Name: Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Krebszellinvasion mit Hydrogel-Mikrokammer-Arrays für Hochdurchsatz-Screenings anti-metastatischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht präzise Überwachung von Tumorsphäroiden in 3D.

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Diese Arbeit wird durch das Vermächtnis von Moshe Shimon und Judith Weisbrodt unterstützt.

(1) HMCA Platte Prägung
Hinweis: Der komplette Prozess für die Konstruktion und Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel und HMCA Speicherfolie verwendet in diesem Protokoll wird im Detail in unserem vorherigen Artikel15,16beschrieben. PDMS-Stempel (Negativform) wird verwendet, um die HMCA (positive Form) prägen besteht aus rund 450 MCs pro Bohrloch (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1 bgezeigt, die MCs jeweils eine Form einer abgeschnittenen Kopf quadratische Pyramide (Höhe: 190 µm, kleine Grundfläche: 90 µm X 90 µm und große Grundfläche: 370 µm X 370 µm). Die HMCA-Platte ist für die Vorbereitung und Kultivierung von 3D Tumor Sphäroide und danach für Invasion Assay verwendet. Alternativ könnte ein kommerzielle Stempel für HMCA Produktion verwendet werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von 6 % niedrig schmelzende Agarose (LMA). Legen Sie die LMA Pulver und sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,6 g LMA pro 10 mL PBS) in einer Glasflasche mit einem Magnetrührer. Stellen Sie die Flasche auf eine Heizplatte und rühren Sie die Lösung beim Erwärmen auf 80 ° C für ein paar Stunden, bis eine einheitliche Lösung erreicht wird. Halten Sie die Lösung bei 70 ° C bis zur Verwendung.</li>
	<li>Vorheizen des PDMS-Stempels auf 70 ° C in den Ofen. Halten Sie warm bis zur Verwendung. Alternativ verwenden Sie einen kommerziellen Stempel und folgen Sie den Anweisungen.</li>
	<li>Legen Sie die kommerzielle Glasboden 6-Well-Platten auf ein trockenes Bad auf 75 ° c vorgewärmt Warten Sie einige Minuten, bis die Platte ganz warm ist.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (400 µL) des vorgewärmten LMA auf den Glasboden eines jeden von den Brunnen in der Platte. Sanft lege den vorgewärmten PDMS-Stempel über die Agarose-Tropfen. Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 5 – 10 min für Pre-Gelier- und Vorkühlen. Inkubieren Sie bei 4 ° C für 20 min, volle Agarose Gelierung zu erreichen. Dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS, verlassen das Agarosegel mit MCs gemustert ab. Hinweis: Dieser Schritt erfolgt gleichzeitig in den Brunnen.</li>
	<li>Die geprägte Platte in eine lichthärtende System mit ultravioletten (UV) Lampe, und 3 min inkubieren. Hinweis: Jetzt ist die HMCA Platte UV-sterilisiert.</li>
	<li>Füllen Sie die Makro-Brunnen mit sterilen PBS um sicherzustellen, dass sie feucht gehalten werden dann die Abdeckplatte, wickeln Sie es mit Parafilm und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern.</li>
	<li>Vor dem Gebrauch leeren Sie PBS Residuen aus der HMCA-Platte. Legen Sie es in der biologischen Haube.</li>
</ol>2. Laden Zellen und Sphäroid Bildung
<ol><li>Sammeln die Zellen wie folgt vor: Entfernen Sie alle Mittel aus einer 10 cm Kultur Platte Zelle Monolage, waschen zweimal mit 10 mL PBS Serum Residuen entsorgen, 5 mL Trypsin (vorgewärmt auf 37 ° C) hinzufügen und 3 min. im Inkubator bei 37 ° c inkubieren Dann schütteln Sie die Platte vorsichtig Monolage Loslösung zu gewährleisten, fügen Sie 10 mL des kompletten Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) und Pipette rauf und runter, bis homogene Zellsuspension erreicht wird. Zentrifugieren Sie und waschen Sie die Zellsuspension mit 15 mL frisches Medium, dann in entsprechenden Konzentrationen in frischen kompletten Medium aussetzen.</li>
