade gezeigt, mit einer neuen Substratkonzentration. Die SDS-PAGE-Gelanalyse einzelner Fraktionen aus der DesB-Maltose-Bindungsprotein-Fusionslösung zeigt die Isolierung eines reinen Proteinprodukts, abgesehen vom Vorhandensein von VonB- und Maltose-bindenden Protein-Domänenprodukten, die voneinander abgenommen sind. Sobald alle kinetischen Messungen durchgeführt wurden, kann die Aktivität von DesB mit Galat beispielsweise durch Messung der Sauerstoffverbrauchsrate in unterschiedlichen Gallatkonzentrationen erreicht werden.Umgekehrt kann die Hemmungsrate von DesB mit Vier-Nitrocatechol bestimmt werden, indem die Reduktion der Sauerstoffverbrauchsrate von DesB mit einmillimolarem Gallat in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Vier-Nitrocatechol beobachtet wird, was beispielsweise darauf hindeutet, dass Vier-Nitrocatechol den Sauerstoffverbrauch und damit die DesB-Reaktion hemmt. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Untersuchung von eisenabhängigen Dioxygenase-Enzymen liefern kann, kann sie auf andere Systeme, wie z. B. andere Metalloenzyme, angewendet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in einem Handschuh-Box schwierig sein kann, so achten Sie darauf, nicht zu überstürzen, während der Durchführung dieser Technik.

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