Name: Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem Kontraktilitäts-Assay in Drosophila S2R+ Zellen den Fog-Signalweg und die Regulation von Nicht-Muskel-Myosin-II untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer Proteine.

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Die Autoren möchten Mitglieder des Rogers Labors und Applewhite Labor, Greta Glover, und die Studenten in die Reed College Frühjahr 2018 Zellbiologie natürlich, die zur Entwicklung dieses Protokolls beigetragen haben bedanken. Darüber hinaus möchte die Autoren Mitglieder des Ritz Lab for sorgfältig lesen und bearbeiten diese Handschrift zu danken. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Science Foundation unter prämiennummer 716964 D.A.A. und A.R und der Reed College Biologie-Abteilung unterstützt.

1. Wartung von Drosophila Gewebekultur Zellen
<ol><li>Pflegen Sie S2R +, S2R +: RLC-EGFP und S2:Fog-Myc Zellen bei Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 20 ° C und 25 ° C, im Schild und Sang M3 Insekt Medium ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 Amphotericin B bei einer Dichte nicht niedriger als 5 x 105 Zellen/mL. Hinweis: Die untere Zelldichten zum Tod führen.</li>
	<li>Schnell tauen Sie Cryo erhaltenen Fläschchen von Zellen auf und übertragen Sie sie in einer Gewebekultur-Kolben. Beginnen Sie mit einem kleinen Gewebekultur Kolben (12,5 cm2 oder 25 cm2) in einem Volumen von ca. 4-5 mL Zellkulturmedium bis der Kultur etabliert und Anzeichen von Zelltod durch Auftauen abgeklungen. Hinweis: Zeichen der Zelltod durch Auftauen sind nicht anhaftende Zellen, die eine glatte, abgerundete Form und kleine dunkle Stückchen zelltrümmer in der Gewebekultur mittlere Indikativ des nekrotischen Zellen fehlt.</li>
	<li>Dadurch, dass die Zellen wachsen ungestört über mehrere Tage (4-8 d) zu 100 % Konfluenz, wo gibt es wenig bis gar kein Platz zwischen den Zellen und sie fangen an, aufeinander stapeln sich skalieren Sie langsam die Größe der Gewebekultur. Übertragen Sie alle Zellen von dieser 100 % konfluierende kleiner 12,5 cm2 oder 25 cm2 Fläschchen auf eine größere Gewebekultur Flasche (75 cm2) ergänzt mit 10 mL Zellkulturmedium. Hinweis: Aufrechterhaltung der Zellen in einem 75-cm2 Kolben erbringt genügend Zellen für die meisten Experimente.</li>
	<li>Die Passage der Zellen alle 3-4-d durch pipettieren Zellkulturmedium rauf und runter, benutzen, um alle Lose eingehalten Zellen aus der Gewebekultur Kunststoff zu verdrängen. Übertragen Sie dieses Medium jetzt die resuspendierte Zellen in eine frische Flasche enthält. Verdünnen Sie der Zellen 1:4 mit Frischzellen-Kulturmedium mit jedem Durchgang und nach Bedarf zu wiederholen.</li>
</ol>(2) RNAi Behandlung von Drosophila S2R + Zellen
Hinweis: Beziehen sich auf Rogers und Rogers6 für detaillierte Anweisungen zum DsRNA geeignet für Insekten Kultur zu produzieren.
<ol><li>Übertragen Sie S2R +-Zellen auf eine 6-Well oder 12-Well-Zellkultur-Platte in einer Dichte, die förderlich für die Lebensfähigkeit, kein geringer als 5 x 105 Zellen/mL, mit kompletten Schild und Sang M3 Nährmedien für RNAi Behandlungen Zelle.</li>
	<li>Arbeiten in einer Gewebekultur-Haube, Entfernen der alten Zellkulturmedium durch sanft Kippen der Gewebekultur 6-Well oder 12-Well-Platte und das Zellkulturmedium mit einer Pipette absaugen. Ersetzen Sie schnell diese alten Zellkulturmedium mit 1 mL Kulturmedium Frischzellen durch in jede Vertiefung pipettieren. Hinweis: Dies kann ohne erheblichen Verlust erfolgen nach die Zellen sich locker für 30-45 min vor dem Austausch der Zellkulturmedium halten konnten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µg/mL DsRNA, die generiert wurde nach der detaillierten Protokolls in Rogers und Rogers6 durch pipettieren sie direkt in das Gewebe Kulturmedium von jedem gut von den Zellen pro RNAi Zustand.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang täglich 1 mL frisches Medium und 10 µg/mL DsRNA pro RNAi Zustand das Zellkulturmedium ersetzen. Hinweis: RNAi Experimente sind in der Regel für 7D durchgeführt; der genaue Zeitpunkt ist jedoch abhängig von Protein-Umsatz und Wirksamkeit der DsRNA. RNAi Behandlungen so kurz wie 3-d zu einem Abbau effektiv Zellen bestimmter Proteine, während andere Ziele längere Behandlungen6 erfordern.</li>
</ol>(3) Nebel Produktion und Ernte
<ol><li>Scale-up das Wachstum der S2:Fog-Myc Zellen dadurch, dass sie ungestört für 4-8 d zu einer fast 100 % konfluierende 75 cm2 Fläschchen der Zellen in 10 mL Zelle Kulturmedium (oder alternativ ein 150 cm2 Fläschchen in 20 mL Zellkulturmedium) bis Maxi wachsen Mize Nebel Produktion.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL 100 mM CuSO4 (bzw. 100 µL 100 mm CuSO4 für ein 150 cm2 Fläschchen) in den fast 100 % konfluierende 75 cm2 Kolben für die Induktion des Veranstalters Metallothionine. 48 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nebel-Myc-haltigen Medium aus der Gewebekultur-Flasche durch pipettieren und auf eine 15 mL oder 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 2.500 X g bei 4 ° C für 10-15 min, das Medium der Zellen und zelltrümmer zu löschen.</li>
	<li>Das geräumte Zelle Medium auf eine neue konische Rohr übertragen und auf dem Eis zu erhalten. Arbeiten in Chargen, übertragen Sie 5 mL des Mediums gerodeten 15 ml von 3.000 MW-Konzentratoren mit regenerierte Zellulose-Membranen und Zentrifugieren Sie es bei 2.500 X g bei 4 ° C für 30 min in einer Zeit, das Medium zu konzentrieren. Hinweis: Alternativ könnte ein Konzentrator mit einem größeren Fassungsvermögen verwendet (50 mL). Während der Konzentration startet ein dunkler gefärbten Medium, das mit Nebel angereichert ist, am unteren Rand der v-förmigen Filter aufbauen.</li>
	<li>Setzen Sie die PIPETTENSPITZE an der Unterseite des "V" des Konzentrators und entfernen Sie die dunkleren farbigen Medien zwischen jeder Runde der Zentrifugation und auf einem frischen 1,7 mL Microfuge Rohr übertragen. Pflegen Sie die Medien auf dem Eis.</li>
	<li>Mit der gleichen Konzentrator, wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 durch das Entfernen der dunkleren farbigen konzentriert, Nebel-Myc Medien und ersetzt sie durch mehr precleared Medium, bis das Medium auf 1 wurde/10 des ursprünglichen Volumens (d.h. 1 mL von 10 mL Ausgangsmaterial).</li>
	<li>Lagern Sie die konzentrierte Nebel-Myc bei 4 ° c Hinweis: Nach der Lagerung unbedingt für bakterielle Kontamination zu überwachen, die durch längere Lagerung entstehen.</li>
