Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik
9. November 2018
Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.
Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit der Effizienz, Erholungsausbeute und Reinheit der bronchoalveolar Lavage Flüssigkeit abgeleitet extrazelluläre Vesikel mit einem Ultrafiltrationzentrifugierungsansatz zu behandeln. Wir haben diese Technik direkt mit einer Ultrazentrifugations- und Dichtegradientenreinigungstechnik verglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach, effizient und geeignet für kleine Volumenproben wie murine Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit ist.
Noch wichtiger ist, dass es eine hohe Reinheit und eine deutlich höhere Skalierbarkeit im Vergleich zu einer Ultrazentrifugationsisolationsmethode bietet. Demonstriert wird das Verfahren von Herrn Norman Garrett III, wissenschaftlicher Mitarbeiter für mein Labor. Um zu beginnen, legen Sie einen 22 Gauge Angiocatheter in die Luftröhre einer eingeschläferten Maus.
Befestigen Sie eine Insulinspritze mit einem Milliliter eiskalter steriler DPBS und bringen Sie einen Milliliter in beide Lungen ein. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zurück, um Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit oder BAL-Flüssigkeit abzurufen. Und geben Sie die BAL-Flüssigkeit in ein konisches Rohr auf Eis.
Ziehen Sie danach BAL-Flüssigkeit von 25 Mäusen und teilen Sie sie in zwei gleiche Sätze. Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit bei 400 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie es bei 15.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Dann sammeln Sie den Überstand und gehen Sie sofort zu den EV-Isolationsschritten. Filtern Sie zunächst den Supernatanten durch einen 0,2 Mikrometer sterilen Spritzenfilter. Danach die Zentrifugalfiltereinheit 10 Minuten lang mit sterilem DPBS ausdemieren.
Dann zentrifugieren Sie die Zentrifugaleinheit bei 15.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie den Filter mit 15 Milliliter n. B. BAL-Flüssigkeit. Und zentrifugieren Sie es bei 3.000 G es für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Danach das Retentat mit 14 Millilitern sterilem DPBS durch wiederholtes Pipetieren vorsichtig waschen. Zentrifugieren Sie die Filtereinheit bei 3.000 G bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, um das DPBS zu entfernen und das Retenat zu konzentrieren. Um die konzentrierte BAL-Flüssigkeit von Eves zu erfassen, legen Sie einen Pipetter in den Boden der Filtereinheit ein und ziehen Sie die Probe mit einer seitlichen Kehrbewegung zurück.
Dann aliquot die BAL-Flüssigkeit abgeleitet EVs und speichern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Alternativ können Sie zunächst den zuvor erworbenen Überstand auf ein Ultrazentrifugenrohr übertragen. Und zentrifugieren Sie es bei 10.000 G es für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das EV-Pellet in 200 Mikroliter DPBS wieder auf. Danach die EV-Suspension mit 300 Mikrolitern 50%iodixanol Arbeitslösung mischen.
Und übertragen Sie es auf ein 15 Milliliter Ultrazentrifugenrohr. Fügen Sie dann pufferlösung nach dem Textprotokoll hinzu, um einen lebhaften Dichtegradienten zu erstellen, und zentrifugieren Sie ihn drei Stunden und 50 Minuten lang bei 100 000 G. Sammeln Sie die 15% und die 25%iodixanol Fraktionen, und verdünnen Sie sie in DPBS, um das Volumen auf 15 Milliliter zu bringen.
Übertragen Sie die Fraktionen 60 Minuten lang auf ein neues Ultrazentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 100 000 G bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die EV-Pellets in 50 Mikroliter sterilen DPBS wieder auf. Um mit der Nanopartikelverfolgungsanalyse zu beginnen, verdünnen Sie die EV-Probe in einem Milliliter DPBS.
Und die Probe in eine Insulinspritze geben. Befestigen Sie die Spritze anschließend an einer Spritzenpumpe und messen Sie die Partikelzahlen und die Größe. Stellen Sie den Kamerapegel auf 14 und den Erkennungsschwellenwert auf 1 fest.
Als Nächstes verwenden Sie einen Plattenleser, um die Menge des Proteins in der EV-Probe durch kolorimetrische Detektion zu quantifizieren. Lösen Sie eine gleiche Menge EV-Protein aus jeder Probe mit einem Blotting-Ladepuffer und DTT. Dann erhitzen Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten.
