Name: Leber-on-a-Chip Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Liver-on-a-Chip-Kultur primärer Hepatozyten und Kupffer-Zellen für Hepatitis-B-Infektionsstudien. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen in einem physiologischen Mikroumfeld für virologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde von einem Starter Stipendium des European Research Council (637304), ein Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), und CN Bio Innovationen finanziert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der langfristigen Kulturen der PHH haben die Entwicklung der verschiedenen Kultur-Modelle mit erhöhter Funktionalität und Langlebigkeit, jeweils ausstellenden differenzierte vor- und Nachteile vorangetrieben. Es ist jetzt weithin anerkannt, dass statische 2D Kulturen der PHH bestimmte Aspekte der Hepatozyten Biologie für sehr begrenzte Zeit imitiert werden. So Micropatterned cocultures12,13, Sphäroid Kulturen14,15, und 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen16,17 sind diese grundlegenden Systeme ersetzen. Vor allem bei Infektionskrankheiten, die mit ihrem Wirt zu bestimmte Mikroumgebungen nutzen Weiters haben studieren, ist die Voraussetzung für die Bereitstellung von physiologischen Umgebungen durch die oft anspruchsvollen Art der Kultivierung menschlichen-Tropic untermauert. Infektionskrankheiten, einschließlich Hepatitis-C-Viren, HBV und Malaria.
Der wichtigste Schritt bei der Durchführung von 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Qualität der ursprünglich aus der Region Primärzelle Typen. Diese Zellen sollten für ihre Einhaltung Kapazität getestet und nur plateable PHH viele sollte verwendet werden, um erfolgreiche Gewebebildung und Kultur-Generation zu gewährleisten. Obwohl frisch isolierte PHH verwendet werden kann, ihre Kryokonservierung ist in der Regel kompliziert und erfordert spezielle Rate gesteuert Gefriergeräte.
Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen 2D Kulturen Host genetischen Hintergrund ist in Bezug auf Anfälligkeit für HBV-Infektion vernachlässigbar, und alle-bisher getesteten Hepatozyten Spender sind HBV-Infektion4herstellen.
Obwohl Patienten abgeleitet HBV-Infektionen des 3D Kulturen herstellt, ist es unerlässlich, PEG-ausgefällt zu nutzen und Saccharose Kissen-gereinigte HBV wann immer mit induzierbaren HBV-Produzent-Zelle für die Generation der viralen Impfkulturen Zeilen. Zelle Kultur Überstände direkt angewendet, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, sei es durch das Vorhandensein von hemmenden Faktoren oder aufgrund einer Inkompatibilität des vorliegenden Wachstumsfaktoren mit Hepatozyten, führen nicht ohne weiteres Infektion. Darüber hinaus sollte bei der Auswahl der Patienten abgeleiteten viraler Impfkulturen nur Serum verwendet werden, da Plasma unweigerlich gerinnt und die mikrofluidischen Zirkulation der Kultur-Plattform verstopft.
Unabhängig von der viralen Inokulum verwendet ist zelluläre Lebensfähigkeit und Differenzierung zu gewährleisten, sowie eine vollständige Entfernung des ersten HBV Inokulums Schlüssel zum erfolgreichen Infektion Langzeitstudien. Der bequemste Weg, dies zu tun ist nach der Beseitigung der viralen Inokulums sowie die Messung der menschlichen Serum-Albumin Niveaus während der gesamten Kultur Kulturen Probenahme. Der Hinweis, ähnlich wie bei allen anderen beschriebenen Plattformen, HBV-Infektion, einmal etabliert, verbreiten nicht ohne weiteres auf nicht infizierten Zellen. Der zugrunde liegende Mechanismus dafür bleibt schwer fassbar, da HBV-Infektion in-vivo bereitwillig den Großteil der Hepatozyten in der Leber infiziert.
In Bezug auf Kokulturen PHH und Kupffer Zellen ist es ratsam, viel Tests von Kupffer Zellen, IL6 und TNF-Sekretion in Reaktion auf die LPS Stimulation zu bewerten, da nicht alle im Handel erhältlichen Kupffer Zelle Spender eine gleiche Reaktionsfähigkeit haben durchführen.
