Name: Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung und genetische Manipulation von O9-1 Neuralleistenzellen mittels siRNA und CRISPR-Cas9. Diese Protokolle ermöglichen reproduzierbare Ergebnisse für die Neurobiologie-Forschung.

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Nicole Stancel, Ph.d., ELS, von wissenschaftlichen Publikationen des Texas Heart Institute, Unterstützung redaktionelle. Wir danken auch die folgenden Finanzierungsquellen: die American Heart Association nationale Zentrum Wissenschaftler Development Grant (14SDG19840000, J. Wang), der 2014 Lawrence-Forschungspreis aus Rolanette und Berdon Lawrence Knochen Krankheit Programm von Texas (, J. Wang ), und die National Institutes of Health (DE026561 und DE025873, J. Wang, DE016320 und DE019650, R. Maxson).

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<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li>
<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das NCC ist ein vielseitig und wichtigen Beitrag zu verschiedenen Geweben und Organen während der embryonalen Morphogenese. O9-1-Zell-Linie unterhält das Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen differenzieren und die in-Vivo -Merkmale der NCCs, so dass es eine nützliche in-vitro- Werkzeug für die Untersuchung Genfunktion und molekulare Regulation in NCCs imitiert. Die unterschiedliche Status der O9-1-Zellen kann verschiedene Neuralleiste Nachkommen in Vivo, je nach Kulturbedingungen O9-...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neuralleiste (NCCs) multipotenten Stammzellen-ähnliche Zellen sind mit einem bemerkenswerten wandernden Fähigkeit und vorübergehende Existenz während der Embryonalentwicklung. NCCs entstehen zwischen der Oberfläche Ektoderm und das Neuralrohr und Migrieren auf andere Teile des Embryos während der embryonalen Entwicklung1. Basierend auf ihrer Funktionsbereiche, können in mehrere verschiedene Arten, einschließlich kranialen, Stamm, vagalen, Sakral, und kardiale NCCs NCCs eingestuft werden. Darüber hinaus können NCCs in mehrere Linien der Zelle, wie glatten Muskelzellen, Knochenzellen und Neuronen, differenzieren und geben Anlass zu verschiedenen Geweben2,3. Die Entwicklung der NCCs zeichnet sich durch eine komplexe Reihe von morphogenetischen Ereignisse, die durch verschiedene Molekulare Signale abgestimmt sind. Angesichts der komplexen Regulation der NCCs und ihre wichtigen Beiträge zu zahlreichen Strukturen, kann die Dysregulation des NCC Entwicklung häufig zu angeborenen Missbildungen, welches Konto für fast 30 % aller menschlichen angeborenen Missbildungen führen. Anomalien bei der Neuralleiste Entwicklung führen zu gespaltenen Lippe/Gaumen, fehlerhaft Nase Bildung, Syndrome, Mängel wie defekte kardiale Ausflusstrakt oder sogar die Kindersterblichkeit1,4,5, 6 , 7. Verständnis der molekularen Mechanismen des NCC Entwicklung ist wichtig für die Entwicklung von Therapien für Krankheiten, die durch Mängel im NCC-Entwicklung. Mit der Einsatz von verschiedenen in Vitro und in Vivo nähert sich8,9,10,11,12,13,14 ,15, erhebliche Fortschritte in der NCC-Forschung. In Vivo, Tiermodelle, darunter Hühner, Amphibien, Zebrafisch und Mäusen wurden verwendet, um NCCs1zu untersuchen. Darüber hinaus wurden menschliche Embryonen eingesetzt, um den Prozess der NCC-Migration in der frühen menschlichen Embryo Entwicklung16zu studieren. In-Vitrozellmodelle für NCCs, wie menschliche NCCs aus der Patienten subkutanen Fettgewebes, wurden verwendet, um die Parkinson-Krankheit17untersuchen. Die O9-1 NCC-Linie, die ursprünglich von massenkulturen des endogenen NCCs isoliert vom E8.5 Maus Embryonen18abgeleitet wurde, ist eine leistungsstarke zellenmodell für das Studium NCCs. vor allem unter Kulturbedingungen nicht zu unterscheiden, O9-1-Zellen sind multipotente Stammzellen-ähnliche NCCs. Allerdings können unter unterschiedlichen Kulturbedingungen O9-1-Zellen in angesehenen Zelltypen, wie z. B. die glatten Muskelzellen, Osteoblasten und Chondrozyten Gliazellen18unterschieden werden. Diese Eigenschaften gegeben, wurden O9-1-Zellen im großen und ganzen für NCC-bezogene Studien, wie z.B. untersuchen die molekulare Mechanismen der kranialen Gesichtsbehandlung Mängel19,20eingesetzt.
Hier ausführliche Protokolle sind zur Verfügung gestellt für die Aufrechterhaltung O9-1-Zellen, O9-1-Zellen in verschiedene Zelltypen differenzieren und O9-1-Zellen zu manipulieren, indem Sie gen Verlustfunktion-Studien mit CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung und kleine interferierende RNA (SiRNA) durchführen- Knockdown Technologien vermittelt. Als ein repräsentatives Beispiel bezeichnet man die Verwendung von O9-1-Zellen, Yap und Taz Verlustfunktion zu studieren. Yap und Taz sind die nachgelagerten Effektoren das Nilpferd Signalweg, der spielt eine entscheidende Rolle in der Zell-Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Der Hippo-Weg wurde auch gezeigt, wichtig in der Entwicklung und Homöostase von mehreren verschiedenen Geweben und Organen sowie in der Pathogenese der verschiedenen Krankheiten20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Die Kernkomponenten von Hippo-Signalisierung gehören Tumorsuppressor steril 20-Like Kinasen Mst1/2, WW Domäne-haltigen Salvador Gerüst Protein und die großen Tumor-Suppressor-Homolog (Lats1/2)-Kinasen. Nilpferd-Signalisierung Yap und Taz Aktivität hemmt und fördert deren Abbau im Zytoplasma. Ohne Unterdrückung von Hippo Yap und Taz translozieren in Kerne und fungieren als transkriptioneller Co-Aktivatoren. Wir vor kurzem zeigte, dass speziell Inaktivierung der Hippo Signalisierung Effektoren Yap und Taz in Maus NCCs mithilfe der Wnt1Cre und Wnt1Cre2SOR Treiber führte zu embryonalen Tödlichkeit bei E10.5 mit schweren Kraniofaziale defekte20. Wir haben auch Studien mit O9-1-Zellen um zu untersuchen, die Rolle von Yap und Taz in NCCs durchgeführt. Um Yap und Taz Funktion im NCC Proliferation und Differenzierung, Yap und Taz Zuschlag zu untersuchen wurden Zellen mit SiRNA in O9-1-Zellen erzeugt und Yap -Knockout-Zellen wurden mittels CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung erzeugt. Die gleichen Gen Verlustfunktion-Strategien können auf unterschiedliche Zielgene in andere Bahnen angewendet werden. Darüber hinaus können Gewinn Funktionsstudien und Transfektion Assays auf O9-1-Zellen, Genfunktion und Regulation zu studieren auch angewendet werden. Die hier beschriebenen Protokolle sollen von den Forschern als Führer für die Kultivierung O9-1-Zellen um multipotenten Stemness beizubehalten, zur Differenzierung von O9-1-Zellen in andere Zelltypen unter verschiedenen Kulturbedingungen und für das Studium der Genfunktion verwendet werden und die molekularen Mechanismen der NCCs.