	<li>Laden Sie sanft die Zellsuspension (50 µL, 150 – 360 x 103 Zellen/mL in Medium ~ 16 – 40 Zellen pro MC) auf die HMCA und lassen die Zellen durch die Schwerkraft für 15 min zu begleichen.</li>
	<li>Fügen Sie sanft 6 – 8 Aliquote von 500 µL frisches Medium (insgesamt 3 – 4 mL) bis zum Rand des Makro-Brunnen Kunststoffboden außerhalb der Ring und Hydrogel-Array.</li>
	<li>Inkubieren Sie HeLa-Zellen für 72 h und Zellen MCF7 für 48 h bei 37 ° C und 5 % CO2, in eine feuchte Atmosphäre für die Bildung der Sphäroide.</li>
</ol>(3) Lebensfähigkeit Erkennung durch Propidium Jodid (PI) Färbung
<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung von PI (500 µg PI pro 1 mL PBS). Halten Sie es bei 4 ° C für ca. 6 Monate. Frisch zubereiten einer Verwässerung des 1:2,000 (0,25 µg/mL), durch die Zugabe von 6 µL von Material, das komplette Medium ohne Phenol rot, 12 mL für 6-Well-HMCA-Platte (2 mL pro Well).</li>
	<li>Die HMCA Platte mit 48-72 h Sphäroide aus dem Inkubator, der biologische Haube zu übertragen. Entfernen Sie alle Mittel aus der HMCA durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array, verlassen die Array-Tank mit Medium gefüllt.</li>
	<li>Fügen Sie sanft 2 mL PI Verdünnung aus Schritt 3.1 in jede Vertiefung durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden. Inkubieren Sie die HMCA-Platte für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO2, in eine feuchte Atmosphäre. Fahren Sie mit Schritt 7. Hinweis: Andere Farbstoffe genutzt werden hier auch, z. B. Hoechst zum Kern Beizen, Tetramethylrhodamine Methylester (TMRM) für Mitochondrien-Membran-Potential Färbung, Fluorescein Diacetat (FDA) für die lebenden Zellen Erkennung von Annexin V für die Apoptose Erkennung und andere.</li>
</ol>(4) Kollagen Gemischbildung
<ol><li>Steriles doppeltes destilliertes Wasser (DDW) von Autoklaven und einen Bestand von 100 mL 1 M NaOH Filter sterilisiert Lösung vorbereiten. Pflegen Sie die Materialien bei RT und die Tipps zur Gemischaufbereitung Kollagen bis zur Verwendung bei-20 ° C eingefroren.</li>
	<li>10 – 20 Minuten vor dem Gebrauch legen Sie alle Mischtypen einschließlich: sterile DDW, 1 M NaOH sterile Lösung, steril 10 x PBS, Typ I Kollagen aus Rattenschwanz (bei 4 ° C für 3-Monate gelagert) und ein steriles Röhrchen in den Eiskübel bis völlig abgekühlt. Legen Sie den Eiskübel in der biologischen Kapuze.</li>
	<li>6-Well HMCA Invasion Assay Platte (300 µL pro Well) 1.800 µL Kollagen Mischung an eine Endkonzentration von 3 mg/mL, wie folgt vorbereiten. Hinzufügen der Mischtypen in den gekühlten Rohr in folgender Reihenfolge: 515 µL DDW, 24,8 µL 1 M NaOH und 180 µL 10 X PBS. Mischung gut durch Strudel und Platz zurück ins Eis. Zu guter Letzt fügen Sie 1080 µL des Kollagens in der Mischung, Wirbel wieder und wieder in Eis.</li>
</ol>(5) HA und Kollagen Gemischbildung
<ol><li>10 mg in 2 mL sterile DDW HA auflösen. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für ein paar Minuten und Wirbel sanft, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist. Speichern Sie die Stammlösung bei 4 ° C für bis zu zwei Jahren.</li>
	<li>Legen Sie direkt vor dem Gebrauch HA-Stammlösung in den Eiskübel in der biologischen Kapuze.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 3 mg/mL Kollagen Mischung wie in Schritt 4 beschrieben. Fügen Sie 36 µg (7.2 µL) ha in 1.800 μL der Kollagen-Mischung für eine Endkonzentration von 20 µg/mL gebrauchsfertig. Dann, Wirbel wieder kurz und zurück ins Eis.</li>
</ol>(6) ECM Mischung zusätzlich