Wichtig ist, für alle medikamentöse Behandlungen oder erste Kulturen mit HBV-Infektion, muss das Gesamtvolumen des Brunnens (1,4 mL), sowie ab der Mikrofluidik-Kanal (0,2 mL), berücksichtigt werden bei der Berechnung der Droge oder Inoculum Konzentrationen. Um eine genaue Dosierung zu gewährleisten, wird ein Waschschritt mit HBV oder Drogen-haltigem Medium durchgeführt, um den Kanal mikrofluidischen prime.
Die verwendeten Plattform nutzt 600.000 PHH pro Bohrloch, die vielschichtige Hepatozyten innerhalb der Gerüste gewährleistet. Obwohl die Anzahl von Zellen variiert werden kann, sorgt für die gewählten Zellkonzentration optimale Ergebnisse. Das Plattenformat hält insgesamt 12 Gerüste, die zu 36 Gerüste erweitert werden kann. Ist jedoch aufgrund der mikrofluidischen Anforderungen skalieren zu höheren gut Zahlen nicht möglich bis heute.
Mit diesen Ansätzen können Kulturen mit optimalen Zellleistung mindestens 40 Tage lang gepflegt werden bietet, bisher nie da gewesene Möglichkeiten, neuartige Medikamenten-Kandidaten zu bewerten, als auch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen hepatischen Zellen zu studieren Populationen während der HBV-Infektion.

Das Studium der HBV hat durch die schlechte Anfälligkeit der Kultur-Systeme erfordern mehrere Hunderte bis Tausende von HBV-Genom-Kopien pro Zelle, die Infektion1zu initiieren erschwert. Darüber hinaus primären humanen Hepatozyten sind in der Regel außerordentlich empfindlich und schnell während konventionelle Kulturen2Gewebestammzelle. Dies ist hauptsächlich auf der Tatsache, dass die flachen und harten Kunststoffoberflächen nicht die extrazellulären Naturlandschaften gefunden innerhalb der Leber und des allgemeinen Mangels an Sauerstoffversorgung der Kulturen in der Abwesenheit von mikrofluidischen Zirkulation imitieren. Herkömmlichen statischen Hepatozyten Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten schnell Gewebestammzelle und verlieren ihre Anfälligkeit für HBV-Infektion3. Hier beschreiben wir die Einrichtung und die Infektion der PHH gewachsen in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, die über herkömmliche 2D statischen PHH Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten aufgrund ihrer längeren Stoffwechsel- und funktionale Kompetenz enorm vorteilhaft sind, erleichtern langfristige Kulturen von mindestens 40 Tage4. In diesem System sind PHH auf Kollagen-beschichtete Gerüste, die ständig mit Wachstumsmedium, Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen liefern durchblutet werden ausgesät. Obwohl Alternativkultur Systeme für PHH basiert auf komplexen Kokulturen murine Fibroblasten oder 3D Zunahme der Sphäroide wurden validiert und sind anfällig für HBV-Infektion mit Mannigfaltigkeiten der Infektion von 500 Genom-Äquivalente (GE) von HBV pro Zelle, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen bleiben das alleinige in-vitro-Modellsystem anfällig für 0,05 GE des HBV pro Zelle4. Dies wird zusätzlich durch die Notwendigkeit der Verwendung von hoher Konzentrationen von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Polyethylenglykol (PEG), um HBV-Infektion zu etablieren in diesen Kulturen untermauert ist entbehrlich für die Infektion von 3D Culture Leber-on-a-Chip-Systeme 4. unter die wichtigsten Kennzeichen der HBV-Infektion ist der CccDNA Pool, fungiert als die transkriptionelle Vorlage für alle de Novo–produzierte Virionen5,6. Obwohl CccDNA in konventionellen Hepatozyten Kulturen7,8festgestellt werden kann, bleibt es unklar, ob die Regelung der CccDNA und jede therapeutische Ansätze, die darauf abzielen, ihre Beseitigung in teilweise zusammengefasst sind oder komplett entdifferenzierten Hepatozyten. Wir haben gezeigt, dass CccDNA funktional in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen gebildet wird, auf physiologische Reize reagiert und kann durch Eingriffe in die Zugänglichkeit der transkriptionellen Maschinen CccDNA Genom4ausgerichtet sein.
