Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung von Immunantworten auf luftgetragene Krankheitserreger über die Dynamik der Interaktionen von Immunzellen bei Atemwegsinfektionen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, helle und stabile 4D-Bilder des Trachealepithels während einer einfachen Operation zu erhalten. Obwohl diese Methode Einblicke in die Interaktionen zwischen neutrophilen und lytischen Zellen während einer Influenzainfektion geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung verschiedener Immunzellen oder luftgetragener Krankheitserreger angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, eine stabile und minimale entzündete Operation aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann die Bildanalyse aufgrund des Vorhandenseins von Herzfehlern schwierig sein. Bei einer intranasalen Influenzainfektion legen Sie eine anästhesierte, sechs bis acht Wochen alte CD11c-YFP-Maus in Rückenlage und bestätigen Sie die tiefe Sedierung durch fehlendes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen.

Platzieren Sie die Pipette in der Nähe des linken Nasenlochs und geben Sie kleine Tröpfchen im Abstand von etwa 20 Sekunden in die Nasenhöhle ab, bis die Maus das gesamte Volumen von 15 Mikrolitern PR8 inokulat eingeatmet hat. Nach zwei bis fünf Minuten geben Sie auf die gleiche Weise 15 Mikroliter Virus in das rechte Nasenloch. Wenn das gesamte Inokulum abgegeben wurde, bestätigen Sie, dass die Maus normal atmet, und setzen Sie das Tier in seinen Käfig in den lateralen Dekubitus mit Überwachung, bis es sich vollständig erholt hat.

Drei Tage nach der Infektion entfernen Sie sowohl die Femora als auch die Tibien von einer transgenen CFP-exprimierenden Maus und reinigen Sie die Knochen vorsichtig mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Knochenepiphyse und spülen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 26-Gauge-Nadel das Knochenmark aus jedem Knochen mit sterilem kaltem PBS in ein 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Wenn das gesamte Knochenmark entnommen wurde, aspirieren Sie das Knochenmark mehrmals durch die Nadelspitze und filtrieren Sie die dissoziierte Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern kaltem PBS. Als nächstes schichten Sie vorsichtig zwei Milliliter von jedem der drei Percoll-Gradienten in ein 15-Milliliter-Röhrchen von den höchsten bis zu den am wenigsten konzentrierten. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter Knochenmarkzellsuspension auf die obere Gradientenschicht, um die zentrifugale Dichtegradiententrennung zu gewährleisten.

Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation vorsichtig das Band von der Grenzfläche mit 64 und 72 % Gradient und waschen Sie die Neutrophilen in kaltem PBS. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern frischem PBS auf Eis zur Zählung und resuspendieren Sie die Zellen in einer fünffachen 10 bis sechsten Zellen pro 100 Mikroliter PBS-Konzentration zur intravenösen Injektion in die inokulierten CD11c-YFP-Empfängertiere. 12 Stunden nach dem adoptiven Transfer legen Sie das anästhesierte Empfängertier auf eine maßgeschneiderte chirurgische Platte über einer 37 Grad Celsius erhitzten Oberfläche und entfernen Sie die Haare vom Hals der Maus durch Rasieren und eine Enthaarungscreme.

Platzieren Sie die Maus über der Kunststoff-Mausposition, wobei der Kopf in einem Winkel außerhalb der Position liegt, der die Intubation der Luftröhre erleichtert, und sichern Sie die Vordergliedmaßen, Pfoten und den Schwanz mit chirurgischem Klebeband. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf und desinfizieren Sie die exponierte Haut. Machen Sie dann einen einen Zentimeter großen Schnitt entlang der medialen Achse des Halses zwischen der oberen Brust und der Linie, die durch den unteren Punkt des Unterkiefers verläuft, und bewegen Sie die Hautflecken und die Speicheldrüsen seitlich, um die Luftröhre sichtbar zu machen.