<ol><li>Übertragen Sie die HMCA Platte mit 48 – 72 h Sphäroide aus dem Inkubator in die biologische Haube zu und legen Sie es auf dem Eis. 10 min inkubieren Sie, bis die Platte abgekühlt ist. Eine Lösung von 1 % vorheizen LMA auf 37 ° C in einem Wasserbad.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Mittel aus rund um die HMCA indem Sie lehnen das Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array. Dann entfernen Sie sehr sorgfältig alle Mittel aus dem Array-Tank mit einem feinen Spitze/Gel laden Spitze, indem Sie das Spitze Ende am Rande Array, langsam und vorsichtig saugen alle Medium heraus lehnen. Hinweis: Nach dem entfernen alle Mittel aus um das Hydrogel-Array, Array-Tank noch mit Medium gefüllt. Dieses Medium hat sehr sanft entfernt werden, um Zerstörung von Hydrogel MC und Dislokation der Sphäroide zu vermeiden.</li>
	<li>Die Pre-gefrorene feine Spitze 150 µL des Kollagen-Mischung oder HA-Kollagen-Gemisch (ECM-Gemisch) mitnehmen und in den Array-Tank durch das Anbringen der Spitze an den Rand des Array hinzufügen. Lassen Sie die Mischung langsam um Sphäroid Luxation zu vermeiden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen aliquoten von 150 µL für eine insgesamt 300 µL pro Bohrloch. Folgen Sie den gleichen Vorgang für jedes gut, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Dann legen Sie die Platte in den Brutkasten für 1 h für den vollständigen Gelierung des ECM.</li>
	<li>Nachdem die vollständigen Gelierung der ECM erzielt worden ist, pipette 400 µL vorgewärmten 1 % LMA auf dem ECM-Gel. Die Platte mit dem Deckel abdecken, die Platte bei RT für 5 – 7 min. und dann für 2 min bei 4 ° C für Agarose Gelierung inkubieren. Schließlich fügen Sie sanft 2 mL des kompletten Medium durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden. Hinweis: Die Agarose-Schicht verhindert das Ablösen der Kollagen-Gel-Matrix aus der HMCA.</li>
</ol>7. Invasion Assay Erfassung und Analyse
<ol><li>Last die HMCA Platte auf einem motorisierten invertiert Mikroskoptisch mit Brutkasten, voreingestellt auf 37 ° C, 5 % CO2 und feuchte Atmosphäre ausgestattet.</li>
	<li>Bestimmen der Positionen für die Bildaufnahme in jedem gut um den ganzen Array-Bereich abdecken und 10 X oder 4 X Objektive verwenden (dieser Schritt ist erforderlich für die Bild-Datenerfassungs-Software hier verwendet, siehe Materialtabelle unten für Details). Alternativ können Sie alle Bild-Datenerfassungs-Software um automatische Scan des gesamten Gebietes erforderlich, durch die Wahl zu erleichtern die "Stich" Option.</li>
	<li>Erwerben Sie, Hellfeld (BF) Bilder alle 2 – 4 Std. für einen Zeitraum von 24-72 h insgesamt um die Invasion von Zellen aus dem Körper Sphäroid in die umliegenden ECM folgen.</li>
	<li>Fluoreszierende Bilder für PI-Erkennung mithilfe eines dedizierten fluoreszierenden Cubes (Erregung Filter 530-550 nm, dichroitischen Spiegel 565 nm langen Pass und Emission Filter 600-660 nm) zu erwerben.</li>
	<li>Exportieren Sie Time-Lapse BF/fluoreszierend-Bilder aus der Bild-Datenerfassungs-Software und speichern Sie sie im tagged Image Format (TIFF) in einen speziellen Ordner mithilfe der Registerkarte "Datenbank" in der Symbolleiste und dann die Schaltfläche "Export Dateien eintragen" . Hinweis: Wir entwickelten eine spezielle Inhouse Analysecode in MATLAB Software, die eine gestaltete grafische Benutzeroberfläche (GUI) enthält die Invasion Analyse schneller und einfacher ausgeführt werden konnte. In diesem Analysecode erfolgt halbautomatisch mit Sobel Filter, gefolgt von den morphologischen Operatoren Erosion und Dilatation der Segmentierung der Sphäroide und Invasion. Nach automatische Segmentierung der Bereiche wurden manuelle Korrekturen vorgenommen, gegebenenfalls für eine höhere Genauigkeit. Nach der Fertigstellung der Segmentierung waren eine Reihe von Parametern automatisch von der Software berechnet und in eine Excel-Datei zur weiteren Bearbeitung exportiert. Die Liste der Parameter sind: grundlegende Sphäroid Querschnittsfläche zur Zeit = 0, Invasion Bereich von Zellen mit Sphäroid Körper verbunden = Haupt Invasion Bereich von Zellen, die vom Haupt-Invasion, getrennt vom wichtigsten Invasion, durchschnittliche Entfernung von Anzahl der Zellen getrennt Invasion von der grundlegenden Sphäroid Mitte der Masse an den Umfang der wichtigsten Invasion Bereich und getrennten Zellen und kollektive Invasion Parameter "Entfernung" = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) von der X und Y Sphäroid Massenmittelpunkt koordiniert vor (X1, Y-1) und nach (X2, Y2) kollektive Invasion Prozess). Alternativ könnte Bildanalyse mit anderen spezialisierten Software erfolgen.</li>