<table><tbody><tr><td>Aktive STO-Feederzellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>Auch in Mitomycin C-inaktivierter Form erhältlich, Katalog # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 Maus kraniale Neuralleisten-Zelllinie</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Glutamin</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukose-Hyklon</td><td></td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fötales Rinderserum)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25% in HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) ohne Calcium oder Magnesium</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Leukämie-Hemmfaktor (LIF) 106 Einheit/ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (rhFGF-basisch)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentielles Medium, Alpha 1x mit Earle-Salzen, Ribonukleosiden, Desoxyribonukleosiden & L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (fötales Kälberserum)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS (Insulin-Transferrin-Selen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP2 (knochenmorphogenetisches Protein 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kultivierung und manipulation von zellen der neuralleiste o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Zellen der Neuralleiste (NCCs) migrieren multipotenten Stammzellen, die in verschiedene Zelltypen differenzieren und mehrere Gewebe und Organe entstehen können. Die Zellinie O9-1 ergibt sich aus der endogenen Maus embryonalen NCCs und behält seine Multipotenz. Jedoch unter bestimmten Kulturbedingungen O9-1-Zellen können in verschiedene Zelltypen differenzieren und in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung eingesetzt werden. Vor kurzem, haben mit der Kombination aus Maus und O9-1 Zelle Studien, wir gezeigt, dass das Nilpferd Weg Effektoren Signaltechnik, Yap und Taz in der Neuralleiste stammenden kraniofazialen Entwicklung eine wichtige Rolle spielen. Obwohl die Kultivierung Prozess für O9-1 Zellen komplizierter als bei anderen Zelllinien, ist O9-1-Zell-Linie ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von NCCs in Vitro. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der O9-1-Zell-Linie um seine Stemness sowie Protokolle zur Differenzierung von O9-1-Zellen in verschiedene Zelltypen, wie glatten Muskelzellen und Osteoblasten zu erhalten. Darüber hinaus werden Protokolle beschrieben, für die Durchführung von Gen Verlustfunktion-Studien in O9-1-Zellen mithilfe von CRISPR-Cas9 löschen und kleine interferierende RNA-vermittelte Zuschlag.