	<li>Führen Sie SDS-PAGE durch das Mischen von 10 µL konzentrierter Nebel-Myc Medium mit 10 µL eines denaturierenden SDS-haltigen Puffers ein lysate zu bilden. Führen Sie die SDS-PAGE-Gel bei 35 mA für ca. 1 h. übertragen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (oder alternativ eine PVDF-Membran) für 1 h bei 120 mA. Führen Sie ein western-Blot mit jeder handelsüblichen Myc-Antikörper um eine 150-kDa-Band zu erkennen. Hinweis: Nebel-Myc-Konzentration in der konditionierten Medium variieren pro Charge. Es ist nicht notwendig, die genaue Konzentration der Nebel-Myc zu bestimmen, um den Test durchzuführen, aber die Wirksamkeit von jeder Charge sollte getestet werden, bevor Sie ein Experiment durchführen.</li>
	<li>Folgenden Schritte 3.1-3.2, bereiten das Steuerelement S2 konditioniertes Medien durch das Sammeln von 10 mL Zellkulturmedium von fast 100 % konfluierende 75 cm2 Kolben S2-Zellen (oder, alternativ, 20 mL von einem 150-cm-2 -Kolben) durch pipettieren. Übertragen Sie das Steuerelement S2 Zellkulturmedium auf eine frische 15 mL oder 50 mL konische Rohr.</li>
	<li>Folgenden Schritte 3,4-3,7 klar lysate von Zellen und zelltrümmer durch Zentrifugation (bei 2.500 X g bei 4 ° C für 30 min zu einem Zeitpunkt) und dann übertragen die geräumte Zelle lysate, Konzentratoren und zentrifugiert, um das Steuermedium in Chargen zu konzentrieren 1/10 des ursprünglichen Volumens. Hinweis: Anwendung der S2-konditionierte Medien führt nicht zu erheblichen Zelle Kontraktilität in der Probe.</li>
	<li>Speichern Sie die konzentrierte S2 Steuermedien bei 4 ° C für mehrere Monate. Hinweis: Nach der Lagerung müssen Sie für die Kontamination zu überwachen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Concanavalin A-beschichteten Glasboden-Gerichte und die Beschichtung der S2R + Zellen
<ol><li>Machen Sie 10 mL Concanavalin (Con A) Lösung durch Auflösen von Con A 5 mg in 10 mL Wasser für eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL. Aliquoten diese Lösung in bequemer Bände (500 µL bis 1 mL) und speichern Sie es bei-20 ° C.</li>
	<li>Zubereiten Sie 35 mm Glasboden-Gerichte zu, durch die Beschichtung der Glasanteil jedes Gericht mit 200 µL der Con A-Lösung und inkubieren Sie die Gerichte für ca. 2 min bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur-Haube. Als Nächstes entfernen Sie alle Con eine Lösung (die beibehalten und für zukünftige Experimente wiederverwendet werden kann) und das Geschirr vollständig an der Luft trocknen lassen. NOTES: Gerichte in großen Mengen zubereitet werden und können bis zu 6 Monaten an einem trockenen Ort wie ein Labor Bank Schublade gelagert werden.</li>
	<li>Jedes Gericht Glasboden ca. 2 mL frische Zellkulturmedien hinzufügen. Aufschwemmen der S2R + Zellen pipettieren der Zellkulturmedium rauf und runter, benutzen, um alle Lose anhaftenden Zellen zu trennen von der Assay getestet werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die resuspendierte S2R + Zellen auf die 35 mm Glasboden-Gerichte mit frischen Zellkulturmedium sind zwischen 50-70 % Zusammenfluss. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop Gewebekultur durch die Konzentration auf und ab durch mehrere Ebenen von den Zellen ausgesetzt Mittel-und eine Schätzung der Anzahl der Zellen zu erhalten. Hinweis: Durch Versuch und Irrtum, kann die entsprechende Dichte der Zellen benötigt, um 50 % - 70 % Konfluenz zu erreichen erreicht werden.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen an der Con-A-beschichtete Glasboden-Gerichte für 45-60 min. Hinweis: Vollständig angehängte S2R + Zellen erscheinen "gebraten-Ei-Like," Abgeflachte und Phase-dunkel.</li>
</ol>5. Wirksamkeit Test des Mediums Nebel konditioniert und der zellulären Kontraktilität Assay
<ol><li>Falls gewünscht, zu bestätigen, die Ausbeute an Nebel-Myc hergestellt und konzentriert aus der S2:Fog-Myc Stall Zellen Linien durch SDS-PAGE und westliche Beflecken. 10 µL konzentriert Nebel-Myc und kochen es für 5 min. folgen Sie den standard-SDS-PAGE und westlichen befleckenden Protokolle und Beflecken für Anti-Myc Nebel-Myc Produktion bestätigen fügen Sie 10 µL Probenpuffer SDS-haltigen hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schild und Sang M3 Medium aus den beigefügten S2R + Zellen aus Schritt 4.3 durch sanft pipettieren und fügen Sie sorgfältig Rücken 75 µL frische Schild und Sang Medium beschränkt die Menge an Nebel konditioniertes Medium verwendet hinzu.</li>
	<li>Der Glasanteil der Glasboden Schale fügen Sie 75 µL Nebel bedingt Medien aus Schritt 5.2 bringen das Gesamtvolumen auf 150 µL, bei einem 1:1 Verhältnis von Nebel konditioniert, Schild und Sang M3 Medien hinzu. Hinweis: Ein Gesamtvolumen von 150-200 µL ist musste der Glasanteil ein typisches Gericht der Glasboden vollständig abdecken; Allerdings hängt dies die Dimensionen der Glasboden Schale verwendet.</li>
	<li>Überwachen Sie die Kontraktilität der Zellen durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit 20 X oder 40 X Vergrößerung, um ein ganzes Feld von Zellen zu beobachten. Die Morphologie der Zellen zu verfolgen und das abwechselnde Muster aus dunklen Phase und Phase Licht kräuseln bezeichnend für die Formänderung suchen. Hinweis: Die Anwendung der Nebel führt in der Regel um 30 % - 50 % der S2R + Zellen in der zellulären Verengung, und nach 10 Minuten beginnen die Zellen zu entspannen, wieder in ihrer glatten Kanten, gebraten-Ei-wie Morphologie.</li>
	<li>Die Robustheit der zellulären Kontraktilität zu überwachen. Wenn die Zelle Antwort sehr stark mit einem 1:1 Verhältnis von Nebel konditioniertes Medium, frische Schild und Sang Medium ist, reduzieren Sie die Menge der Nebel konditioniertes Medium, das konzentrierte Nebel-Myc-Medium für zukünftige Experimente zu konservieren. Verwenden Sie unverdünnt Nebel konditioniertes Medium, wenn ein Verhältnis von 1:1 nicht zu robust zellulären Verengung führt; in der Regel produziert ein Verhältnis von 1:3 genug Antwort auf das Experiment erfolgreich durchführen. Hinweis: Sobald das angemessene Verhältnis von Nebel bedingt Mittel-und frische Schild und Sang Medium pro angesichts Charge von Nebel konditioniertes Medium besteht, verwenden Sie dieses Verhältnis für alle anderen Experimente.</li>
	<li>Überwachen Sie-Muskel Myosin II Dynamik während der zellulären Kontraktilität Test stabilere S2R + Zelllinie, die GFP-Tags regulatorische leichte Kette (S2R +: Sqh-EGFP) ausdrückt.</li>
	<li>Mit den etablierten Verhältnis von Nebel konditioniertes Medium, frische Schild und Sang M3 Medium aus Schritte 5,2-5,5, Zelle-kultivierte Medium mit einer Pipette und fügen wieder frisches Schild und Sang Medium im Bereich Glas der Schale verglast-Talsohle. Perfundieren Sie Nebel konditioniertes Medium im vorgegebenen Verhältnis beim Erwerb einer Bildsequenz von lebenden Zellen; Achten Sie darauf, nicht die Glasboden-Schüssel während der Perfusion bewegen.</li>
</ol>6. Fixierung und Färbung der verengten S2R + Zellen