	<li>Öffnen Sie die GUI und drücken Sie die Taste "Last BF" . Nachdem das Bild geöffnet ist, passen Sie die Segmentierung Parameter (Mindestgröße: > 1 und Radius schließen: > 1) um eine genaue Segmentierung der Sphäroid und seine Invasion Fläche zu erreichen, dann drücken Sie "Region of Interest (ROI) Segmentierung" für die Ausführung und eine Grenze wird um jedes Sphäroid angezeigt. Wenn die automatische Segmentierung nicht korrekt ist, drücken Sie die Taste "Löschen" oder "Hinzufügen" und führen Sie die gewünschten Korrekturen manuell. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für die nachfolgenden Bilder.</li>
	<li>Drücken Sie die "Tracking" -Taste, um die Sphäroide Nummer und die Software wird die gleiche Anzahl für jeden Sphäroid in jedem der Zeit verfallen Bilder zuweisen. Drücken Sie die "Messung" -Schaltfläche, die eine Tabelle mit allen Parametern generieren wird. Speichern Sie diese Tabelle als Excel-Datei zur weiteren Verwendung in Ergebnisse Verarbeitung und Statistiken in Excel Software.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Es ist gut dokumentiert, dass lebende Organismen, zeichnet sich durch ihre komplexe 3D mehrzelligen Organisation ziemlich eindeutig aus den gängigen 2D Monolage kultivierten Zellen sind, entscheidende betonend, zelluläre Modelle verwenden die Funktionen besser imitieren und Prozesse des lebenden Organismus für Drug screening. Vor kurzem wurden mehrzelligen Sphäroide, organotypischen Kulturen, Organellen und Organe-on-a-Chip eingeführt8 für den Einsatz in standardisierten Wirkstoffforschung. Allerd...

Krebstod ist vor allem auf die Verbreitung von metastasierenden Zellen an weit entfernten Orten zurückzuführen. Viele Bemühungen in der Krebsbehandlung auf targeting oder verhindern die Bildung von Metastasen Kolonien und das Fortschreiten der systemische Metastasen1konzentrieren. Krebs Zelle Migration ist ein entscheidender Schritt in der Tumor-Metastasen-Prozess, also die Erforschung von Krebs Invasion Kaskade ist sehr wichtig und eine Voraussetzung zur Suche nach Anti-metastatischen Therapeutika.
Die Verwendung von Tiermodellen als Hilfsmittel für das Studium metastasierten Erkrankung wurde sehr teuer und nicht immer repräsentativ für den Tumor beim Menschen festgestellt. Darüber hinaus beeinflussen die extrazelluläre Mikroumgebung Topologie, die Mechanik und die Zusammensetzung stark Krebs Zelle Verhalten2. Da in Vivo Modellen von Natur aus nicht in der Lage zu trennen und so spezifische Parameter, die zu Krebs Invasion und Metastasierung beitragen zu kontrollieren, gibt es eine Notwendigkeit für steuerbare biomimetische in-vitro- Modelle.
Um auf entfernte Organe metastasieren, müssen Krebszellen wandernden und invasive phänotypische Merkmale aufweisen, die für die Therapie ausgerichtet werden können. Da die meisten in-vitro- Krebs Modelle nicht die tatsächlichen Eigenschaften von soliden Tumoren3imitieren, ist es jedoch sehr schwierig, physiologisch relevante Phänotypen erkennen. Darüber hinaus bestimmt die phänotypische Heterogenität, die in den Tumor, besteht die Notwendigkeit für die Analyse von Tumor-Migration bei einem Element Auflösung um Phänotyp gerichtete Therapien, zum Beispiel zu entdecken, indem Sie auf die Metastasen initiieren Zelle Bevölkerung in heterogenen Tumoren4.
