Name: Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Lernen Sie die ex-vivo-Bildgebung von Kalziumsignalen in Muskel- und Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse der Maus. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen zellspezifischer Reaktionen auf Nervenstimulation.

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Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus den National Institutes of Health (NIH) GM103554 und GM110767, (T.W.G.) und das National Center for Research Resources 5P20RR018751 und das National Institute of General Medical Sciences 8 P 20 GM103513 (zu G.W.H.) unterstützt.

Tierhaltung und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die IACUC an der University of Nevada durchgeführt.
1. Vorbereitung von Membranen und phrenicus Nerven von transgenen Mäusen
<ol><li>Kaufen Sie Transgene Mäuse und Oligonucleotide Zündkapseln, Genotyp dieser Mäuse. Hinweis: Die Primer werden für jede dieser Mäuse auf der Seite "Informationen" aufgeführt.<ol>
<li>Züchten von 3 bis 6 Monate alte Maus mit dem Ausdruck eine Kopie des entsprechenden transgene/Knock-in Cre-Fahrer-Allels und NULL Kopien des Allels bedingte GCaMP3/6 mit einer zweiten Maus im gleichen Alter mit dem Ausdruck ein oder zwei Kopien der Bedingung GCaMP3 / 6 Allel und NULL Kopien des Allels Cre-Treiber.</li>
		<li>Genotyp der Welpen und markieren Sie diejenigen, die Cre und bedingte GCaMP3/6 Allele haben – diese werden fortan Doppel-transgenen Mäusen aufgerufen werden (z.B. Myf5-Cre, bedingte GCaMP3)6. Hinweis: Auf diese Weise werden alle Daten von Mäusen mit dem Ausdruck eine Kopie der Cre und bedingte GCaMP3/6 Allele abgeleitet werden. Dies ist besonders wichtig, wenn Sie diese Kreuze in anderen Mutanten Mäusen (z.B., Knockouts) hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Doppel-transgenen Mäuse sind im entsprechenden Alter (z.B., postnatale Tag 0 oder 5 [P0 oder P5] oder Erwachsene), einschläfern die Mäuse durch enthaupten sie mit einer Schere (für Mäuse jünger als P10) oder indem man sie in eine Kammer Isofluran Inhalation – Wann sind nicht mehr ansprechbar, Kneifen die Rute mit einer Zange, sind sie bereit für das Opfer.</li>
	<li>Das Tier durch Enthauptung mit der Schere zu opfern.</li>
	<li>Quer über das gesamte Tier direkt unterhalb der Leber und nur über das Herz und die Lungen mit Iridektomie Schere Abschnitt.</li>
	<li>Sezieren Sie entfernt die Leber, das Herz und die Lunge, wobei Sie darauf achten, eine Länge des Nervus phrenicus beizubehalten, die lang genug, um in einer Saug-Elektrode (d.h. 1 – 2 cm) gezogen ist. Hinweis: Der linken phrenicus Nerv kann als ein weißes Stück Gewebe identifiziert werden, die den medialen Teil des linken Zwerchfells eingibt. Es muss nicht geschnitten werden, wenn die Lunge zu entfernen. Der Rechts phrenicus Nerv läuft in einer Faszie, die auch enthält die überlegene Vena Cava und ist dünner und weißer als der Vena Cava. Gemeinsam dringen sie beide rechts mediale Membrane.</li>
	<li>Weiter entfernen Sie den Brustkorb und die Wirbelsäule, außer dem dünnen Grat um das Zwerchfell.</li>
	<li>Legen Sie die Membrane und der phrenicus Nerv Probe in einem Microfuge Rohr mit Krebs-Ringer-Lösung mit 1 µg/mL 594-αBTX für 10 min in der Dunkelheit. Hinweis: Diese Konzentration von 594-αBTX Etiketten ACh-Rezeptoren (AChRs) ohne zu blockieren ihre Funktion (persönliche Beobachtung).</li>