Die Proben in ein Bis-Tris Plus Acrylamidgel laden und 35 Minuten lang Elektrophorese betreiben. Übertragen Sie die Proteine dann mit einem Trockentransferverfahren auf eine Nitrocellulosemembran. Danach die Membran mit fünf Prozent Magermilch 60 Minuten lang mit sanftem Schaukeln blockieren.
Inkubieren Sie die Membran mit einem Antikörper gegen einen EV-Oberflächenproteinmarker bei vier Grad Celsius mit sanftem Schaukeln über Nacht. Entwickeln Sie die Membran, indem Sie die Membran mit HRP-Link-Antikörper für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Membran 10 Minuten lang mit DemTBST-Puffer dreimal.
Schließlich entwickeln Sie die Membran mit chemilumineszierendem HRP-Antikörper-Detektionsreagenz, bevor Sie mit der Bildgebung fortfahren. Um mit der Durchflusszytometrie zu beginnen, verdünnte BAL-Flüssigkeit eVs in 49 Mikroliter PEB-Färbepuffer. Fügen Sie dann drei Antikörper zu jeder der Proben hinzu, bevor Sie die Proben bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für 60 Minuten im Dunkeln inkubieren.
Schließlich verdünnen Sie die Proben mit 40 Mikroliter membrangefilterten PEB-Färbungspuffer und führen Sie eine Durchflusszytometrieanalyse durch. In diesem Protokoll wurden Eves mit einer UFC- und UC-DGC-Methode von Maus-BAL-Flüssigkeit isoliert. BAL-Flüssigkeit abgeleitet EVs von normalen Mäusen, die durch die UFC-Methode isoliert wurden, zeigten kleinere Größen und eine gleichmäßigere Größenverteilung als die UC-DGC-EV.
Die UFC-Technik hatte auch eine signifikant höhere Gesamtpartikelzahl im Vergleich zur UC-DGC-Technik. Die gesamte Proteinrückgewinnung, gemessen in Milligramm der UFC-Evs, war ebenfalls höher als die der UC-DGC-EV, was darauf hindeutet, dass die UFC-Technik zeit- und zeitaufwändiger ist. Schließlich wurden die von BAL abgeleiteten EV es auch durch Durchflusszytometrie weiter charakterisiert.
Die sowohl CD63, CD9 als auch CD81 der UFC-EV und der UC-DGC-EV. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Membran der Ultrafiltrationseinheit mit DPBS zu rehydrieren. Sobald die Membran hydratisiert ist, muss das Gerät bis zum Einsatz jederzeit nass gehalten werden.
Das Abrufen von extrazellulärem Vesikelretenat aus der Filtereinheit kann eine Herausforderung sein. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze von Seite zu Seite gefegt wird, um die meisten EVs von der Filtereinheit wiederherzustellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der extrazellulären Vesikelisolierung, um die biologischen Funktionen der bronchoalveolaren Lavage zu erforschen, die extrazelluläre Vesikel sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen bei Kleintieren ableitete.
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Übersicht
In diesem Artikel werden zwei Protokolle zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus murinem Bronchoalveolärlavagefluid beschrieben: Ultrafiltrationszentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichtegradientenzentrifugation. Beide Methoden werden hinsichtlich Effizienz, Ausbeute und Reinheit verglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Forschung zu extrazellulären Vesikeln
Hintergrund
- Extrazelluläre Vesikel spielen eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation.
- Isolationsmethoden beeinflussen die Qualität und Ausbeute von Vesikeln.
- Die Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle zur Untersuchung von lungenspezifischen extrazellulären Vesikeln.
- Die vergleichende Analyse von Isolationsverfahren kann die Forschungsergebnisse verbessern.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Effizienz und Skalierbarkeit der Ultrafiltrationszentrifugation.
- Vergleich mit herkömmlichen Ultrazentrifugationsmethoden.
- Beurteilung der Reinheit isolierter extrazellulärer Vesikel.
Verwendete Methoden
- Ultrafiltrations-Zentrifugation zur Vesikelisolierung.
- Ultrazentrifugation mit Dichtegradient zur Vergleichsanalyse.
- Quantifizierung und Charakterisierung der isolierten Vesikel.