<ol><li>S2R + Zellen mit einer 10 % Paraformaldehyd Lösung in PEM Puffer (100-mM-Rohre, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9) zu beheben. Hinweis: PEM Puffer erfolgt in der Regel auf 2 x Stammlösung und kann Monate bei 4 ° c gelagert</li>
	<li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium vom Nebel behandelt S2R + Zellen durch pipettieren und sofort mit 1,5-2,0 mL 10 % Paraformaldehyd-Lösung zu ersetzen. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Feste Zellen können in Fixierung Lösung bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden; Es ist jedoch wichtig, dass die ersten 15 min Fixierung bei Raumtemperatur erfolgt vor der Übertragung von Zellen auf 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die 10 % Paraformaldehyd Lösung durch pipettieren und dieses organischen Abfall-Produkt entsorgen Sie ordnungsgemäß. Spülen Sie die Zellen durch sanft pipettieren 1,5-2,0 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die 35-mm-Glasboden Schale. Entfernen Sie die alte PBS durch pipettieren und ersetzen Sie es mit 1,5-2,0 mL frische PBS 2 x mehr passives Fixierung Lösung zu entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen nicht ab diesem Zeitpunkt auf dem Protokoll austrocknen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit ca. 200 µL 5 % normalem ziegenserum verdünnt mit PBS-Puffer, die mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel (PBST) für 20 min bei Raumtemperatur ergänzt wurde. Hinweis: In der Regel enthalten blockierende Lösungen Serum Organismus dem entspricht, was, dem der Sekundärantikörper in ausgelöst werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung in PBST verdünnen. Verwenden Sie ein Volumen von etwa 200 µL der Glasanteil der Glasboden Schale vollständig bedecken.<ol>
<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung durch pipettieren und fügen Sie die primären Antikörper-Lösung der Glasanteil der Schale direkt hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren oder alternativ über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Wenn über Nacht bei 4 ° C Bebrüten, wickeln Sie die 35-mm-Glasboden Schale mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die primären Antikörper-Lösung durch pipettieren und spülen Sie die Zellen durch pipettieren 1,5-2,0 mL frische PBS in die 35-mm-Glasboden Schale. Entfernen Sie PBS durch pipettieren zu und ersetzen Sie es mit 1,5-2,0 mL frische PBS 2 x mehr.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung der Sekundärantikörper in PBST verdünnen. Ein Volumen von 200 µL ist ausreichend, nur der Glasanteil des Gerichtes zu decken.<ol>
<li>Die sekundäre Antikörper-Lösung direkt hinzufügen der Glasanteil des Tellers. Die Zellen mit Sekundärantikörper Lösung für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
		<li>Wickeln Sie die 35-mm-Schale mit Parafilm, wenn Inkubation über Nacht, um Verdunstung zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die sekundäre Antikörper-Lösung durch pipettieren und spülen Sie die Zellen mit PBS durch pipettieren 1,5-2,0 mL frische PBS auf den Teller. Die alten PBS zu entfernen und ersetzen Sie es 2 x mehr, das gleiche Verfahren.</li>
	<li>Bewahren Sie die feste und gefärbten Zellen indem man genug von einer Anti-Fade fluoreszierende Eindeckmittel zur Deckung der Glasanteil der Glasboden-35-mm-Schale.</li>
	<li>Die Proben bei 4 ° C und lichtgeschützt aufbewahren. Hinweis: Das Fluoreszenzsignal wird langsam über Monate vergehen, auch bei sachgemäßer Lagerung. Für beste Ergebnisse, Bild innerhalb einer Woche.</li>
</ol>(7) Bildgebung und Quantifizierung des zellulären Kontraktilität Assays
<ol><li>Bild fixiert S2R + Zellen mit einem Standard-invertiert Lichtmikroskop mit Phasenkontrast, DIC oder Fluoreszenz-imaging-Funktionen. Erfassen Sie mit 20 X oder 40 X Vergrößerung, 10-30 dortiger Bildfelder der Zellen abhängig von der Zelldichte, mit dem Ziel des Erwerbs der Bilder von 200 oder mehr Zellen pro Zustand.</li>
	<li>Mit einer Standardzelle Zähler, zählen Sie und notieren Sie die Anzahl der vertraglich vereinbarten (Phase-dunkel, geschwenkten) und außertariflichen Zellen pro jedes Feld erfasst. Hinweis: Es empfiehlt sich, zwei Forscher unabhängig zählt der kontrahierten und außertariflichen Zellen pro Feld nehmen, oder alternativ der gleichen Forscher kann zählen die gleichen Bildfeld von Zellen dreimal, ermöglicht eine durchschnittliche Anzahl von beauftragt und außertariflichen Zellen pro Feld berechnet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie mehrere Con-A-beschichtete Glasboden Gerichte pro versuchsbedingung, wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Pipette auf und ab der Zellkulturmedium lose anhaftenden S2R +: Sqh-EGFP-Zellen zu vertreiben und sie Platte, so dass sie 50 % - 70 % Zusammenfluss in der 35-mm-Glasboden-Gerichte sind. Lassen Sie die Zellen, die für 30-45 Minuten zu befestigen.</li>
	<li>S2R +: Sqh-EGFP Bildzellen live über einen Spinning-Disk, fegte Feld confocal Mikroskop oder durch Licht-Blatt Mikroskopie über 60 X - 100 X Vergrößerung. Entfernen Sie den Schild und Sang M3 Medium aus der Glasboden-Schale mit angehängten S2R +: Sqh-EGFP-Zellen.<ol>
<li>Durchspülen der vorgegebenen Verhältnis von Nebel-Myc konditionierten Medium, frische Schild und Sang M3 Medium von Schritte 5.2-5.5 direkt auf der Glasanteil der Glasboden-Schale mit einer Pipette vorsichtig, um nicht zu stören die Position des Gerichts auf das Ziel. Bilder für 12-15 min zu erwerben, um die Initiierung und vollständige Kontraktion der S2R +: Sqh-EGFP Zellen zu erfassen. Hinweis: Wenn für nicht-Muskel Myosin oder Myosin-Missbrauchsfälle Färbung, ist die Bildung eines engen Myosin-Ring an der Oberfläche der Zellen auch bezeichnend für Kontraktilität. Wenn imaging S2R +: Sqh-EGFP Zellen Leben, RLC EGFP-Tags bilden ähnliche fest (siehe Abbildung 3) indikativ der Kontraktilität klingelt. Formänderung, die auftritt, werden die Zellen, die "Mütze", verursachen 3D-Form aufnehmen; die Fokusebene des Mikroskops müssen möglicherweise angepasst werden, um diese Zelle Formänderung zu verfolgen. Unter RNAi-Bedingungen zu steuern, in der Regel 30-50 % der Zellen durchlaufen Verengung auf die Zugabe von Nebel. Beachten Sie, dass einige RNAi-Bedingungen zu Verengung in der Abwesenheit der Nebel führen können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für einen zellbasierte Kontraktilität-Assay mit einer Drosophila Gewebekultur Zelllinie (S2R +-Zellen), die nicht-Muskel Myosin II Verengung als Reaktion auf Nebel erfährt Signalisierung. Dieser Test eignet sich für die Untersuchung der Nebel Weg, als auch die Mechanismen, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität regulieren.