</ol>2. Stimulation und Aufnahme von Aktionspotentialen der Muskel
<ol><li>Mit Hilfe der Minutien Pins, die Membran zu immobilisieren durch Festhalten auf eine 6-cm-Schüssel beschichtet mit dielektrischen Silikongel gefüllt mit ~ 8 mL Sauerstoff Krebs-Ringer-Lösung und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Durchspülen Sie die Membran mit mehr Krebs-Ringer-Lösung (8 mL/min) für 30 min. Hinweis: Dies spült die ungebundenen 594-αBTX, sowie das Gewebe nach Dissektion gestalten.</li>
	<li>Machen Sie eine Saug-Elektrode gemäß der etablierten Methoden7.<ol>
<li>Bewegen Sie bei 4 X Vergrößerung mit einem Mikromanipulator die Saug Elektrode über den linken phrenicus Nerv und wenden Sie Ansaugung durch Herausziehen des Laufes einer 5-mL-Spritze verbunden auf das Rohr, das an die Absaugung Elektrode angeschlossen ist an. Hinweis: Wenn erfolgreich in die Absaugung Elektrode gezeichnet, Nervus phrenicus ist straff. Schalten Sie den Stimulator und stimulieren den phrenicus Nerv durch Umklappen der manuellen Schalter 1 X.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Membran in Reaktion auf die 1-Hz-Stimulation Verträge, durch die Untersuchung es visuell mit Hellfeld-Beleuchtung. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Spannung durch Drehen des Drehknopfes Spannung schrittweise um einen supramaximalen Impuls zu erreichen, die durch eine visuelle Prüfung der Muskelkontraktion nachgeprüft werden kann. Wenn noch nicht sichtbar, Ausblasen des Nervs mit der Spritze und versuchen Sie es ziehen wieder durch die Anwendung der sog.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schalten Sie die Durchblutung und fügen Sie die Muskel-spezifische Myosin-Inhibitor BHC-6 oder der Voltage-gated Natrium Kanal Antagonisten µ-vor8 , eine Endkonzentration von 100 µM.<ol>
<li>Um 100 µM BHC, pipette 4 µL 200 mM Lager in DMSO und in Krebs-Ringer-Lösung 1 mL predilute.</li>
		<li>Entfernen Sie 1 mL der Krebs-Ringer-Lösung aus der Schale.</li>
		<li>Fügen Sie die vorverdünnten BHC auf den Teller. Hinweis: Diese Vorverdünnung verhindert, dass die Induktion von unverdünntem DMSO nicht flüchtigen fluoreszierende Antwort in GCaMP3 exprimierenden Zellen.</li>
		<li>Warten Sie 30 min und schalten Sie dann die Perfusion der frischen Krebs-Ringer-Lösung für weitere 20-30 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Aufnahme-Elektrode.<ol>
<li>Tragende von Handschuhen, einem Monofilen Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser (OD) von 1 mm und einem Innendurchmesser (ID) von 0,4 mm in einer Mikropipette Puller und ziehen Sie die Regler um es in Position zu befestigen. Schließen Sie die Tür Puller.</li>
		<li>Mit einem Abzieher P-97 programmieren Sie die folgende Einstellung: Wärme bei 900, Pull bei 120, Geschwindigkeit bei 75, mal bei 250, Druck auf 500 und keine zusätzliche Schleifen. Hinweis: Resistance (R) wird mit Software-Steuerung des Verstärkers gemessen: der Datenerfassungs-Software bestätigt Widerstand durch das Lösen der Formel V = IR. Der Software Controller geht einen bekannten Strom (I) (in der Regel 1 nA) durch die Elektrode und misst die Veränderung der Spannung (V), so dass wir für R. lösen</li>