- Verwendung von bronchoalveolären Lavageproben aus Mäusen.
Hauptergebnisse
- Die Ultrafiltrationszentrifugation liefert eine höhere Reinheit extrazellulärer Vesikel.
- Diese Methode ist besser skalierbar für Proben mit kleinem Volumen.
- Die Effizienz und Ausbeute sind deutlich verbessert.
- Ein direkter Vergleich unterstreicht die Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Die Ultrafiltrationszentrifugation ist eine geeignete Alternative zur Isolierung extrazellulärer Vesikel.
- Sie bietet Forschern Einfachheit und Effizienz.
- Weitere Studien können die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine effiziente und skalierbare Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus biologischen Proben geringer Volumina stellt einen kritischen Engpass in der frühen Forschung zu Atemwegserkrankungen und Biomarkern dar. Die Technik der Ultrafiltrationszentrifugation (UFC) ermöglicht eine höhere Ausbeute und Reinheit von EVs aus murinem bronchoalveolärem Lavagefluid und unterstützt damit zuverlässige Charakterisierungen in nachgeschalteten Analysen sowie translationsorientierte Studien. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit und beschleunigt Portfolioentscheidungen in der forschungs- und entwicklungstechnischen Pipeline im Bereich Atemwegserkrankungen und extrazelluläre Vesikel.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die hochgradige Isolierung von EVs für hypothesengetriebene Untersuchungen zu Lungen-Signalwegen.
- Verbessert die biologische Ent-Risikobewertung, indem reinere EV-Populationen für die mechanistische Untersuchung bereitgestellt werden.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch reproduzierbare Gewinnung von EVs aus Proben mit geringem Volumen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung standardisierter EV-Proben für quantitative nachgeschaltete Assays.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays, indem Probenverlust und Kontamination minimiert werden.
- Steigert die Skalierbarkeit und den Durchsatz bei Screening-Workflows unter Verwendung begrenzter biologischer Materialien.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem es EV-Biomarker-Studien in krankheitsrelevanten murinen Modellen unterstützt.
- Bietet eine zuverlässige Isolierung von EVs für translationsorientierte Forschung zur Lungenerkrankungs-Pathophysiologie.
- Verringert das Risiko beim Voranbringen von EV-basierten Biomarker-Kandidaten durch konsistente Probenqualität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die UFC-Methode integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und präklinischer Forschung und ermöglicht eine robuste Isolierung von EVs für nachgeschaltete molekulare, proteomische und funktionelle Analysen.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt Hypothesentests und Pfadanalysen, indem hochreine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Proben geringer Volumina bereitgestellt werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative EV-Präparationen für die Assay-Entwicklung und die Bewertung von Verbindungen.
- Analytik: Ermöglicht genaue Messungen der Anzahl von EV-Partikeln, der Größenverteilung und des Proteingehalts für vergleichende Studien.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Entdeckung und Validierung von Biomarkern in murinen Modellen von Lungenerkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen skalierbaren, standardisierten Workflow zur Isolierung von EVs, der in verschiedenen Forschungsprogrammen zu Atemwegserkrankungen und extrazellulären Vesikeln anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in Studien zu extrazellulären Vesikeln (EV).
- Operativer Wert: Vereinfacht die Isolierung von EVs durch verbesserte Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und eine kapitaleffiziente Weiterentwicklung von EV-bezogenen Assets.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu Atemwegs- und EV-Biomarkern.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) und nachgeschalteten analytischen Methoden wie der Nanopartikel-Verfolgung und der Durchflusszytometrie.
- Benötigt Zugang zu Ultrafiltrationseinheiten, Zentrifugen und Instrumenten zur Proteinquantifizierung.
- Erfordert eine standardisierte Probennahme und -verarbeitung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann durch Optimierung des Protokolls auf andere biologische Flüssigkeiten mit geringem Volumen angepasst werden.
- Sorgfältiges Handling der Membranen und eine schonende Probenrückgewinnung sind entscheidend, um die Ausbeute und Reinheit der EVs zu maximieren.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
1:15
Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Preparation
2:21
Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid
4:56
Extracellular Vesicle Quantification
5:35
Detection of BALF-derived Extracellular Vesicles
7:16
Results: UFC Method Demonstrates Higher Total Particle Counts and Protein Recover
8:25
Conclusion