Zelle-Kultivierung Überlegungen: Die Bedingungen, unter denen S2R + Zellen erhalten bleiben, ist entscheidend für verlässliche Daten aus diesem Test zu erreichen. Wenn Sie planen, führen Sie die Kontraktilität-Assay, es am besten, S2R +-Zellen in Schild und Sang M3 Insekt Medium beizubehalten. Während in anderen Insekten Zellkulturmedien S2R + Zellen gedeihen können (z.B.SF900 oder Schneiders Insekt Medium), verlieren sie oft ihre Reaktionsfähigkeit, Nebel. S2R + Zellen, die eine hohe Passagenanzahl, in der Regel mehr als 20-25 Passagen, anfangen, Empfindlichkeit, RNAi verlieren. Es empfiehlt sich, frühe Passage Zellen für alle Experimente verwenden. Ein weiterer wichtiger Aspekt für RNAi Erschöpfung Experimente ist die Auswahl geeigneter Kontrollen. Gemeinsamen Negativkontrollen gehören DsRNA targeting EGFP oder pBlueScript, weder die Homologie zu fliegen Genom haben. Ausrichtung auf Proteine in dem Nebel Weg (Rho, Rok, etc.), die, wenn aufgebraucht, zu verhindern, dass die Aktivierung der nicht-Muskel Myosin Kontraktilität, sind auch nützliche Steuerelemente. S2:Fog-Myc Zellen können in eine alternative Zellkulturmedium wie SF900 mit 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt und 0,25 Amphotericin B. Beachten Sie, dass FBS ist nicht erforderlich, wenn Zellen in SF900 zu züchten. Zelldichte ist auch eine wichtige Komponente, um alle Aspekte der Drosophila Gewebekultur Zellen. Im Gegensatz zu Säugetieren Gewebekultur Zellen, Drosophila-abgeleitete Gewebekultur Zellen gedeihen am besten unter höhere Zelldichten (dichten nicht niedriger als 5 x 105 Zellen/mL). Es ist jedoch bei der Durchführung dieser Assay entscheidend, dass die Zellen nicht auf Con-A-beschichtete Glasboden Gerichte über 80 % Zusammenfluss, vernickelt sind wie die Quantifizierung der vertraglich vereinbarten versus nicht-Vertrag Zellen extrem langweilig wird.
Kritische Aspekte und Alternative Ansätze des zellulären Kontraktilität Tests: Die Produktion von Nebel, die Liganden, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität auslöst ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Assay. Das Nebel -Gen kodiert ein Protein von 730 Aminosäuren mit einem prognostizierten Molekulargewicht ~ 78 kDa26. Heilkräfte Analyse ergab eine Strecke von 12 hydrophoben Überreste im Nebel der amino-Terminus, die als eine Sekretion Signalsequenz funktionieren könnte. Darüber hinaus enthält die kodierende Sequenz auch mehrere Standorte für mögliche N und O verbunden Glykosylierung, weitere hindeutet Nebel ein sekretierten Proteine26ist. Zur Unterstützung wurde Nebel zu sekretorischen Vesikel in mutmaßlichen Epidermiszellen in der apikalen Verengung16lokalisiert. Nebel-Myc Ausdruck wurde nach Zugabe von Kupfersulfat auf das Medium induziert und Antikörper gegen Nebel oder Myc erkannt, ein 150-kD-Protein aus Kulturmedium geerntet von induzierten Kulturen aber nicht von induzierten Medien aus S2-Zellen fehlt die Nebel-Myc-Konstrukt. Das Molekulargewicht war höher als die prognostizierten 80-kD Molekulargewicht von Nebel und deutet darauf hin, dass die sekretorische Maschinerie der S2-Zellen Glycosylate das Protein vor Exozytose kann. Aufgrund der möglichen Variabilität im Nebel Reinigung empfiehlt es sich, die gleiche Charge von Nebel bedingt Medien für alle Experimente verwenden. Aus denen große Chargen von konzentrierter Nebel-Myc Medien helfen dabei, die Konsistenz in Runden von Experimenten.
Der Erfolg dieser Assay hängt auch davon ab, selbstbewusst Identifizierung von Zellen, die Einschnürung unterzogen wurden. Während verengte Zellen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, beobachtet werden können, durch Färbung für Aktin und Myosin-Muskel II, ist der zuverlässigste Weg zu identifizieren und quantifizieren verengte Zellen durch Phasenkontrast- oder DIC Mikroskopie. Genaue Anzahl lässt sich mit 20 X - 40 X Vergrößerung auf die gängigen Lichtmikroskopen. Obwohl das Protokoll geschrieben hier Glasboden-Gerichte verwendet wird, kann der Test auch durchgeführt werden mit standard 1,5 Glasdeckgläser beschichtet mit Con A. Die Zugabe von Nebel kann in 35 mm der Gewebekultur auf einem deckgläschen legte auf Parafilm, um die Begrenzung der Nebel verwendet für jedes Assay erfolgen. Die Qualität der Fixierung ist eine wichtige Komponente des Assays, da schlecht feste Zellen zu Fehlalarmen führen können. Mit frischen Fixierung Lösung und sicherstellen, dass werden nie trocken Zellen einmal festgesetzt zu zuverlässigere Ergebnisse führen. Zu guter Letzt ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen zu zählen. In der Regel nur 30 % - 50 % der unbehandelten oder Kontrolle RNAi-behandelten Zellen verengen im Anschluss an die Perfusion der Nebel. Allerdings gibt es eine basale Ebene der Verengung, die in S2R + Zellen, auftritt, so dass eine große Anzahl von Zellen benötigt wird, um sicherzustellen, dass jede Änderung in der Fraktion der verengten Zellen durch Behandlungen. Darüber hinaus kann die Erschöpfung von einigen Proteinen beteiligt an der Regulation des nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität zu hyper-Kontraktilität, auch in Abwesenheit von Nebel führen. Die hier vorgestellten Daten ist von mehr als 3.600 Zellen, die in drei aufeinander folgenden RNAi-Behandlungen mit der gleichen Charge von Nebel bedingt Medien gezählt wurden.