Host-Antworten auf HBV-Infektion in 3D Leber-on-a-Chip-Mimic diejenigen bei HBV-infizierten Patienten, ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern für Infektion sowie Therapieerfolg beobachtet. Zu den einzigartigen Funktionen des Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Fähigkeit, langfristige Host Antworten zwischen PHH und anderen Nonparenchymal Zellen in der Leber, einschließlich Kupffer Zellen4Ganglion Zellen9und Leber sinusförmigen bewerten Endothelzellen10,11. Dies bietet die einmalige Gelegenheit, Zell/Zell-Interaktionen in einem komplexen 3D Mikroumgebung zu bewerten.
Darüber hinaus erleichtert die erweiterte Kulturdauer dieser Plattform die Bewertung der sequentiellen medikamentöse Behandlungen und deren Auswirkungen auf HBV Beharrlichkeit, die nicht mit herkömmlichen Hepatozyten-Kultur-Systeme möglich sind.
Dieses Protokoll beschreibt wie 3D Leber-on-a-Chip Kulturen entstehen, für Monokulturen PHH oder Kokulturen PHH mit Kupffer Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von gereinigtem HBV für niedrige Multiplizität der Infektion Studien sowie die anschließende Analyse von Host und virale Antworten.

<table><tbody><tr><td>ReagenzienWilliam's</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>E Medium, kein Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyten Auftaumedium</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Primäre Hepatozyten Auftauen und Plattieren Ergänzungen</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primäre Hepatozyten Erhaltungsergänzungen</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Herkunft aus den USA, Hitzeinaktiviert, steril gefiltert, geeignet für Zellkultur</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen aus Kalbsleder</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat wasserfrei</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure, 99,999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (human)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagenz&nbsp; Rinderserumalbumin, Fraktion V, Hitzeschockbehandlung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, ohne UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid aus Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Kits/Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Membran</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Perfusions-Zellkulturplatte</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Kulturplattendeckel</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Rundfilterpapier</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Zellaufsatzgerüst</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Sicherungsring</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Kolben</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blut- und Gewebekit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Humaner magnetischer Luminex-Assay</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substratlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Virales RNA-Mini-Zubehörset</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>Enthält RNA-Träger</td></tr><tr><td>Millicell HY 5-Schicht-Zellkulturflasche, T-1000, steril</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td>PFHYS1008</tr><tr><td>MicroAmp Optische 384-Well-Reaktionsplatte mit</td><td>Barcode-Life-Technologien</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Life-Technologien</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>durchsichtige unsterile 96-Well-Immuno-Platten mit flachem Boden</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 442404</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungsband für 96-Well-Platten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Sterile Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit Schnellfluss und PES-Membran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Mikroskopische Objektträger mit geschliffenen Kanten, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, dünnwandig, ultraklar, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Primärzellen / Zelllinien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humane plättierbare Hepatozyten, Transporter-qualifiziert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Kryokonservierte humane Kupffer-Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19-Zelllinie</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Primer/Sonden/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA Forward Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV DNA-Sonde</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA Forward Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGTATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>Reverse Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>Forward</td><td>Primer Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>Reverse Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis-B-Virus-Kernantigen-IgG-Fraktion (polyklonal)</td><td>DAKO</td><td>abgekündigte</td><td>Charge 10102505</td></tr><tr><td>Humanalbumin-Antikörper, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td>. <td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Humanalbumin-kreuzadsorbierter Antikörper, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td>. <td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Los</td></tr> <tr><td>1431810Name</td><td>Unternehmen</strong</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Vakuumpumpe</td><td>CN Bio Innovationen</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pneumatikanschluss</td><td>CN Bio Neuheiten</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Plattform</td><td>CN Bio Innovationen</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Plattenwaschdock</td><td>CN Bio Innovationen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklavierbare Metallzange</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Wissenschaftliche</td><td>Industrien Artikelnummer: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow</td><td>MGE weltweit</td><td>&nbsp; SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800 SERIES Inkubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Präzisions-Torgue</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Drehmoment</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Kompressor</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 Instrument mit xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore Handheld Magnetabscheider</td><td>Block ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima Plate Reader</td><td>BMG Labtech KOLVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Elektroschrauber</td><td>VTECH</td><td>ltd FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Netzteil</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Air Equipment</td><td>Eingestellt</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time-PCR-System mit 384-Well-Block</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

"leber-on-a-chip" kulturen der primäre hepatozyten und kupffer zellen für hepatitis b-virus-infektion

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Trotz der außergewöhnlichen Infektiosität des Hepatitis B-Virus (HBV) in-vivo, wo nur drei virale Genom einer Chronifizierung von experimentell infizierten Schimpansen führen kann, erfordern die meisten in-vitro-Modelle mehrere Hunderte bis Tausende von viraler Genome pro Zelle in Bestellung um eine transiente Infektion zu initiieren. Darüber hinaus können statische 2D Kulturen von primären humanen Hepatozyten (PHH) nur Kurzzeitstudien aufgrund ihrer schnellen Entdifferenzierung. Hier beschreiben wir 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen der PHH, Monokulturen oder in Kokulturen mit anderen Nonparenchymal-Leber-Resident-Zellen. Diese bieten eine deutliche Verbesserung zu langfristigen HBV-Infektionen mit physiologischen Host-Zell-Reaktionen zu studieren. Neben der Vermittlung Medikament Wirksamkeitsstudien, toxikologische Analyse und Untersuchung der Pathogenese, ermöglichen diese mikrofluidische Systeme die Bewertung der kurativen Therapien für HBV-Infektion zur Beseitigung kovalent geschlossen, Rundschreiben (ccc) DNA. Diese Methode vorgestellt beschreibt den Aufbau von PHH Monokulturen und PHH/Kupffer Zelle Ko-Kulturen, ihre Infektion mit gereinigtem HBV und die Analyse von Host-Antworten. Diese Methode ist insbesondere für die Bewertung der langfristigen Auswirkungen der HBV-Infektion Behandlungskombinationen und Pathogenese.

Wir beschreiben eine einfache und vielseitige Plattform für die langfristige Kultur der primären menschlichen Kupffer Zellen bzw. Hepatozyten und deren Infektion mit HBV. Primären humanen Zellen sind auf Kollagen-beschichtetem Polystyrol Gerüste in einer mikrofluidischen Platte Baugruppe ausgesät, die kontinuierlich die Zellen mit Wachstumsmedium (Abbildung 1a) perfuses.
PHH, die in der Regel nur stabil für eine begrenzte Zeit in herkömmlichen Kultur-Systeme sind, kann funktional für längere Zeit aufrechterhalten werden. Humanalbumin, die wird von funktionellen Hepatozyten sezerniert und gilt als den besten Marker für die Bewertung der hepatischen Metabolismus, äußert stabil und hoch von 3D Kulturen bis Tag 40 Post-Aussaat (Abbildung 2). Für Kokulturen können Kupffer Zelle Funktionalität und Rentabilität durch die Sekretion von bestimmten Zytokinen (z. B. IL6 und TNF) ausgewertet werden. Produktion von Zytokinen zu messen, empfiehlt sich die Verwendung von Capture-basierte Erkennung nach LPS-Stimulation der Kokulturen (Abbildung 3).