		<li>Embryonale Membranen stellen Sie sicher, dass der Widerstand in der Nähe von 60 MΩ und für ältere Membranen, 10-20 MΩ. Laden Sie die Aufnahme-Elektrode mit 3 M KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Senken Sie bei 10-facher Vergrößerung die Elektrode in Muskeln, mit einem zweiten Mikromanipulator auf der gegenüberliegenden Seite der Bühne als eine anregende Elektrode.</li>
	<li>Elektrophysiologische Datenerfassungs-Software verwenden, warten Sie, bis die Membran-Ruhepotential von 0 auf-65 ändert mV oder unten.</li>
	<li>Bei 1 Hz stimulieren und überprüfen das Vorhandensein von einem Muskel-Aktionspotenzial indem auf ein großes Potenzial, das eine bescheidene Überschwingen aufweist (Potenzial, der sich über 0 erhebt mV bei einsetzendem bei-65 mV oder unten). Verwechseln Sie nicht die Anregung Artefakt mit ein Aktionspotential. Hinweis: Potenziale sind in Dauer (~ 5 ms) als Anregung Artefakte deutlich länger.</li>
</ol>(3) Bildgebung der Fluoreszenz der Probe
<ol><li>Mit 20 X Vergrößerung, suchen die Endplatte Band in der Mitte des Muskels durch auf der Suche nach 594-αBTX – mit der Bezeichnung NMJs unter grün/gelb leichte Erregung (550 nm). Wechseln Sie in das blaue Licht Erregung (470 nm), Bild Ca2 + Antworten im Muskel, Motoneuron oder Schwann-Zellen.</li>
	<li>Falls gewünscht, die Bild-Splitter mit Bandpass-Filter und einen dichroitischen Single-Kante-Filter für die Dual-Wellenlänge Bildgebung eingerichtet.</li>
	<li>Um die maximale Fluoreszenz (Fmax) ausgestellt von GCaMP3/6-Ausdruck Gewebe zu berechnen, addieren Sie 12 µL 3 M Kaliumchlorid (KCl) an die Membran Vorbereitungen6.<ol>
<li>Durchführen Sie Experimente mit der Helligkeit-Bar auf der Lookup Tabelle Bar auf 110 % des Niveaus an die GCaMP3/6-Ausdruck Gewebe Sättigung bei 20 X Vergrößerung ausstellt, ohne Reaktion auf KCl binning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit 20 Bildern pro Sekunde nicht verpassen schnellen Ereignisse aufzeichnen.</li>
	<li>Mit 1-45 s von 20-40 Hz von Nervenstimulation durch die Bereitstellung eines Zuges der Impulse mit der Saug-Elektrode stimulieren Sie oder fügen Sie pharmakologische Agonisten durch Bad Anwendung oder durch Perfusion und sammeln Sie dynamische fluoreszierende Ca2 + Antworten in einer Zelle Subtyp zusammen mit den statischen 594-αBTX NMJ Signal. Hinweis: Wenn gewebespezifischen rot oder dunkelrote GECI oder GEVI Mäuse an den NMJ verfügbar, können sie verwendet werden, zwei dynamische Signale reflektiert zwei zelluläre Elemente an den NMJ zu sammeln.</li>
	<li>Wenn die bildgebenden oder elektrophysiologische Experimente abgeschlossen sind, weil die gewünschten Ergebnisse erzielt wurden, durchspülen Sie Wasser durch die Perfusion Leitungen und saugen Sie Wasser 2 x - 3 X durch die Absaugung Elektrode um sicherzustellen, dass Salze baut nicht auf.</li>
</ol>4. Export und Analyse der Daten durch eine Standardabweichung Karte der Fluoreszenzintensität (SD-iu16)
<ol><li>Nehmen Sie Bildsequenzen als 16-Bit TIFF-Stapel auf und laden sie in die gewünschten Daten Analyse Abbildungssystem zur Analyse.</li>
	<li>Wählen Sie in die Software 8D Menü "Datei" Bildstapel von Interesse , und klicken Sie, um zu laden.<ol>