Anwendungen des zellulären Kontraktilität Tests: Dieser Assay Kontraktilität, gekoppelt mit RNAi screening-Verfahren, bietet ein leistungsfähiges System zur Untersuchung von Zelle signalisieren, Morphogenese und zelluläre Kontraktilität. Zuvor hat zur, einer der zwei Nebel Co-Rezeptoren21verwendet. Ein gezielte Bildschirm von 138 G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) durch RNAi in S2R + Zellen leer ist, und seine Fähigkeit zur Reaktion auf Nebel wurde untersucht, wie in dem hier vorgestellten Protokoll beschrieben. Von den 138 GPCRs, ein einziges, wurde zuvor fußgelenkes gen, jetzt bekannt als Nebel, aufgedeckt. Weitere Untersuchung über die Funktion der Nebel zeigte, dass nicht nur es für Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität in S2R +-Zellen bedurfte, aber es auch wichtig für Gastrulation war bei der Entwicklung von Drosophila21. Darüber hinaus wurde dieser Assay verwendet, um nachzuweisen, dass Ric-8, ein nicht-kanonischen GEF ist auch ein Bestandteil im Nebel Weg27-Signalisierung. Eine Reihe von Epistasis RNAi Experimenten gepaart mit der Kontraktilität Test gezeigt, dass Ric-8 mit der Gα-12/13 -Untereinheit Cta und Funktionen interagiert, die es innerhalb der Zelle zu lokalisieren ist entscheidend für die Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität31 .
Drosophila Gewebekultur eignet sich gut für Anfänger, wie die Zellen sind bei Raumtemperatur leicht zu pflegen, keine CO2 benötigen oder Zellkulturmedium gepuffert und sind robust, solange die richtige Zelldichten Kultur gepflegt werden. Die zelluläre Kontraktilität-Assay wurde erfolgreich von der Labor-Sektion eines Bachelor Zelle Biologie Kurs durchgeführt wo die Studenten wenig bis gar keine Erfahrung mit der Kultivierung von Zellen oder Mikroskopie hatten. Der zellulären Kontraktilität Test hier vorgestellten stellt ein leistungsstarkes, Zell-basierte Tool, das in Gen Entdeckung eingesetzt werden kann, oder um den Nebel Signalweg zu verhören, hilft uns besser zu verstehen, Entwicklungsprozesse wie apikalen Verengung und nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität, im Allgemeinen.

Studien der Embryogenese genetische Modellorganismen durchgeführt haben bewiesen von unschätzbarem Wert für unser Verständnis der wie Zellen zu Geweben zusammengesetzt werden. Studien von Drosophila Melanogaster, führten insbesondere die Identifizierung von schlüsselgene und biologische Prinzipien, die die Morphogenese leiten und Entwicklung von Organismen von der Befruchtung bis ins Erwachsenenalter1,2 , 3. parallel zu den genetischen Forschungen mit Drosophila, kultivierten Zelllinien aus Fruchtfliege Gewebe entstanden auch als ein leistungsfähiges System, ein breites Spektrum von molekularen und Zelle biologische Fragen4, 5 , 6. Drosophila Gewebekultur Zellen haben minimale Anforderungen für die Wartung, da sie kultivierten bei Raumtemperatur und ohne CO2. Als solche sind sie offen für hochauflösende Bildgebung, und sie haben eine hohe Anfälligkeit für gen-Hemmung durch RNAi6,7. Viele Gruppen haben Drosophila Gewebekultur Zellen als Werkzeug benutzt, um Gene, die bei der Festlegung der Zellform, Zellskelett Dynamik, Rentabilität, Phagozytose und Signal Transduction Bahnen4,8zu entdecken, 9,10,11. Wenn als Modell neben das ganze Tier beschäftigt, bieten kultivierte Drosophila -Zell-Linien eine Reihe von sehr komplementäre Ansätze, die die Identifizierung von Molekülen, die wichtig für die Entwicklung zu beschleunigen und einen Rahmen, um bestimmen Sie ihre mechanistischen Rollen12. Hier beschreiben wir eine zellbasierte Assays um die Signalwege zu studieren, die apikale Verengung über gefaltet Gastrulation (Nebel) Weg13,14auslösen. Kontraktilität zellbasierte Assays kann Forscher untersuchen sowohl der Nebel Signalisierung Weg und die molekularen Mechanismen, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität regulieren.
Gastrulation des frühen Embryos von Drosophila ist seit vielen Jahren als genetische Vorbild für die epithelialen Morphogenese und der zellulären Übergang von epitheliale Mesenchymale Zellen Identität untersucht worden. Eines der wichtigsten Ereignisse der Gastrulation ist die Morphogenese einer Teilmenge von epithelialen Zellen entlang der embryonalen ventralen Mittellinie von säulenförmigen, pyramidale Form15,16,17,18. Diese einfache Zellform Änderung führt zu die Internalisierung der mutmaßlichen mesodermalen Zellen und wird angetrieben von der motorischen Aktivität der nicht-Muskel Myosin II einengenden Aktin Netzwerk16,19,20. Jahrzehnte der Genforschung hat die molekularen Bestandteile dieser Signalweg identifiziert und hat gegenüber dem Vorquartal legte sie in der folgenden Reihenfolge: 1) Nebel wird abgesondert von der apikalen Domäne der epithelialen Zellen an der ventralen Mittellinie; (2) Nebel bindet an die G-Protein-gekoppelten Co-Rezeptoren, Nebel und Smog, und signalisiert durch eine Heterotrimeric G-Protein Komplex mit der Gα-12/13 -Untereinheit Konzertina (Cta), die von der nicht-kanonischen GEF Ric-8 begleitet ist; (3) Cta aktiviert einen Guanin-Nukleotid Austausch Faktor, RhoGEF2, die wiederum die kleinen G-Protein-Rho1 aktiviert; (4) Rho1 aktiviert Rho-Kinase (Rok); (5) Rok aktiviert-Muskel Myosin II Kontraktilität der apikalen Domäne durch Phosphorylierung des regulatorischen Leichtketten (RLC), wodurch apikalen Verengung (Abbildung 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationen in mehreren dieser Komponenten stören die normale Gastrulation und anderen morphogenetischen Bewegungen, einschließlich der Bildung der Flügel Scheibe und Speicheldrüsen, darauf hinweist, dass dieser Weg in mehreren Stadien von Drosophila verwendet wird Embryogenese30,31,32. Der Nebel Weg ist eines der am besten untersuchten Modelle für die Gestaltung der epithelialen und lieferte wichtige Erkenntnisse wie Gewebe-Ebene Morphogenese wird geregelt von Gentranskription Zelle cytoskelett-gesteuerte Bewegungen14,15 ,21.
