Name: Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse mit Sauerstoff-Elektrode zur Untersuchung der DesB-Dioxygenase-Aktivität. Diese Methode ermöglicht die Stabilisierung sauerstoffsensitiver Enzyme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchten Dr. Camille Keller der Wesleyan University für technische Unterstützung zu danken. Besonderer Dank geht an Professor Lindsay D. Eltis sowie Jenna K. Capyk von der University of British Columbia und Christian Whitman von der University of Texas at Austin, für ihre Beratung über anaerobe Protein Reinigungsverfahren und die Verwendung von einem O2 -empfindliche Elektrode.

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.

Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien wi...

Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakterisierung unter Beibehaltung der anaerobe Bedingungen notwendig, sie vollständig zu charakterisieren. Dies hat dazu geführt, Forscher, gesamte Labor Aufbauten innerhalb der Grenzen des anaeroben Kammern für Studien von Protein-Expression durch Kristallographie5,6,7,8 bis hin zu entwickeln .
Hier berichten wir über Methoden zur anaeroben Reinigung und kinetischen Charakterisierung des Enzyms DesB mit einem Sauerstoff-Elektrode-System. DesB ist ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6, die mit LigAB, eine Protocatecuate-Dioxygenase aus dem gleichen Organismus zusammenhängt. Beide Enzyme gehören zu den Typ II Protocatechuate Dioxygenase (PCAD)-Superfamilie, die bis Datum9, wahrscheinlich teilweise durch Enzyme dieser Superfamilie wird anfällig für Inaktivierung wenn gereinigt, mit Standard-aerobic nicht umfassend untersucht worden Protein-Reinigungsverfahren. Da einige der PCAD Enzyme Substrat Promiskuität angezeigt, während andere Substrat-spezifische2,10, muss weitere Charakterisierung dieser Superfamilie Spezifität Determinanten identifizieren. Wie in mehreren Enzym Superfamilies11,12,13,14,15festgestellt wurde, können kleine Moleküle Aktivität über direkte wettbewerbsfähig Hemmung oder die Bindung von ändern Moleküle zu trennen allosterische Taschen, wodurch eine Zunahme oder Abnahme der Enzymaktivität16. Während Kinetik allein die bindende Lage ein Modulator unterscheiden kann, ist das Bestimmen der Größe der Änderung einer Aktivität wichtig für das Verständnis der Auswirkungen. Als solcher, Methoden zur kinetischen Charakterisierung von native DesB Tätigkeit und seine Tätigkeit in Gegenwart von 4-Nitrocatechol (4NC), eine Substanz, die häufig verwendet, um zu charakterisieren und hemmen Dioxygenase Enzyme2,17, 18, werden angezeigt.
DesB ist in der Lage zu brechen in welcher Ring Eröffnung katalysiert wird mit Sauerstoff als einem der Substrate10,19Gallat, eine Lignin-abgeleitete aromatische Verbindung, über eine Extradiol-Dioxygenase (EDO)-Reaktion. Diese enzymatische Reaktion tritt im Rahmen der den Abbau von Lignin, einem aromatischen Heteropolymer gefunden in der Zellwand von Pflanzen. Lignin depolymerisiert werden kann, einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, die nachgeben kann weiter unterteilt werden in zentralen Metaboliten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol Dioxygenases (EDO) katalysieren einen Ring Eröffnung Reaktion auf Dihydroxylated aromatischen Verbindungen, wo Spaltung angrenzend an ein Metall koordiniert Diol auftritt; im Gegensatz dazu Spalten Intradiol Dioxygenases analoge aromatische Verbindungen zwischen den beiden Hydroxylgruppen (Abbildung 1). EDOs, wie viele andere mechanistische haben eine zweiwertige Metallzentrum für koordinierende Fe(II), bestehend aus einem zwei-Histidin, eins-carboxylat Triade9,34,35. Diese mechanistische werden entweder durch Autoxidation oder Mechanismen basierenden Inaktivierung, oxidiert, während das Enzym inaktiv2,36,37,38gerendert wird.
In der experimentellen Verfahren, die in dieser Handschrift beschrieben nutzen wir DesB, ein Mitglied der PCAD-Superfamilie aus dem Bakterium Sphingobium SP. SYK-6, um die Zufuhr von Sauerstoff über die C4-C5-Anleihe der Gallat (Abbildung 2A) katalysieren. Die Regiochemistry der dieser Spaltung ist analog zum LigAB, ein Protocatechuate-4,5-Dioxygenase (Abb. 2 b). Bisher gehören Untersuchungen zu diesem Gallat Dioxygenase keine Berichte von Verbindungen, die DesB10,19,39hemmen. Mit dem Einsatz von aeroben Reinigungsverfahren ausgestellt DesB schwankende Aktivität, während wir mit dem Einsatz von anaeroben Methoden konsequent Protein mit reproduzierbaren Aktivität erhalten konnten. Die kinetischen Untersuchungen beschrieben hier zeigen die Methoden für die anaerobe Reinigung von DesB, kinetischen Charakterisierung von der Reaktion des DesB mit Gallat und die Hemmung der DesB von 4-Nitrocatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranodise</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'Tetramethyl-ethylendiamin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Amylose-Harz High Flow</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli-Zellen</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Gallussäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrocatechol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Eisen Ammoniumsulfat</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdithionit</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Serumflaschen</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Acrodisc PF Spritzenfilter mit Supor Membrane</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon Rührzellenkonzentrator</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa Cutoff-Filter für rekonstituierte Zellulosemembran</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Grobentsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2-ml-Bördelfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus Elektrodensteuergerät</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff-Eletrodenkammer</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenscheibe</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mmX25mm) 30m Rolle</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenreinigungsset</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Abstandspapier</td><td>Zick-Zack</td><td>an jeder Tankstelle</td><td></td>erhältlich</tr><tr><td>He-Serie Dri-Lab Handschuhfach</td><td>Vakuum/Atmosphären Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vakuum/Atmosphären Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiger mikrokonischer Edelstahlspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Säule Economy Säule</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L, Modell 701 N SYR, Zementiert NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2</td><td>Spritze Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Säule</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 Hochdruck-Homogenisator</td><td>Avestin</td> B-PER Reagenz <td></td><td></td></tr><tr><td>zur vollständigen bakteriellen Proteinextraktion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobe proteinreinigung und kinetische analyse über sauerstoff-elektrode für das studium desb dioxygenase aktivität und hemmung