<li>Sobald das Video geladen wird, Durchsuchen Sie die Zeit, um einen Abschnitt zu identifizieren, der keine fluoreszierenden Zellaktivität hat. Hinweis: Zum Erstellen eines Hintergrund-Beispiels wird dieser Region verwendet werden.</li>
		<li>Halten Sie die UMSCHALTTASTE und klicken Sie auf um eine Region of Interest (ROI) Feld im Bereich als den Hintergrundbereich Probe zu ziehen.</li>
		<li>Nach dem Erstellen der Box, drücken Sie die LEERTASTE um eine Darstellung der Hintergrundänderung Aktivität zu erstellen.</li>
		<li>Rechtsklicken Sie auf die Spur und sortierten die Option die Option Dump ROI als Text die Spur als Xy-Koordinate Textdatei zu präsentieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Umzug zurück in das Video von Interesse, Scannen Sie erneut um die Zeit-Region zu identifizieren, wo die Aktivität des Interesses auftritt.<ol>
<li>Mit der mittleren Maustaste, wählen Sie dieses Mal Region in das gelbe Feld.</li>
		<li>Mit der rechten Maustaste auf das Video und wählen Sie Stapel-OPS und dann Stat Karte Option 5. Hinweis: Dadurch wird eine Standardabweichung (SD Karte) im linken Fenster generiert.</li>
		<li>Klicken Sie auf die SD-Karte und dann Taste drücken die [ ] 19 X, um die entsprechende Farbe Heatmap anwenden.</li>
		<li>Mit der rechten Maustaste der SD-Karte und wählen Sie STM laden und speichern, die die Option Stm als Tiff speichern auf der SD-Karte zu speichern, präsentieren wird.</li>
		<li>Dann, drücken Sie die [ Schlüssel 19 X wieder ein Graustufen-Farbkarte.</li>
		<li>Drücken Sie die Taste C und dann D Dichte-Mapping-Tools bringen. Verwenden Sie die linke Maustaste gedrückt und die Mitteltaste der Maus, passen Sie den Schwellenwert um alle fluoreszierenden Aktivität gezeigt in der SD-Karte erweitert.</li>
		<li>Drücken Sie C , um die Dichte Werkzeuge schließen und gleichzeitig die Schwellenwerteinstellungen.</li>
		<li>Mit der rechten Maustaste der SD-Karte und wählen Sie STM Partikel und dann PTCLS zu finden. Hinweis: Dies erkennt einzelne Zellen fluoreszierende Tätigkeit zum Ausdruck zu bringen.</li>
		<li>Rechtsklicken Sie die SD-Karte erneut und wählen Sie Erstellen Partikel ROIs. Hinweis: Dadurch werden die ausgewählten Zellen auf das original-Video von Interesse überlagern.</li>
		<li>Bei gedrückter Shift, mit der rechten Maustaste auf einen der jetzt identifizierte Teilchen ROIs auf das original-Video.</li>
		<li>Wählen Sie ROI Marker und Maßnahme Int in ROI. Hinweis: Dies erzeugt individuelle fluoreszierende Aktivität Grundstücke für jeden identifizierten ROI in dem Video von Interesse. Diese können mit der rechten Maustaste eine von diesen gespeichert und Auswahl sortiert, gefolgt von Dump ROI als Text.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detaillierten Logik dieser Operationen entnehmen Sie bitte der Source-Code-Datei9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier stellen wir einige Beispiele für Ca2 + Antworten in bestimmte Zellen in intaktem neuromuskuläre Gewebe mit Hilfe von GECI exprimierenden Mäusen zu messen. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es nicht unbedingt Nervus phrenicus während der Präparation zu verletzen. Um Ca2 + Antworten in Schwann-Zellen bei hohen oder niedrigen Leistung (d.h.20 X oder X 60) Bild, ist es notwendig, BHC oder µ-vor Block Bewegung zu verwenden. Für Niederleistungs-Bildgebung von Ca<sup...