Wir entwickelten einen zellbasierte Kontraktilität-Assay, der viele von den zellulären Reaktionen flussabwärts der Nebel rekapituliert, die bei der Entwicklung von Fly Embryonen17beobachtet wurden. Wir entwickelten eine stabile S2 Zelllinie, die Nebel drückt in seiner C-Terminus mit Myc unter der Kontrolle eines induzierbaren Metallothionine Promotors markiert, die auf den Zusatz von Kupfersulfat (CuSO4) auf das Medium geerntet werden kann. Wenn Nebel bedingt Medien ectopically auf S2 Rezeptoren + (S2R) Zellen,, die eine Subline der S2-Zellen zeichnen sich durch ihre differentielle Expression der Rezeptoren wie Frizzled und Integrin-Untereinheiten angewendet werden, die Zellen durchlaufen eine Reorganisation der Zytoskelett erinnert stark von apikalen Verengung12,17,27,33. Diese Veränderungen können beobachtet werden, indem Phasenkontrast-Mikroskopie in dem Nebel Behandlung führt zum Auftreten von Phase-dunkel Rüschen bezeichnend für eine Erhöhung der radialen in nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität oder Fluoreszenz-Mikroskopie, wo Nebel Behandlung führt zu, den Bildung von nicht-Muskel Myosin II Ringe in Zellen EGFP getaggt RLC34zum Ausdruck zu bringen. Diese Ringe enthalten ein Myosin-phosphoryliert regulatorische leichte Kette (Missbrauchsfälle) sichtbar über Immunostaining23,34,35. Dieser Nebel-induzierte Reaktion erforderlich Cta, RhoGEF2, Rho und Rok; mit rekombinanten Nebel-Myc und S2R +-Zellen, haben wir somit ein Mittel zur Untersuchung von Nebel-induzierte Verengung in einem Gewebe-Kultur-basiertes System24,25,34etabliert.

<table><tbody><tr><td>S2R+ Zellen</td><td>Drosophila Genomics Resorce Center&nbsp;</td><td>150</td><td>Zellkulturlinie, zeigt Kontraktilität bei Behandlung mit Fog</td></tr><tr><td>S2:Fog-myc-Zellen</td><td>Drosophila Genomics Resorce Center&nbsp;</td><td>218</td><td>Zellkulturlinie, produziert Fog-myc unter dem pMT-Promotor</td></tr><tr><td>S2R+ :Sqh-EGFP-Zellen</td><td>Drosophila Genomics Resorce Center&nbsp;</td><td>196</td><td>Zellkulturlinie, exprimiert stabil Sqh(RLC von Nicht-Muskelmyosin II), markiert mit EGFP</td></tr><tr><td>Shield und Sang M3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>SF900 Insektenmedium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12658019</td><td>alternatives Zellcutlure-Medium</td></tr><tr><td>Schneider' Insektenmedium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21720024</td><td>alternatives Zellsubstrat</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisch (100X)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15240112</td><td>antimikrobielles/antifugales Medienzusatz</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td>zum Überziehen von Geschirr und Deckglas für die Zelladhäsion</td></tr><tr><td>Glasbodenplatten</td><td>Maktek</td><td>P35G-1.5-10</td><td>zum Assay und zum Fixieren und Färben von Zellen</td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>Corning</td><td>2940-225</td><td>Alternative zu Glasbodenschalen</td></tr><tr><td>Proteinkonzentratoren</td><td>Millipore</td><td>UFC903008</td><td>30.000 Molekulargewichts-Cutoff, zur Konzentration von Medien</td></tr><tr><td>25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 Gewebekulturkolben</td><td>Genessee</td><td>25-204,25-206,25-208,25-210</td><td>zur Kultivierung von Zellen</td></tr><tr><td>6-Well- und 12-Well-Gewebekulturschalen</td><td>Genessee</td><td>25-105, 25-106</td><td>zur Kultivierung von Zellen</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>zur Konservierung fixierter Zellen</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>zur Fixierung von Zellen</td></tr><tr><td>Rohre</td><td>EMS</td><td>19240</td><td>zur Verwendung in PEM-Puffer für Zellen Fixierung</td></tr><tr><td>Anti-Myc Antikörper</td><td>Drosophila Hybirdoma Bank</td><td>Kat# 9E10</td><td>zur Detektion von Fog-Myc&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphoSerin-19 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>3671</td><td>Antikörper gegen phosphoryliertes regulatorisches Leichtkettenserin (RLC) Serin 19</td></tr><tr><td>488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A12379, A12380</td><td>zur Färbung für f-Aktin</td></tr><tr><td>Hawk-VT Multipoint-Array-Scanning-Konfokalsystem&nbsp;</td><td>VisiTech International</td><td></td><td>Wird für die Lebendzell-Bildgebung von S2R+:Sqh-Zellen verwendet</td></tr><tr><td>Eclipse TE300 Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wird für die Lebendzell-Bildgebung von S2R+:Sqh-Zellen verwendet</td></tr></tbody></table>

eine zellbasierte assays-muskel myosin ii kontraktilität über die gastrulation gefaltet signalisierung pathway in drosophila s2r + zellen untersuchen

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Wir haben eine zellbasierte Assays mit Drosophila -Zellen entwickelt, die apikale Verengung initiierten gefalteten Gastrulation (Nebel), ein sekretierten epithelialen gestaltbildenden rekapituliert. In diesem Test wird Nebel als Agonist verwendet, um Rho durch eine Signalkaskade zu aktivieren, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (Nebel), ein Gα-12/13 -Protein (Konzertina/Cta) und ein PDZ-Domänen-haltigen Guanin-Nukleotid Exchange Faktor (RhoGEF2) enthält. Nebel, die Ergebnisse in der schnellen und dramatischen Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts bilden eine KONTRAKTILE Geldbörse Zeichenfolge signalisieren. Lösliche Nebel ist eine stabile Zelllinie abgeholt und ectopically auf S2R + Zellen, führt zu morphologischen Veränderungen wie apikalen Verengung, ein Prozess zu beobachten, während Entwicklungsprozesse wie Gastrulation angewendet. Dieser Assay ist zugänglicher Hochdurchsatz-Screening und mit RNAi, kann die Identifizierung von zusätzlichen Genen, die in diesen Weg erleichtern.