Zellen bilden hepatische Microtissues, in der Regel innerhalb 3 Tagen nach der Aussaat von PHH, demonstrieren funktionelle Galle Canaliculi und vollständige Zelle Polarisation (Abbildung 2). Neben der Beibehaltung ihrer physiologischen Zellstoffwechsels, werden diese Kulturen besonders anfällig für HBV-Infektion. HBV-DNA und anderen viralen Markern, im Gegensatz zu anderen Kultur werden leicht nachweisbaren vom 2. Tag nach der Infektion (Abbildung 4). Neben sekretierten Marker der viralen Infektion, Hepatozyten-haltigen Gerüste aus den Kulturen abgerufen und für die Immunfluoreszenz-Erkennung von viralen Antigenen verwendet werden können (z. B. HBsAg, HBcAg) (Abbildung 4). Wo herkömmliche Hepatozyten Kulturen erfordern Inokulation mit mindestens 500 HBV GE pro Zelle und die Zugabe von 2 % DMSO und 4 % PEG, so wenig wie 0,05 HBV GE sind in der Lage, die Infektion in 3-d-Kulturen ohne das Erfordernis von DMSO oder PEG (Abbildung 4) zu initiieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Abbildung 1: Aufbau des 3-d-Leber-on-a-Chip-Kulturen. (ein) ist dies ein schematischer Aufbau für die Montage der Kultur-Platte um die Schaffung von mikrofluidischen Zirkulation zu gewährleisten. (b) dieses Panel zeigt eine Nahaufnahme der Kultur Brunnen, darunter das Filterpapier, Gerüst und Sicherungsring. (c) dieses Panel zeigt den Prozess der Platte Gleichgewichtherstellung vor der Aussaat der Kulturen. Die nächsten beiden Fenster zeigen den Prozess der Aussaat für Hepatozyten Monokulturen (d) und (e) Hepatozyten/Kupffer Zelle Kokulturen. (f) zeigt dieses Fenster die Waschschritte mittlere Veränderungen. (g) dieses Panel zeigt die HBV-Infektion Einrichtung, einschließlich der Beseitigung des Inokulums. S.M. = Aussaat Mittel, M.M. = Wartung Mittel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Abbildung 2: hepatische Microtissue Bildung und Hepatozyten Lebensfähigkeit. (ein) dieses Panel zeigt längs Hellfeld Bilder 3D Hepatozyten Monokulturen demonstrieren Microtissue Bildung nach Aussaat. (b) dieses Panel zeigt Immunfluoreszenz Bildgebung der Kulturen für die Zellkerne (blau) und Humanalbumin (grün). (c) dieses Panel zeigt längs insgesamt Albumin, sowie pro Zelle angepasst Albumin Produktion in 40 Tagen von Hepatozyten Monokulturen, wie mittels ELISA bestimmt. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.4angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Abbildung 3: Kupffer Zelle Funktionalität in 3-d-Kokulturen. Diese Tafeln zeigen die Sekretion von (einem) IL6 und (b) TNF in Hepatozyten Monokulturen und Hepatozyten/Kupffer Zelle cocultures 11 Tage nach Aussaat in Reaktion auf exogen hinzugefügt LPS am 9. Tag Post Aussaat, wie menschliche magnetische anhand Luminex-Assay. Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.4angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Abbildung 4: HBV-Infektion in Leber-on-a-Chip Kulturen. (ein) zeigt dieses Fenster die Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Erkennung von HBcAg (rot), HBsAg (grün) und Zellkerne (blau) 10 Tage nach der Infektion der Kulturen mit HBV. (b) zeigt dieses Fenster die Anfälligkeit der Kulturen gegen HBV-Infektion mit verschiedenen Mannigfaltigkeiten der Infektion, wie durch eine Quantifizierung der HBV-DNA in die Kultur Überstände bestimmt. (c) zeigt dieses Fenster die Quantifizierung der longitudinalen Anhäufung von HBV PgRNA bezogen auf das Zimmermädchen gen RPS11. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.4angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen in hepatotropen Infektionen und Lebererkrankungen Felder zu beantworten. Wie der Beitrag von Leber-Resident-Zellpopulationen, zu viraler Pathogenese, Längsinfektionskinetik, Mechanismen der Virusreplikation, Immuninvasion, in einem physiologischen Modellsystem und Medikamententests. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, eine leberische Mikroumgebung zu rekapitulieren.Die über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden kann und natürlich anfällig für Hepatitis-B-Infektionen auf physiologisch relevanten Ebenen ist. Dies war bisher ein grundlegendes Hindernis im Bereich Hepatitis B. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie oder Diagnose von HBV-Infektionen, da Arzneimitteltests in einer physiologischen Plattform für längere Zeit durchgeführt werden können.Dies ermöglicht die Bewertung sequenzieller medikamentöser Behandlungen sowie die Analyse der Wirksamkeit bestehender und neuartiger Behandlungsstrategien. Diese Methode kann Verständnis in Hepatitis B bieten, und kann auch auf andere Studien der Krankheit angewendet werden, einschließlich anderer hepatotroper Infektionen, Lebererkrankungen, oder Arzneimittelstoffwechselstudien. Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird kämpfen, weil es die Aufmerksamkeit auf bestimmte Details erfordert, um die erfolgreiche Wartung von Lebergewebe für längere Zeit zu ermöglichen.Und auch mit den spezialisierten Werkzeugen und Geräten vertraut zu machen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Einschließlich Montage der Platten sowie Auftauen und Säen der Zellen.Da Schritte in der langfristigen Kultur der Leber-abgeleiteten Zellen beteiligt sind eine Herausforderung, wenn ein neuartiges Kultursystem zu verwenden. Schalten Sie zunächst sowohl den Kompressor als auch die Vakuumpumpe ein, die mit der Leberchipplattform verbunden ist. Fahren Sie mit einem Glasrohrschrank fort, um die Platten zu montieren und auszudemtzubilden.Legen Sie eine sterile Membran auf die Plattenbasis, um mit der aseptischen Montage der mikrofluidischen Platten zu beginnen. Sicherstellen, dass die sterile Membran reibungslos auf den beiden Stiften der Grundplatte ruht. Dann fügen Sie die gut enthaltende obere Platte hinzu.Fügen Sie einen sterilen Plattendeckel hinzu. Und verwenden Sie ein automatisiertes Präzisionsdrehmoment, das auf 33 Pfund eingestellt ist. Mit einer Spiralstrafungssequenz, um die Schrauben an der Basis der Platte festzuziehen.Achten Sie mit einem manuellen Drehmoment darauf, dass alle Schrauben auf 35 Pfund angezogen sind. Als nächstes die Hepatozyten-Saat mittlere auf 37 Grad Celsius vor dem Anheizen vorwärmen. Legen Sie die komplett montierte Platte in die Waschbank.Und stellen Sie sicher, dass die Platte vollständig einrastet. Fügen Sie 400 Mikroliter Hepatozyten-Saatmedium auf die Reservoirseite jedes Brunnens, um die Platte zu grundieren. Danach den Fluss in aufwärts für 3,5 Minuten bei einem Mikroliter pro Sekunde initiieren.Die roten Anzeigen an der Seite der Platte zeigen an, ob die mikrofluidische Zirkulation ordnungsgemäß funktioniert. Sobald das Medium auf die Zellwachstumsseite der Platte gepumpt wird, fügen Sie weitere 1,2 Milliliter Hepatozyten-Saatmedium hinzu. Übertragen Sie die Platte vorsichtig in die Dockingstation innerhalb eines befeuchteten Inkubators bei 37 Grad Celsius und 5%CO2.Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 16 Stunden. Danach die Platte auf eine Waschbank geben. Sanfte Pipette nach oben und unten, um Blasen zu beseitigen.Mit einer sterilen Zange, fügen Sie ein steriles rundes Filterpapier zu jedem Brunnen. Fügen Sie dann jedem Brunnen ein Zellbefestigungsgerüst und einen Haltering hinzu. Verwenden Sie einen sterilen Kolben, um jeden Brunnen nach unten zu drücken und die Halteringe und Gerüste an Ort und Stelle zu verriegeln.Als nächstes aspirieren Sie das gesamte Medium. Und sanft 400 Mikroliter vorgewärmtes Hepatozyten-Saatmedium über das Gerüst geben. Initiieren Sie den Fluss in einer Abwärtsrichtung bei einem Mikroliter pro Sekunde für 3 1/2 Minuten.Aspirieren Sie alle Mittel aus der Reservoirseite der Platte gepumpt. Fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten-Saatmedium zu jedem Brunnen hinzu. Dann geben Sie die Platte an das Dock zurück, um das Gesamtvolumen pro Brunnen auf bis zu 1,6 Milliliter zu bringen.Zuerst das Hepatozytenauftaumedium und Hepatozytensäen mittel auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Als nächstes tauen Sie eine Durchstechflasche mit primären menschlichen Hepatozyten nach den Anweisungen des Lieferanten auf. In einem Glasrohrschrank die Zellen in einem Milliliter Hepatozyten-Saatmedium wieder aussetzen.Dann legen Sie die resuspendedn Zellen auf Eis. Mit Trypanblau, zählen Sie die Zellen, um sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen über 90% Übertragen Sie die vollständig montierte Platte auf das Waschbecken. Und alle Medien aus den Brunnen aspirieren.Holen Sie die Zellen aus dem Eis, und fügen Sie 600.000 Hepatozyten zu jedem Brunnen in einem 500-Mikroliter Volumen von Hepatozyten-Saatmedium. Initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde. Fügen Sie 900 Mikroliter Hepatozyten-Saatmedium zu jedem Brunnen, um das Gesamtvolumen in jedem auf 1,6 Milliliter zu bringen.