Herstellung von anisotropen Polymeren künstliche antigenpräsentierende Zellen für CD8 + T-Zell-Aktivierung

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Amino-Engineering zu beantworten. Wie ist, was ist die Rolle der partikelphysikalischen Eigenschaften auf Biomaterial Immunzell-Wechselwirkungen und Aktivierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine unabhängige Kontrolle der Größe und Form von biomimetischen Partikeln ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Krebs, da es sich um eine off-the-shelf Partikeltherapie, die in vivo Zell vermittelte Immunantworten verursachen kann. Obwohl diese Methode Einblick in Krebs-Aminotherapie bieten kann, Kann es auch auf andere Systeme angewendet werden. Wie Infektionskrankheiten oder Typ-1-Diabetes.

Für die Mikropartikelsynthese beginnen sie mit dem Auswägen von 100 Milligramm Poly(Milch-Co-Glykolsäure) oder PLGA, in eine Szintillationsdurchstechflasche und lösen Sie die PLGA in fünf Milliliter Dichlormethan durch Wirbeln auf. Legen Sie einen Homogenisator in ein Becherglas, das 50 Milliliter 1%Polyvinylalkohol oder PVA-Lösung enthält, so dass der Homogenisator so nah wie möglich am Boden des Becherkers ist, ohne ihn zu berühren. Schalten Sie den Homogenisator auf die entsprechende Geschwindigkeit ein und fügen Sie die PLGA-Lösung für eine Minute Homogenisierung in das Becherglas ein.

Am Ende der Homogenisierung den Polyvinylalkohol PLGA Mikropartikellösung in ein Becherglas gießen, das 100 Milliliter 5%PVA-Lösung auf einer Rührplatte in einer chemischen Haube enthält, und die Lösung mindestens vier Stunden rühren. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, gießen Sie die Partikellösung in 50 Milliliter konische Rohre und sammeln Sie die Partikel durch Zentrifugation. Ersetzen Sie den Überstand in jedem Rohr durch 20 Milliliter entionisiertes Wasser und setzen Sie die Partikel durch Wirbel wieder auf.

Dann bringen Sie das Endvolumen in jede Röhre bis zu 50 Milliliter mit frischem enionisiertem Wasser und waschen Sie die Partikel noch zwei Mal, wie gerade gezeigt. Für die Nanopartikelsynthese 200 Milligramm PLGA in fünf Milliliter Dichlormethan auflösen und eine Beschallungssonde in ein Becherglas legen, das 50 Milliliter 1%PVA-Lösung enthält, ohne den Boden des Becherglases zu berühren. Beginnen Sie die Beschallung mit 12 Watt und fügen Sie sofort die PLGA-Lösung für eine zweiminütige Beschallung in das Becherglas ein, um Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 200 Nanometern zu erzeugen.

Nach der Beschallung die 1%Polyvinylalkohol PLGA Nano-Partikellösung in ein Becherglas gießen, das 100 Milliliter 5 PVA-Lösung auf einer Rührplatte für vier Stunden Lösungsmittelverdampfung in einer chemischen Rauchhaube enthält. Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, gießen Sie die Partikellösung in 50 Milliliter konische Rohre für die Zentrifugation, um Mikropartikel zu entfernen und die Überräube zu entfernen. Übertragen Sie dann die Nanopartikel in Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohre für drei Wälwass in entionisiertem Wasser, wie gezeigt.

Für die Polymerpartikelherstellung nach der letzten Wäsche die Partikel in etwa einem Milliliter frischem enionisiertem Wasser wieder aufhängen und den Partikeln eine Filmgießlösung zu einer Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter Hinzufügen geben. Übertragen Sie die Partikelsuspension in 10 Milliliter-Aliquots in 75 mal 50 Millimeter rechteckige Petrischalen für eindimensionale Dehnung. Oder in 15 Milliliter-Aliquots in 100 mal 100 Millimeter quadratische Petrischalen für zweidimensionale Dehnung.

Nach dem überNacht trocknen in einer chemischen Haube, verwenden Pinzette, um die Folien zu entfernen und die Kanten mit einer Schere zu trimmen. Für 1D-Stretching legen Sie die beiden kurzen Kanten eines Films zwischen zwei Stücken Neoprenkautschuk zur Montage auf die Aluminiumblöcke einer Achse einer automatisierten Dünnschicht-Dehnvorrichtung. Dann verwenden Sie einen Allen-Schraubenschlüssel, um die Metallgriffe auf den Gummi zu schrauben, um die Folie an Ort und Stelle zu halten.