S2 und S2:Fog-Myc Zellen konfluierende Bedingungen in einem 150-cm2 Gewebekultur Kolben in der Nähe von gewachsen waren und mit 25-75 µM CuSO4 behandelt wurden, über einen Zeitraum von 24-48 Stunden induzieren die Expression von Nebel-Myc (Abbildung 2). Proben aus S2-Zellen (Abb. 2A) und S2:Fog-Myc Zellen (Abbildung 2B) wurden entfernt und Nebel-Myc Produktion von western-Blot überwacht wurde. Wie erwartet, konnten wir erkennen, Nebel-Myc in Medien aus S2-Zellen unter allen Bedingungen geerntet. Jedoch wir Nebel erkennen, in den Medien von der S2:Fog geerntet-Myc stabile Zelllinie bereits 24 Stunden nach der Induktion mit 75 µM CuSO4. S2R + Zellen zu Con-A-beschichtete Glasboden-Gerichten eine EGFP-Tags regulatorische leichte Kette (GFP-RLC) von nicht-Muskel Myosin II (Abbildungen 3A und 3 b) zum Ausdruck zu bringen. Live Cell Imaging erfolgte auf einem inversen Mikroskop, ausgestattet mit einem 100 X / 1.4 NA Objektiv während der Perfusion der Nebel bedingt Medien. Ca. 5 Minuten nach der Behandlung mit Nebel-Myc, gebildet die RLC Ringe bezeichnend für nicht-Muskel Myosin II Verengung. Diese Ringe können durch Immunostaining S2R +-Zellen mit einem Antikörper gegen eine synthetische Phosphopeptide entsprechende, Rückstände, die rund um die Ser19 der menschlichen Myosin RLC (Abbildungen 4A und 4 b) beobachtet werden. Dieser Antikörper cross-reacts mit Drosophila RLC.
Hier haben wir ein repräsentatives Beispiel für die zelluläre Kontraktilität Assay nach einer 7-Tage-Behandlung der Zellen mit Kontrolle RNAi und DsRNA gegen Rho1 (Figuren 5A - 5E). S2R +-Zellen wurden auf dem Con-A-beschichtete Glasboden-Geschirr verchromt und mit Nebel bedingt behandelt (+ Nebel) Medien oder Kontrolle (-Nebel). Die Anzahl der vertraglich vereinbarten Zellen wurden dann nach Fixierung quantifiziert. Der Phase-dichten Rüschen indikativ Verengung war erschöpft Kontrollzellen mit Nebel-konditionierte Medien (Abb. 5B) behandelt. In Abbildung 5Csind Rho-abgereicherte Zellen mit S2 konditioniertes Medium behandelt ein typisches Beispiel für glatten Kanten, gebraten-Ei-wie Morphologie. Beachten Sie, dass Rho eine Rolle in der Nebel-Signalweg sowie in zytokinese spielt; so, Rho-abgereicherte Zellen oft nicht richtig teilen, führt zu einer Zunahme der Zellgröße und Diploidie. Behandlung des Steuerelements erschöpfte Zellen mit Nebel-konditionierte Medien typische führt bis 30 % - 50 % der Zellen in der Verengung, während wir es versäumt, die erhebliche Einengung in Rho erschöpft Zellen zu beobachten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> Abbildung 1:der vermeintlichen Nebel Signalweg. In Ermangelung von Nebel, der Gα-12/13 -Untereinheit, Konzertina (Cta), zusammen mit seinen Bindungspartner, Gϒ und Gβ, inaktiv sind und im Zusammenhang mit der Co-Rezeptoren Nebel und Smog. Ric-8 Begleitpersonen Cta und regelt seine subzelluläre Lokalisation. Bei Nebel verbindlich, Cta distanziert von Gϒ und Gβ Rekruten RhoGEF2 an der Zellmembran, wo es den Austausch des BIP für GTP in die kleine GTPase Rho1 katalysiert. GTP-gebundenen Rho1, jetzt aktiv aktiviert Rho-Kinase (Rok), die die RLC von nicht-Muskel Myosin führt zu seiner Aktivierung und anschließende zelluläre Kontraktilität phosphorylates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> Abbildung 2 : Zeitlicher Verlauf der Nebel-Myc Produktion. Diese Tafeln zeigen Zellkulturmedium geerntet von einem in der Nähe von 100 % konfluierende Kolben (A) Kontrollzellen S2 oder (B) S2:Fog-Myc stabile Zellen. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 24-48 Stunden mit 25-75 µM CuSO4 behandelt. Das Zellkulturmedium wurde gesammelt und vorbereitet für SDS-PAGE und westliche Beflecken. Nebel-Myc wurde durch einen Anti-Myc-Antikörper festgestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> Abbildung 3 : Live Cell Imaging Nebel-induzierte Verengung. Stabile S2R + Zelllinien EGFP getaggt RLC von nicht-Muskel Myosin II wurden durch fegte Bereich konfokalen Mikroskopie abgebildet, während die Perfusion der Nebel bedingt Medien zum Ausdruck zu bringen. Zeit wird in Minuten und Sekunden angezeigt. (A) dieses Panel zeigt ein Bild von einem Brennebene in der Nähe der Zelle-Deckglas Schnittstelle zum Zeitpunkt 0:00 Uhr bevor die Perfusion der Nebel-Myc. (B) dieses Panel eine Zeitreihe zeigt (0:30-10:00) von Aufnahmen mit einer Brennebene am oberen Rand der Zelle. Die weißen Pfeile zeigen die Reorganisation der nicht-Muskel Myosin II von EGFP-RLC in kontraktilen Ringe während Verengung angegeben. Der Maßstab ist 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> Abbildung 4 : Phosphoryliert RLC lokalisiert an kontraktilen Ringen nach Induktion der Verengung durch Nebel-Myc. S2R +-Zellen wurden behoben und gebeizt für Actin mit Phalloidin (rot), phosphorylierten RLC mit einem Phosphoserine-19-Antikörper (grün) und DAPI (DNA, blau), nach der Behandlung mit (A) oder (B) Nebel Myc-konditioniertes Medien. Beachten Sie die Reorganisation der phosphorylierten RLC in Ringe auf den Zusatz von Nebel-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> Abbildung 5 : Repräsentative Quantifizierung des Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität Assays. S2R +-Zellen wurden mit (A und B) Kontrolle RNAi oder (C und D) DsRNA gegen die kleine GTPase Rho1 für 7 Tage behandelt. Nach dieser Zeit die Zellen wurden auf dem Con-A-beschichtete Glasboden-Geschirr verchromt und mit (A und C) Kontrolle oder (B und D) Nebel Myc-konditioniertes Medien behandelt wurden. Die Skala bar stellt 10 µm. (E) A Streudiagramm zeigt Mittelwert und 95 % Konfidenzintervall für den Bruchteil des vertraglich vereinbarten Zellen pro Zustand. Einzelne Punkte stehen für den Bruchteil des vertraglich vereinbarten Zellen pro Gesichtsfeld bei 40 X Vergrößerung (10-120 Zellen pro Feld) und die Zahlen in Klammern geben, dass die Gesamtzahl der Zellen für die vertraglich vereinbarten und nicht vertraglich Zellen über drei Separate gezählt RNAi-Experimente. Sternchen bezeichnen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen RNAi-Nebel-behandelt und Bedingungen, die durch einfache ANOVA (p &lt; 0,0001) mit Tukey mehrere Vergleich post Hoc Analyse. Beachten Sie, dass gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied (n.s.) zwischen Rho1 RNAi-behandelten Proben mit Steuerung oder mit Nebel-Myc-konditionierte Medien behandelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir einen Kontraktilität Assay mit Drosophila S2R + Zellen. Die Anwendung einer exogenen Liganden, gefalteten Gastrulation (Nebel), führt zur Aktivierung des Nebels weg und zellulären Kontraktilität-Signalisierung. Dieser Test kann verwendet werden, um die Regulierung der zellulären Kontraktilität Proteine im Signalweg Nebel zu untersuchen.

