Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in verschiedenen Bereichen der Stoffwechselkrankheit Forschung Über molekulare Veränderungen der Leberenergie und Proteinbiosynthese bei Fettleibigkeit, alkoholfreie Fettleber, und Typ-2-Diabetes zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie die Isolierung von funktionellen primären Maushepatozyten und detektionshepatische aufkeimende Proteine über ein nicht radioaktives Etikettiersubstrat erleichtert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Perfusionsschritt aufgrund der kleinen und dünnen Mausblutgefäße schwer zu erlernen ist.

Für Leberperfusion, legen Sie vorsichtig einen 24 Gauge Katheter in die inferior Vena Cava oder IVC nur an der Bifurkation mit der rechten Nierenvene. Entfernen Sie die Katheternadel, die die Position der Kanüle innerhalb des IVC beibehält, und schließen Sie eine 24 Gauge Kanüle mit Perfusionsrohr mit dem Stecker an. Beginnen Sie, die Leber mit warmen HBSS minus bei einem vier Milliliter permanenten Durchfluss schnell schneiden die Milzvene, um das innere Blut abfließen.

Nach 10 Minuten durchdringen Sie die Mausleber mit 35 Millilitern HBSS plus ergänzt mit Kollagenase Typ X bei einer Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute, wobei die Milzvene alle paar Minuten etwa 10 Sekunden lang geklemmt wird, um die Verteilung des Perfusaten in der Leber zu erleichtern. Wenn die gesamte Kollagenase durchdren wurde, übertragen Sie die Leber auf ein Laborgewebe, bevor Sie die Pumpe anhalten, um einen Blutrückfluss in die Leber zu vermeiden. Verwenden Sie Zangen, um die Gallenblase zu entfernen und sanft die Leber mit einem frischen Laborgewebe zu wischen, um Blut zu entfernen.

Legen Sie die Leber in eine 100-Millimeter-Petrischale mit fünf Millilitern frischwarmen HBSS plus ergänzt mit Collagenase und verwenden Streuner-SpitzenZange, um die Leberkapsel sanft zu entfernen. Verwenden Sie die Zange, um das parenchymale Gewebe sorgfältig zu dispergieren und fügen Sie 15 Milliliter kalte DMEM auf die Petrischale. Schütteln Sie die zerrissene Leber sanft, um die verbleibenden parenchymalen Zellen in das Medium freizusetzen und fügen Sie weitere 15 Milliliter kaltes DMEM in die Schale, um den Rest der Zellen zu erwerben.

Dann filtern Sie die Gewebeschlämme durch ein 100 Mikron Zellsieb in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis. Um die primären Maushepatozyten zu isolieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem DMEM wieder auf. Schichtung der Zellen über einen Gradientenpuffer mit einer Dichte von 40 % für die Trennung des Dichtegradienten, wodurch die Zellen nach der Zentrifugation aus der oberen und mittleren Schicht verworfen werden.

Setzen Sie das primäre parenchymale Hepatozytenpellet mit zwei bis drei Millilitern Von Williams Medium E wieder auf, um das Sammeln abgestorbener Zellen von der Rohrwand zu vermeiden und die Zellen in eine neue 50-Milliliter-Röhre zu übertragen. Mischen Sie die Zellen mit weiteren sieben bis acht Millilitern von Williams E Medium vor der Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 10, 20 oder 30 Milliliter frischer William es Medium E je nach Größe des Pellets wieder auf. Nach dem Zählen, Samen sechs mal 10 bis die fünfte Zelle zu jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte für eine zwei- bis dreistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch DMEM, ergänzt durch 10%Fetal Bovine Serum und Anti-Anti, um die toten und nicht angeschlossenen Zellen zu entfernen und die Zellen über Nacht in den Inkubator zurückzuführen. Zur Azid-modifizierten Proteinbeschriftung 20 bis 40 Mikrogramm Zelllysat zu 50 Mikroliter 2X Reaktionspuffer hinzufügen. Bringen Sie das Volumen auf 80 Mikroliter mit destilliertem deionisiertem Wasser und wirbeln Sie die Proteinlösung für fünf Sekunden.

Fügen Sie fünf Mikroliter Kupfersulfat zu den Zellen für einen weiteren Wirbel von fünf Sekunden hinzu, gefolgt von fünf Mikrolitern Reaktionspufferadditiv eins mit fünf Sekunden Wirbel. Nach einer dreiminütigen Inkubation 10 Mikroliter rekonstituiertes Reaktionspufferadditiv zwei für einen weiteren Wirbel von fünf Sekunden in die Zellen geben und die Probe 20 Minuten bei vier Grad Celsius auf einer lichtgeschützten Multirotatormaschine drehen. Am Ende der Rotation 300 Mikroliter Methanol in das Lysat geben, gefolgt von 75 Mikroliter Chloroform und 200 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser.

Sammeln Sie das markierte Protein durch Zentrifugation und fügen Sie 250 Mikroliter frisches Methanol in das Pellet. Nach dem Wirbeln das Lysat wieder zentrieren und das blanke Pellet bei Raumtemperatur 15 Minuten lang mit einem fusselfreien Gewebe bedecken. Für die PAGE-Analyse das getrocknete Pellet in 20 Mikroliter Ladepuffer ohne Beta-Mercaptoethanol auflösen und das Pellet 10 Minuten lang wirbeln.

Als nächstes erhitzen Sie das Protein in einem 70 Grad Celsius Wärmeblock für 10 Minuten und laden Sie die Probe auf ein 10%Natrium-Dodecylsulfat-Gel für den Tetramethylrhodaminnachweis. Verwenden Sie dann einen Laserscanner mit variablem Modus für die präzise Quantifizierung der aHA-markierten entstehenden Proteine. Histologisch erscheinen lebende und angehängte primäre Hepatozyten typischerweise polygonal oder hexagonal in Form mit einer klar umrissenen membranösen Grenze nach 24 Stunden Kultur.

Um zu bestätigen, ob es sich bei den isolierten Zellen um primäre Hepatozyten handelt, wurden in diesem Experiment Albumin-Protein-Expressionsniveaus in embryonalen Fibroblasten der Maus, einer Maus-Hepatom-Zelllinie, isolierten primären Maushepatozyten und Mauslebern verglichen. Die Albumin-Proteinexpression wurde in primären Maushepatozyten und Mauslebern nachgewiesen, war aber weder in embryonalen Fibroblasten der Maus noch in Häpatom-Zelllinienzellen nachweisbar. Die primäre Hepatozytenbehandlung mit 10 mikromolarem Rotenon für vier bis sechs Stunden ergab eine robuste Induktion der hepatischen AMP-aktivierten Proteinkinase, die durch erhöhte Phosphorylierungsniveaus an der hepatischen AMP-aktivierten Proteinkinase T172 ähnlich der in vivo beobachteten nachgewiesen wurde.

Tatsächlich hatten fünf Stunden mit 10 mikromolarer Rotenone-Behandlung tiefgreifende hemmende Auswirkungen auf die aufkeimende Proteinsynthese in behandelten primären Hepatozyten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen, wie ein chemoselektiver Ligationsreaktionstest zeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle erforderlichen Reagenzien und Medien im Voraus vorzubereiten. Diese Technik ebnete dem Forscher auf dem Gebiet der hepatischen metabolischen Pathophysiologie den Weg, um den molekularen Mechanismus der Energieproteinregulation bei Adipositas und Typ-2-Diabetes bei isoliertem primären Maushepatozyten zu erforschen.