Das Ziel unserer Knockdown und Knockout Experimente war Studie zu den Auswirkungen von Yap und Taz -des-Verlustfunktion in O9-1-Zellen. Vor den Knockdown und Knockout versuchen müssen wir sicherstellen, die basale Medien und Kultur O9-1 Zellen wie oben beschrieben (z. B. Basalmembran Matrix Bedürfnisse decken die ganze Platte wie in Abbildung 1und O9-1-Zellen erholte sich vorzubereiten von flüssigem Stickstoff wie in Abb...

O9-1 ist eine Zell-Linie multipotent Maus Neuralleiste. Hier beschreiben wir detaillierte Schritt für Schritt Protokolle für die Kultivierung O9-1-Zellen, O9-1-Zellen in bestimmten Zelltypen differenzieren und genetisch manipuliert O9-1-Zellen mit SiRNA-vermittelten Zuschlag oder CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung.

Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Die O9-1-Zelllinie ist ein sehr nützliches Werkzeug zur Untersuchung von neuralen Kammzellen in vitro. Es hat ein großes Potenzial für den Einsatz in einer breiten Palette von Anwendungen in verschiedenen Einsatz von Forschung. O9-1-Zellen haben offensichtliche Vorteile, wie einfachen Zugang, und schnell ausreichende Zellzahlen für Experimente zu erhalten, so dass es eine leistungsfähige Methode kostenlos zu In-vitro-Studien von neuronalen Kammzellen.Bereiten Sie zunächst Basalmedien für die O9-1-Zellkultur gemäß dem Textprotokoll vor. Filtern Sie dann die Basalmedien und wickeln Sie sie in Folie, um sie vor dem Licht zu schützen. Danach sammeln Sie konditionierte Basalmedien aus aktivierten STO-Zellen gemäß dem Textprotokoll.Zuerst tauen Sie zwei Stunden lang eine Aliquot von Kellermembranmatrix auf Eis auf. Anschließend die Kellermembranmatrix mit gefiltertem sterilisiertem DMEM mit 10%FBS auf eine Endkonzentration von 0,5mg/ml verdünnen. Beschichten Sie die Platte mit der Kellermembranmatrix bei Raumtemperatur für eine Stunde.Dann aspirieren Sie die Kellermembranmatrix beim Kippen der Platte. Trocknen Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten. Wenn Sie der Platte die Ke

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Um Neuralleiste Stammzellen (NCSC) in vitro zu kultivieren, ist ein spezielles Medium (NCSCM) erforderlich. Wesentlicher Bestandteil der NCSCM ist Hühnerembryo-Extrakt (CEE). Wir beschreiben hier genaue Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE, einschließlich Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration zu produzieren.

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Dieses Video demonstriert die Verwendung von small interfering RNA (siRNA), um spezifische Gene von Interesse in neuralen Stammzellen zum Schweigen zu bringen und sie unter Verwendung eines geeigneten Differenzierungsmediums in gewünschte Zelltypen zu differenzieren. Dieses Verfahren ermöglicht es, die entscheidende Rolle spezifischer Gene im Differenzierungsprozess von neuralen Stammzellen zu untersuchen.

siRNA-vermitteltes Gen-Silencing in neuralen Stammzellen

Dieses Video veranschaulicht eine Technik zur Isolierung von kranialen Nervenfalten aus der Mittelhirnregion von Hühnerembryonen. Es wird ein detaillierter Präparierungsprozess der Neuralfalten, ihre Platzierung und Befestigung auf Fibronektin-beschichteten Deckgläsern vorgestellt, gefolgt von der Beobachtung der Migration von Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten.

Isolierung von schädelförmigen Nervenfalten aus einem Kükenembryo für eine Zellkultur der Neuralleiste

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur von kranialen neuralen Kammzellen aus Mausmodellen, in erster Linie für die Untersuchung der Zellmigration. Wir beschreiben die verwendeten Live-Bildgebungstechniken und die Analyse von Geschwindigkeits- und Zellformänderungen.

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) in vitro Differenzierungsprotokoll, das Neurosphären von reproduzierbarer Größe erzeugt, um kraniale Neuralleistenzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus herzustellen. Wir zeigen, dass diese Methodik die Variabilität im Vergleich zu früheren Protokollen reduziert und wie sie für Multiplex-Assays zur Untersuchung der Entwicklung von kranialen Neuralleistenzellen verwendet werden kann.

Dreidimensionales In-vitro-Differenzierungsprotokoll für kraniale Neuralleistenzellen für Multiplex-Assays

Lernen Sie die Kultivierung und genetische Manipulation von O9-1 Neuralleistenzellen mittels siRNA und CRISPR-Cas9. Diese Protokolle ermöglichen reproduzierbare Ergebnisse für die Neurobiologie-Forschung.

Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1

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