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche Proteine an der Regulation der Nicht-Muskel-Myosin-II-Kontraktilität beteiligt sind und welche Proteine für den gefalteten Gastrulations- oder Nebelsignalweg von entscheidender Bedeutung sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der zelluläre Kontraktilitätsassay in Verbindung mit der RNEI-Depletion als Werkzeug für die Genentdeckung von Proteinen verwendet werden kann, die an der Fog-Signalübertragung und der Nicht-Muskel-Myosin-II-Kontraktilität beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf unser grundlegendes Verständnis von Entwicklung.Die Nicht-Muskel-Myosin-II-Kontraktilität ist allgemein entscheidend für die Veränderung der Zellform oder Morphogenese, die während der Entwicklung auftritt. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung von Drosophila geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, da sie für eine ganze Reihe anderer zellulärer Funktionen von entscheidender Bedeutung ist. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, die richtige Zelldichte zu erhalten und den Unterschied zwischen kontrahierten und nicht kontrahierten Zellen zu erkennen.Beschichten Sie zunächst den Glasteil von 35-Millimeter-Schalen mit Glasboden mit 200 Mikrolitern con-A-Lösung. Inkubieren Sie die Schalen etwa zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Gewebekulturhaube. Entfernen Sie danach die con-A-Lösung und lassen Sie das Geschirr vollständig an der Luft trocknen.Geben Sie etwa zwei Milliliter frisches Zellkulturmedium in jede der Glasschalen. Resuspendieren Sie dann die S2R+-Zellen, indem Sie das Zellkulturmedium auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die resuspendierten S2R+-Zellen in die vorbereiteten Glasbodenschalen.Überprüfen Sie dann die Zelldichte unter einem Gewebekulturmikroskop, indem Sie durch mehrere Zellebenen nach oben und unten fokussieren. Die Bestimmung der anfänglichen Zelldichte ist entscheidend. Zu wenige Zellen erschweren die Quantifizierung, und zu viele Zellen machen die Quantifizierung mühsam.Verwenden Sie das Mikroskop, um die Schale nach oben und unten zu fokussieren, um die Anzahl der Zellen zu schätzen. Lassen Sie dann die Zellen 45 bis 60 Minuten lang an den con-A-beschichteten Glasbodenschalen ansetzen. Pipettieren Sie zunächst vorsichtig, um das gesamte Zellkulturmedium von den angehängten S2R+-Zellen zu entfernen.Fügen Sie dann vorsichtig 75 Mikroliter frisches Medium hinzu. Geben Sie als Nächstes 75 Mikroliter nebelkonditioniertes Medium in den Glasteil der Schale. Überwachen Sie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie bei 20- oder 40-facher Vergrößerung die Kontraktilität eines gesamten Zellfeldes.Verfolgen Sie die Morphologie der Zellen auf das abwechselnde Muster von Phasen-Dunkel- und Hell-Kräuseln, das für Formänderungen charakteristisch ist. Die korrekte Identifizierung von Zellen, die sich in einer Kontraktion befinden, kann beim ersten Mal schwierig sein. Wenn sich die Zellen zusammenziehen, bilden sich Phasendunkel- und Lichtkräuselungen, die die Zelle wie einen Starburst erscheinen lassen.Fixieren Sie die S2R+-Zellen mit einer 10%igen Paraformaldehydlösung. Entfernen Sie dann mit einer Pipette das Zellkulturmedium aus den nebelbehandelten S2R+-Zellen und ersetzen Sie es durch 1,5 bis zwei Milliliter der Paraformaldehydlösung. Inkubieren Sie sowohl die S2R+-Zellen als auch die nebelbehandelten S2R+-Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um die Paraformaldehydlösung zu entfernen, und entsorgen Sie den Abfall ordnungsgemäß. Spülen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS, um alle Reste der Fixierungslösung zu entfernen. Blockieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 5%normalem Ziegenserum in PBS, ergänzt mit 0,1%PBST für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper in PBST mit einem Volumen von etwa 200 Mikrolitern, um den Glasteil der Schale vollständig zu bedecken. Verwenden Sie eine Pipette, um die Blockierungslösung zu entfernen, und geben Sie die primäre Antikörperlösung direkt in den Glasteil der Schale. Dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.Entfernen Sie danach mit einer Pipette die primäre Antikörperlösung und spülen Sie die Zellen dreimal mit frischem PBS aus. Zur Herstellung der Sekundärantikörperlösung verdünnen Sie den Sekundärantikörper in PBST. Geben Sie dann die sekundäre Antikörperlösung direkt in den Glasteil der Schale.Inkubieren Sie das Gericht eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie danach mit einer Pipette die Sekundärantikörperlösung und spülen Sie die Zellen dreimal mit frischem PBS aus. Fügen Sie dann ausreichend fluoreszierendes Eindeckmedium hinzu, um den Glasteil der Schale abzudecken.Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Verwenden Sie zunächst eine 20-fache oder 40-fache Vergrößerung, um 10 bis 30 nicht überlappende Bildfelder der festen Zellen zu erfassen. Verwenden Sie schließlich einen Standard-Zellzähler, um die Anzahl der kontrahierten und nicht kontrahierten Zellen in jedem der erfassten Felder zu zählen und aufzuzeichnen.Unter Verwendung dieses Protokolls wurden S2- und S2-Nebelmyc-Zellen gezüchtet und mit Kupfersulfat behandelt, um die Expression von Nebelmyc zu induzieren. Es überrascht nicht, dass Nebel-Myc in den S2-Zellen unter keinen Umständen nachgewiesen werden konnte. Nebel wurde jedoch bereits 24 Stunden nach der Induktion mit Kupfersulfat in Medien nachgewiesen, die aus der S2-fog-myc-stabilen Zelllinie gewonnen wurden.Etwa fünf Minuten nach der Behandlung mit fog-myc bildete das RLC Ringe, die auf eine nicht-muskuläre Myosin-II-Verengung hindeuteten. In einem repräsentativen zellulären Kontraktilitätsassay waren die phasendichten Rüschen, die auf eine Verengung hindeuteten, bei kontrollarmen Zellen, die mit nebelkonditionierten Medien behandelt wurden, ausgeprägt. Rho-depletierte Zellen, die mit S2-konditioniertem Medium behandelt wurden, zeigten eine typische glattkantige Spiegelei-ähnliche Morphologie.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich an die Zeit zu erinnern, und die Qualitätsfixierung ist wichtig. Nach 10 Minuten beginnen sich die Zellen zu entspannen, so dass die Zellen vor diesem Zeitpunkt fixiert sein sollten. Schlechte Fixierungsbedingungen können zu falsch positiven Ergebnissen führen.Mit diesem Assay identifizierten die Forscher Nebel, einen der beiden Nebel-Korezeptoren. Dieser Assay wurde auch verwendet, um die Rolle von Rigat während der Nebelsignalisierung besser zu verstehen.

a-cell-based-assay-to-investigate-non-muscle-myosin-ii-contractility

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen (Video) | JoVE Journal

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

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