Sie eine Pinzette, um die Luftröhre vorsichtig zu präparieren, intubieren Sie die Maus mit einem Katheter und beginnen Sie sofort mit der künstlichen Beatmung. Verwenden Sie einen chirurgischen Haken, der mit einem Stab auf der Operationsplatte verbunden ist, um die Höhe und Ausrichtung des Katheters zu fixieren, und legen Sie die Luftröhre bis zum Kinn frei. Umschließen Sie die Luftröhre mit Vaseline und hydratisieren Sie die Luftröhre mit ein paar Tropfen warmem PBS.

Kleben Sie dann ein Deckglas auf einen Metallhalter und schrauben Sie den Halter an den XYZ-Translator, damit das Deckglas auf das chirurgische Präparat gelegt werden kann. Es ist sehr wichtig, die Luftröhre richtig freizulegen und zu verlängern und sie leicht mit dem Deckglas zu drücken, um das Gewebe lange genug für die Bildgebung stabil zu halten. Für die Zeitraffer-Bildgebung in vivo legen Sie die Operationsplatte in die 37 Grad Celsius heiße Inkubationskammer des Zwei-Photonen-Mikroskops und geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Deckglas.

Nachdem Sie den Aufbau zentriert und auf das Trachealgewebe fokussiert haben, stellen Sie die Abtastfrequenz auf 800 Hertz mit 520 x 520 Pixeln, einem Sichtfeld von 440 x 440 Mikrometern und einem Liniendurchschnitt von eins ein. Stellen Sie die Titan-Saphir-Laser auf die entsprechende Wellenlänge und den entsprechenden Leistungsprozentsatz entsprechend den Anregungsfluorophoren ein und richten Sie den 3D- und Zeitraffer-Erfassungsmodus mit gleichzeitiger Anregung ein. Definieren Sie dann einen Bereich von 50 Mikrometern entlang der z-Achse mit einer Schrittweite von drei Mikrometern und zeichnen Sie 30 Minuten lang alle 30 Sekunden Bilder auf.

Nach diesem Versuchsaufbau können stabile 4D-Bilder in situ innerhalb der infizierten Luftröhre über einen Zeitraum von 30 Minuten aufgenommen werden. Die Analyse der 4D-Bilder zeigt signifikante Unterschiede zwischen dendritischen Zellen und rekrutierten Neutrophilenbewegungen, wobei letztere eine deutlich höhere Geschwindigkeit aufweisen. Die komplexe Morphologie der dendritischen Zellen führt zu häufigen Fehlern bei der Zellverfolgung, was wiederum zu Spuren mit einer verkürzten Dauer und einer erhöhten Varianz im gemessenen Richtungsverhalten führt.

Daher wurde eine robuste Metrik zur Messung der Richtungsabhängigkeit unter Berücksichtigung der Spurdauer erstellt, die einen signifikanten Unterschied in der Richtungsabhängigkeit von Neutrophilen im Vergleich zu dendritischen Zellen zeigt. Darüber hinaus ermöglicht die Berechnung des Abstands zwischen den Neutrophilen und den dendritischen Zellen die Detektion und Analyse ihrer Kontakte im Laufe der Zeit, wobei einige Neutrophile in diesem repräsentativen Experiment mehrere kurze Kontakte mit dendritischen Zellen bildeten und andere während der Bildgebungsphase keinen Kontakt mit dendritischen Zellen hatten. Darüber hinaus erleichtert die Untersuchung des durchschnittlichen Trends des Abstands zwischen Neutrophilen und dendritischen Zellen im Laufe der Zeit die Untersuchung der Gesamtpositionierung der Zellen, während die Untersuchung des Trends in bestimmten Zellen die Charakterisierung des Verhaltens jeder einzelnen Zelle ermöglicht.

In Kenntnis dieses Verfahrens können andere Methoden wie die Durchflusszytometrie der Luftröhre durchgeführt werden, um die Quantifizierung und Charakterisierung der Rekrutierung verschiedener Immunzellen in infizierten Luftröhren zu beurteilen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit jedem Influenzavirusstamm, auch wenn er an die Maus angepasst ist, gefährlich sein kann und dass daher jeder Eingriff unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden sollte.