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.

Gezeigt wird die SDS-PAGE Gelanalyse der einzelnen Fraktionen von Reinigung des DesB-Maltose Binding Protein (MBP) Fusion Konstrukts (Abbildung 3). Das Gel zeigt, dass das Protein pur (MW = 91.22 kDa), mit Ausnahme der Anwesenheit von DesB (MW = 49.22 kDa) und MBP Protein-Domäne (42 kDa) voneinander gespalten. Brüche-E2 und E3 wurden für Konzentration (Schritt 4.2) ausgewählt.
Reproduzierbare Ergebn...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Diese Methode wurde entwickelt, um wichtige Fragen im Bereich der anorganischen Biochemie zu beantworten, wie die Enzymaktivität in Proteinen, die sauerstoffempfindliche Metalle enthalten, aufrechterhalten werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie Ihnen hilft, Möglichkeiten zu visualisieren, wie Sie das Metall eines Proteins in seinem reduzierten Zustand erhalten können. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, weil es schwierig ist, Materialien und Reagenzien zu erhalten, um vollständig anaerobe zu sein.24 Stunden nach induzieren der Proteinexpression, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das bakterielle Zellpellet in 20 Milliliter Amylose-Säulenpuffer pro 1,5 Liter Wachstum aus. Fügen Sie ein Milligramm Lysozym in die Zellsuspension und rühren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation lysieren Sie die resuspendierte Zelllösung über Hochdruckhomogenisierung mit drei bis fünf Durchgängen bei ca. 15.000 psi und übertragen Sie das Protein in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.Spülen Sie den Kopfraum für eine Minute mit Stickstoff, und zentrifugieren Sie die Zelle lysieren, um die

anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben die Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät sowohl die reduktive und oxidative Reaktionen von...

Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Tischplatte immobilisiert Metall Affinität Chromatographie Reinigung und anschließende Wiederherstellung der ein Polyhistidine markiert, nicht-Häm-Eisen bindende Dioxygenase für grundständige Lehre Labor geeignet.

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Wir entwickelten ein praktisches Protokoll und einen analytischen Ansatz zur Bewertung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und Der Elektronentransferkapazität in frischen Tumorhomogenaten. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Funktionen zu überwachen, die zur Entstehung, Progression und Ansprechen auf die Behandlung von Krebs beitragen.

Analytische Bestimmung der mitochondrialen Funktion von exzidierten soliden Tumorhomogenaten

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

In dieser Studie wird eine Methodik zur Untersuchung xenobiotischer Effekte auf die mitochondriale Funktion mittels respirometrischer und enzymatischer Assays vorgestellt. Es untersucht die Modulation der Elektronentransportkette in verschiedenen Spezies und bietet Einblicke in die gezielte Entwicklung von Biopestiziden gegen durch Insektenvektoren übertragene Krankheiten.

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Hämoglobin-Einkapselung und Oberflächen-PEGylation hierarchisch poröser UiO-66-Nanopartikel, die für die Sauerstoffabgabe entwickelt wurden. Das Verfahren kombiniert Defekttechnik mit dehnungsgeförderter biorthogonaler Konjugation, um hochdurchlässige und physiologisch stabile Träger zu erzeugen, die für biomedizinische Anwendungen geeignet sind.

Synthese, Hämoglobinkapselung und biorthogonale PEGylation in hierarchisch porösen UiO-66-Nanopartikeln für Anwendungen zur Sauerstoffabgabe

Erfahren Sie die anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse mit Sauerstoff-Elektrode zur Untersuchung der DesB-Dioxygenase-Aktivität. Diese Methode ermöglicht die Stabilisierung sauerstoffsensitiver Enzyme.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung (Video) | JoVE Journal

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Weitere Videos entdecken