NMJ, wie alle Synapsen besteht aus drei Elementen: ein präsynaptischen Terminal abgeleitet eines Neurons, einer postsynaptischen Neuron/Effektor-Zelle und eine Perisynaptic glial cell1,2. Während die grundlegenden Aspekte der synaptischen Übertragung dieser Synapse3erstmals nachgewiesen wurden, bleiben viele Aspekte dieses Prozesses unbekannt, teilweise aufgrund der Ausdruck der gleichen Moleküle durch die ausgeprägte zelluläre Elemente dieser Synapse. Beispielsweise werden Rezeptoren für die Purin Adenin Nukleotide ATP und Acetylcholin (ACh), die von Motoneuronen bei Wirbeltieren NMJ Co freigesetzt werden, durch Muskel-, Schwann-Zellen und motorischen Neuronen, so erschwert die Interpretation eines ausgedrückt. funktionelle Wirkung ausgeübt durch diese Substanzen (z.B.Sender Freigabe oder Antwort, Muskel Krafterzeugung)4. Darüber hinaus die dreigliedrigen Komponenten der NMJ sind zwar einfach im Vergleich zu, z. B. Neuronen im zentralen Nervensystem die oft mehreren synaptischen Eingänge aufweisen ob die motorischen Nervenzellen, Muskelzellen oder Schwann-Zellen als Reaktion auf Reize, die Basis variieren auf ihre inneren Heterogenität (z.B., embryonale Ableitung, Faser-Subtyp, Morphologie) ist unklar. Um alle diese Probleme zu lösen, wäre es vorteilhaft, die Reaktion vieler Zellen innerhalb einer synaptischen Element sowie Track, zur gleichen Zeit, solch eine Reaktion auf die einzelnen Elemente gleichzeitig verfolgen. Konventionelle Strategien mit chemischen Farbstoffen zu Kalzium Signalisierung messen können diese zwei Ziele nicht erreichen, weil Bad angewendet Farbstoff durch mehrere Zelltypen nach Anwendung auf Gewebe aufgenommen wird und intrazellulär geladen Farbstoff nur verwendet werden, kann um zu visualisieren Person oder einer kleinen Kohorten von Zellen. Hier, mit Hilfe transgener Mäuse mit dem Ausdruck GECIs entworfen, um zellspezifische Kalzium Signalisierung zusammen mit bestimmten Bildgebung und Software Tools5, wir führen die erste dieser zwei allgemeine Ziele und erläutern wie die Zugabe von neu Transgene Werkzeuge würde helfen, die Sekunde zu erreichen. Diese Technik wird für alle interessierten bei der Verfolgung von Kalzium Dynamik oder andere zellulare signalisieren Ereignisse beobachten durch gen-kodierte optische Sensoren in mehrere Zellpopulationen zur gleichen Zeit nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre Mäuse</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>Treibt die Expression von Muskelzellen bereits ab E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre Mäuse</td><td>an Jax</td><td>#003829</td><td>Treibt die Expression in alle &nbsp; Schwann-Zellen bei E13, aber nicht bei P209</sup</td></tr><tr><td>>Sox10-Cre</td><td>Mäuse Jax</td><td>#025807</td><td>Treibt die Schwann-Zellexpression im höheren Alter an</td></tr><tr><td>Bedingte GCaMP3-Mäuse</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Exprimiert GCaMP3 auf zellspezifische Weise</td></tr><tr><td>Bedingte GCaMP6f-Mäuse</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>exprimiert GCaMP6f auf zellspezifische Weise</td></tr><tr><td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-on)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Blockiert das Myosin der Skelettmuskulatur, aber nicht die Neurotransmission6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Markiert Acetylcholinrezeptor-Cluster bei NMJ</td></tr><tr><td>&micro;-conotoxin GIIIb</td><td>Peptides Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Blockiert Nav1.4 spannungsabhängiger Natriumkanal8</td></tr><tr><td>Silikon Dielektrisches Gel; aka Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel .9KG&nbsp;</td><td>Ermöglicht die Ruhigstellung der Membran durch winzige Stifte</td></tr><tr><td>Winzige Stifte (0,1 mm Durchmesser)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Immobilisiert das Diaphragma auf dielektrischem Silikongel</td></tr><tr><td>Eclipse FN1 aufrechtes Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Ermöglicht das Staging und die Beobachtung von Proben</td></tr><tr><td>Grundlegende stationäre Mikroskopplattform mit manuellem XY-Mikroskop-Übersetzer</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Ermöglicht die Bewegung der Probe</td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Hält Aufzeichnungs- und Stimulationselektroden&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroelektroden-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Ermöglicht die intrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnung von scharfen Elektroden</td></tr><tr><td>Mikroelektroden rauscharmes Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Ermöglicht die elektrophysiologische Datenerfassung</td></tr><tr><td>Mikroelektroden-Datenanalysesystem</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Führt