Für 2D-Stretching, montieren Sie alle vier Kanten auf vier Aluminiumblöcke, um die Folie auf beiden Achsen zu dehnen messen und die Länge der Folie zwischen den Aluminiumblöcken zwischen den Aluminiumblöcken auf einer Achse für eine D-Stretching oder beide Achsen für 2D-Stretching zu erfassen und berechnen Sie den Abstand erforderlich, um den Film in ein oder zwei Richtungen basierend auf der gewünschten Faltdehnung zu dehnen. Dann legen Sie die Film geladen Stretching-Gerät in einem Ofen bei 90 Grad Celsius neben einem größeren Becher von einer kleinen Menge Wasser, um den Film auf Temperatur über 10 Minuten zu bringen. Wenn die Dehnung abgeschlossen ist, lassen Sie den Film 20 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen.

Für 1D-Stretching den Film an den Rändern aus der Dehnvorrichtung herausschneiden. Für 2D-Stretching, ausschneiden und speichern Sie das mittlere Quadrat der Folie, die gleichmäßig auf beiden Achsen gestreckt ist. Legen Sie die Filme in 50 Milliliter konische Röhren mit nicht mehr als zwei Folien pro Tube und fügen Sie etwa 25 Milliliter entionisiertes Wasser zu jedem Rohr für Wirbel.

Wenn sich die Filme gelöst haben, waschen Sie die Partikel dreimal in enionisiertem Wasser, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche werden die Partikel in etwa einem Milliliter frischem enionisiertem Wasser pro Rohr wieder aufgehängt. Dann frieren die Partikel bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde oder über Nacht Lyophilisierung.

Am nächsten Morgen setzen Sie die lyophilisierten Mikro- oder Nanopartikel mit 20 Milligramm pro Milliliter in einem frisch zubereiteten MES-Puffer mit Wirbel wieder auf. Fügen Sie 100 Mikroliter der Partikellösung in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr mit 900 Mikroliter MES-Puffer hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete EDC NHS-Lösung hinzu. Mischen Sie die Partikel durch Wirbeln und inkubieren Sie die Partikel auf einem Wechselrichter bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

Am Ende der Inkubation die Partikel durch Zentrifugation sammeln und die Mikropartikelpellets in einem Milliliter PBS wieder aufhängen, indem sie die Nanopartikel in einem Milliliter PBS um fünf Sekunden Beschallung bei zwei bis drei Watt wirbeln oder wieder aufhängen. Als nächstes fügen Sie den Mikropartikeln acht Mikrogramm eines geeigneten Signals ein Protein und 10 Mikrogramm Anti-Maus-CD28-Antikörper zu den Mikropartikeln hinzu, oder 16 Mikrogramm des Signals ein Protein und 20 Mikrogramm Anti-Maus-CD28 zu den Nanopartikeln. Bringen Sie das Endvolumen in jeder Röhre mit PBS auf 1,1 Milliliter und inkubieren Sie die Partikel über Nacht auf einem Wechselrichter bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Partikel dreimal in entionisiertem Wasser waschen, wie gezeigt. Diese PLGA-Nano- und Mikropartikel wurden mit den einzelnen Emulsionstechniken synthetisiert, wie sie mit Dertransmissions- und Rasterelektronenmikroskopie demonstriert und abgebildet wurden. Nach der Homogenisierung zeigten die Mikropartikel einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa drei Mikrometern.

Die kugelförmigen Mikropartikel hatten eine Seitenration von etwa einem, während die 1D-gestreckten ellipsoidalen Teilchen ein größeres Seitenverhältnis von etwa dreieinhalb hatten und die 2D-gestreckten oblaten ellipsoidalen Teilchen ein Seitenverhältnis von etwa 1,2 hatten, was ungefähr ein Seitenverhältnis von einem beihielt. Die Ergebnisse der Konjugationseffizienz zeigen die ähnlichen Proteinmengen auf der Oberfläche sphärischer und ellipsoidaler mikrokünstlicher Antigen-Präsentierender Zellen oder AAPC und Nano-AAPC, was zeigt, dass die Proteinkopplung während der AAPC-Synthese in einer konzentrationsabhängigen Weise erfolgt. Prolate ellipsoidale AAPC wurden gefunden, um höhere Konzentrationen der T-Zell-Proliferation in sub-sättigenden Dosen als sphärische AAPC mit der besten Trennung bei einer 01 Milligramm-Dosis erreicht induzieren.

Nach sieben Tagen ergab die manuelle Zählung der T-Zellen, dass ellipsoidales AAPC-Zellen im Vergleich zu ihren sphärischen Gegenstücken im Mikro- und Nanomaßstab dosisabhängiger besser stimulieren. Nach diesem Verfahren kann AAPC in vivo verwaltet werden, um ihre therapeutische Wirksamkeit und Pharmakokinetik zu messen. Nach ihrer Entwicklung half diese Technik, den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immun-Engineering zu ebnen, um die Wirkung der Anisotropie auf die AAPC-Wirksamkeit zu erforschen.