Übertragen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und mit 5% CO2 zur Dockingstation. Initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für acht Stunden. Danach kehren Sie den Fluss mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für acht Stunden in die Aufwärtsrichtung um.Dann die Platte auf die Waschstation übertragen, und aspirieren alle Medium aus den Brunnen. Fügen Sie 400 Mikroliter Hepatozyten-Wartungsmedium zu jedem Brunnen hinzu. Und initiieren Sie den Fluss in abwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 3 1/2 Minuten.Als nächstes, aspirieren Sie alle Medium aus dem Reservoir, und fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten Wartungsmedium. Übertragen Sie die Platte in die Dockingstation in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 48 Stunden.Waschen Sie den Teller nach 48 Stunden, indem Sie ihn auf das Waschbecken übertragen. Aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen. Und fügen Sie 400 Mikroliter Wartungsmedium hinzu.Und initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung bei einem Mikroliter pro Sekunde für 3,5 Minuten. Dann aspirieren Sie alle Medium erscheinen in der Reservoir-Seite der Brunnen. Fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten-Wartungsmedium hinzu.Dann die Platte zurück zur Dockingstation im befeuchteten Inkubator geben. Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 48 Stunden. Ersetzen Sie das Medium mit diesem Wasch-und-Austausch-Prozess alle 48 Stunden.Primäre menschliche Hepatozyten sind in der Regel nur für einen begrenzten Zeitraum stabil, wenn herkömmliche Kultursysteme verwendet werden. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können sie jedoch über einen längeren Zeitraum funktional gepflegt werden. Humanalbumin wird von funktionellen Hepatozyten abgesondert und gilt als der beste Marker für die Bewertung der Leberfunktionalität.Albumin wird von 3D-Kulturen bis mindestens Tag 40 nach der Aussaat stabil und stark ausgedrückt. Für Kokulturen werden die Funktionalität und Lebensfähigkeit von Kupffer-Zellen durch Messung der Sekretion bestimmter Zytokine bewertet. Wie hier zu sehen, zeigen die gemessenen Werte von IL-6 und TNF alpha, dass Zellen funktionell erhalten und lebensfähig waren.Neben der Beibehaltung ihres physiologischen Zellstoffwechsels wurden diese Kulturen außergewöhnlich anfällig für HBV-Infektionen. HBV-DNA und andere virale Marker sind ab Tag zwei nach der Infektion leicht nachweisbar. Während konventionelle Kulturen eine Impfung mit mindestens 500 HBV-Genomäquivalenten erfordern, die mit DMSO und PEG ergänzt werden, sind diese 3D-Kulturen mit nur 05 unergänzenden Genomäquivalenten infiziert.Neben sezernierten Markern einer Virusinfektion werden hepatozytenhaltige Gerüste aus diesen Kulturen gewonnen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt, dass diese Gerüste virale Antigene enthalten. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, sanft zu sein, wenn der Umgang mit den Hepatozyten vor der Aussaat, um Zelltod zu vermeiden.Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Platten richtig montiert sind und alle Durchflusskanäle eine korrekte Medienzirkulation ermöglichen, bevor die Hepatozyten gesät werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Einschließlich der Lage und Häufigkeit der infizierten Zellen im Gewebe.Der physiologische Zustand der Hepatozyten kann auch durch Färbung für Albumin- oder Leberstrukturen einschließlich des engen Knotenproteins ZO-1 beurteilt werden. Nach dieser Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Virologie, um Hepatitis-B-Infektionen und Immunantworten in einem physiologischen 3D-Modellsystem zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-B-Virus gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie vorherige Impfungen, die Verwendung geeigneter PSA und die Arbeit unter geeigneten Biosicherheitsrichtlinien sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

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