elektrophysiologische Datenanalysen durch</td></tr><tr><td>Rechteckwellenstimulator</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>Stimuliert den Nerv, um Muskeln zu erregen</td></tr><tr><td>Stimulus Isolation Unit</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td><td>Reduziert Stimulationsartefakte</td></tr><tr><td>Borosilikatfilamente, 1,0 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Innendurchmesser</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Spießt und zeichnet nervenevozierte Muskelpotentiale</td></tr> auf <tr><td>Borosilikatfilamente, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,17 mm Innendurchmesser&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Verlängert und für Saugelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp;</td><td>Zieht und bereitet Aufzeichnungselektroden vor</td></tr><tr><td>1200x1200 Pixel, rückwärtig belichtete cMOS-Kamera&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Empfindliche Kamera, die hochauflösende Hochgeschwindigkeitsaufnahmen ermöglicht</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Bietet Beleuchtung durch LEDs für die Fluoreszenzbeobachtung</td></tr>&<tr><td>nbsp; Unendlich korrigierte fluoreszierende Wasserimmersionsobjektive, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Bietet lange Arbeitsabstände für die Visualisierung von Proben</td></tr><tr><td>Faseroptische Beleuchtung mit Halogenlampe</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Bietet Beleuchtung für die Hellfeldbeobachtung</td></tr><tr><td>W-View Gemini Image Splitter&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Projiziert 1 Paar Bilder mit zwei Wellenlängen, getrennt durch einen dichroitischen und einen einzigen</td></tr><tr><td>Kamera-Einzelband-Bandpassfilter&nbsp; (512/25-25 und 630/92-25)</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Ermöglicht Dualband-Bildgebung</td></tr><tr><td>560 nm Einkantiger dichroitischer Strahlteiler</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Dichroitischer Spiegel, der Lichtstrahlen trennt, um eine Bildgebung mit zwei Wellenlängen zu ermöglichen</td></tr><tr><td>Bilddatenerfassungssystem</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Ermöglicht die Aufnahme von</td></tr><tr><td>Bilddaten Wellenlängensteuermodul</td><td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>Modul für Bilddaten acqusiition</td></tr><tr><td>Emissionssplitter Hardware-Modul&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS41410</td><td>Modul zur Erfassung von Bilddaten</td></tr><tr><td>Analysesystem für Bilddaten</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fidschi</td><td>Ermöglicht die Analyse der Fluoreszenzintensität und anderer Bilddaten</td></tr></tbody></table>

ex-vivo bildgebung von zellspezifische kalzium signalisierung an den dreigliedrigen synapse der maus membran

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Die elektrische Aktivität der Zellen in den Geweben durch elektrophysiologische Techniken überwacht werden kann, aber diese sind in der Regel auf die Analyse der einzelnen Zellen beschränkt. Da eine Erhöhung der intrazellulären Kalzium (Ca2 +) in die Zellflüssigkeit oft aufgrund der elektrischen Aktivität tritt oder in Reaktion auf eine Vielzahl von anderen reizen, dieser Prozess sich durch lässt die Darstellung der Zellen mit fluoreszierenden Calcium-Sensitive geladen Farbstoffe.  Allerdings ist es schwierig, diese Antwort in einer einzelnen Zelle Art im gesamten Gewebe Bild, da diese Farbstoffe durch alle Zelltypen im Gewebe entnommen werden. Im Gegensatz dazu genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) können durch eine einzelne Zelle Art ausgedrückt werden und fluoreszieren in Reaktion auf eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +, erlaubt die Bildgebung von Ca2 + in der gesamten Bevölkerung der Signalisierung einzelnen Zelltypen. Hier wenden wir die Verwendung von GECIs GCaMP3/6 auf der Maus neuromuskulären Synapse, eine dreigliedrige Synapse zwischen Motoneuronen, Skelettmuskel und Terminal/Perisynaptic Schwann-Zellen. Wir zeigen den Nutzen dieser Technik im klassischen ex Vivo Gewebe Vorbereitungen. Mit Hilfe eines optischen Splitters, führen wir Dual-Wellenlänge Bildgebung der dynamischen Ca2 + Signale und eine statische Beschriftung der neuromuskulären Synapse (NMJ) in einem Ansatz, der an zwei zellspezifische GECI oder genetisch codierte Spannung überwachen leicht angepasst werden könnte Indikatoren (GEVI) gleichzeitig. Schließlich diskutieren wir die Routinen verwendet, um räumliche Karten der Fluoreszenzintensität zu erfassen. Zusammen, können diese optischen, transgenen und analytische Techniken eingesetzt werden, um die biologische Aktivität der Zelle unterschiedliche Subpopulationen bei NMJ in einer Vielzahl von Kontexten zu studieren.

Mehrere Beispiele für Fluoreszenz Intensität Änderungen, vermittelt durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + in bestimmten Zelltypen von NMJ, zeigt das Dienstprogramm dieses Ansatzes. Diese Ergebnisse werden als räumliche Fluoreszenz Intensität Karten, präsentiert die geben die Position der antwortenden Zellen sowie die Intensität ihrer Antworten, so dass für die Bewertung von wie viele Zellen reagieren und wie viel jeder Zelle reagiert auf ein bestimmtes Reiz. Zum Beispie...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neuromuskulären Bereich zu beantworten, wie die Rolle der Kalzium-Signalisierung in Muskel- oder Schwann-Zellen als Reaktion auf die Nervenstimulation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man die Aktivierung bestimmter Zelltypen als Reaktion auf die Nervenstimulation abbilden kann. Um zu beginnen, erhalten Transgene Mäuse, und genotyp sie wie im Textprotokoll detailliert beschrieben.Nach Dereutasasien, quer Abschnitt über das gesamte Tier direkt unter der Leber und knapp über dem Herzen und der Lunge mit Iridectomie Schere. Sezieren Sie die Leber, das Herz und die Lunge. Achten Sie darauf, eine Länge des Phrenonischen Nervs zu halten, die lang genug ist, um in eine Saugelektrode gezogen zu werden.Entfernen Sie den Rippenkäfig und die Wirbelsäule weiter, mit Ausnahme des dünnen Grats um das Zwerchfell. Legen Sie das Zwerchfell und die phrenische Nervenprobe in eine Mikrofugenröhre mit Krebs-Ringer-Lösung, die ein Mikrogramm pro Milliliter fluoreszierend alpha Bungarotoxin enthält. Lassen Sie die Probe in der Lösung für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.Mit Minutienstiften wird das Zwerchfell immobilisiert, indem man es auf eine sech

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Heredia, D. J., et. al. ex vivo Bildgebung des zellspezifischen Calcium-Signalwegs an der dreigliedrigen Synapse des Maus-Zwerchfells. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Calciumdynamik an neuromuskulären Junktionen (NMJs) in einer transgenen Maus, die genetisch kodierte Calciumindikatoren exprimiert. Eine NJM wird durch fluoreszenzmarkierte Acetylcholinrezeptoren im Zwerchfell mit dem Nervus phrenicus identifiziert. Ein Bildsplitter wird verwendet, um...

Fluoreszenzbildgebung der Kalziumdynamik an neuromuskulären Verbindungen im Zwerchfell einer transgenen Maus

Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Quelle: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+{{}} Bildgebung des enterischen Nervensystems. J. Vis. Exp.  (2015){{}}Dieses Video demonstriert Kalzium Bildgebung zur Visualisierung und Analyse der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Präparaten des myenterischen Plexus colon der Maus.

Calcium-Bildgebung von enterischen Neuronen- und Gliaaktivitäten in einem myenterischen Plexus des Dickdarms der Maus

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle  für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Lernen Sie die ex-vivo-Bildgebung von Kalziumsignalen in Muskel- und Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse der Maus. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen zellspezifischer Reaktionen auf Nervenstimulation.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

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