Die Studie der Zelle Motilität und kollektiven Migration ist in erster Linie in Monolayer-Kulturen der Epithelzellen auf homogene planaren Flächen. Diese konventionellen Zellmodellen für Krebs Zellwanderung basieren auf die Bevölkerung Analyse einzelner Zellen eindringen durch die Membranen und ECM Komponenten5, aber in einem solchen System können nicht die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden studierte. Erzeugung von 3D Sphäroide oder über Gerüste Gerüst-freie Mikrostrukturen gilt als eine überlegene bedeutet, den Tumor zu studieren Zelle Wachstum und Krebs Invasion6,7,8. Jedoch die meisten 3D-Systeme eignen sich nicht zur Hochdurchsatz-Formate und Inter Sphäroid Interaktion kann nicht in der Regel erreicht werden, da in jedes Mikro-gut9isoliert einzelne Sphäroide erzeugt werden. Jüngste Studien mit der Krebs-Migration basieren auf mikrofluidischen Geräten3,10,11,12, jedoch diese anspruchsvolle mikrofluidischen Werkzeuge sind schwer zu produzieren und kann nicht Hochdurchsatz-screening (HTS) von Anti-invasive Drogen verwendet werden.
Zwei wichtigsten Phänotypen, kollektive und individuelle Zellwanderung, die eine Rolle in Tumorzellen die ECM-Barriere zu überwinden und benachbarte Gewebe eindringen wurden nachgewiesene13,14, jede Anzeige unterschiedliche morphologische Eigenschaften, biochemischen, molekularen und genetischen Mechanismen. Darüber hinaus werden zwei Formen der Migration von Tumorzellen, Fibroblasten-Like und amöboiden, in jeder Phänotyp beobachtet. Da beide Invasion Phänotypen und Migration-Modi, zeichnen sich vor allem durch morphologische Eigenschaften, gibt es eine Notwendigkeit für zelluläre Modelle dieser aktivieren Imaging-basierte Erkennung und Untersuchung aller Formen von Tumorinvasion und Migration-Zellen.
Das übergeordnete Ziel der aktuellen Methode ist eine einfache und reproduzierbare biomimetische 3D in-vitro- Zelle-basiertes System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide zur Verfügung zu stellen. Hier stellen wir die HMCA-basierte 6-Well Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Therapie. Die Technologie ermöglicht die Bildung einer großen Zahl von einheitlichen 3D Tumor Sphäroide (450 pro Well) in einem Hydrogel Mikro-Kammern (MC) Struktur. Die Sphäroid Array ermöglichen das Eindringen der Zellen in der Umgebung sind verschiedene ECM-Komponenten hinzugefügt. Invasion-Prozess wird kontinuierlich überwacht, durch kurz- und langfristige Beobachtung der gleichen Sphäroide/Invasion der einzelnen Zellen und erleichtert Morphologische Charakterisierung, fluoreszierende Färbung und Abruf von spezifischen Sphäroide an jedem beliebigen Punkt. Da zahlreiche Sphäroide Raum und Medium teilen, ist die Interaktion über lösliche Moleküle zwischen einzelnen Sphäroide und deren Auswirkungen auf den anderen möglich. Semi-automatische Bildanalyse erfolgt über hauseigene MATLAB-Code schneller und effizienter Sammlung von großen Datenmengen ermöglicht. Die Plattform ermöglicht präzise, gleichzeitige Messung von zahlreichen Sphäroide/eindringenden Zellen Zeit effizient zu nutzen, so dass mittleren Durchsatz Screening von Anti-Invasion Drogen.

<table><tbody><tr><td>6 Mikrowell-Glasbodenplatten mit 14 mm Mikrowell-#1,5-Deckglas</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1,5-N</td><td>Kommerzielle Glasbodenplatten, die für die HMCA-Prägung verwendet werden</td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Eine Lösung von 6% Agarose wird auf 80 & Grad erwärmt; C vor dem Gebrauch wird eine Lösung von 1% Agarose auf 37 μg erwärmt; C</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA-Lösung B</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1A</td><td>Erwärmt auf 37 μg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>DMEM mittel, hoher Glukosegehalt</td><td>Biologische Industrie</td><td>01-055-1A</td><td>Erwärmt auf 37 μg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Spezielles Serum für neugeborene Kälber (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>DPBS (10x), kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Vor Gebrauch auf Eis aufbewahrt</td></tr><tr><td>NaOH, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Wird zur Herstellung von 1 M NaOH-Lösung</td></tr><tr><td>verwendet Cultrex Typ I Kollagen aus Rattenschwanz, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td> Vor <td>Gebrauch auf Eis gelegt</td></tr><tr><td>Hyaluronsäure Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Vor Gebrauch auf Eis aufbewahrt</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Dem Nährmedium Invasionshemmer</td></tr><tr><td>DETA/NO</td> zugesetzt <td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Dem Nährmedium zugesetzt, Stickstoffmonoxid-Donor</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Wird bei sehr geringer Konzentration ohne Waschen verwendet</td></tr><tr><td>Dymax 5000-EC UV-Flutlicht-Komplettsystem mit Lichtschutz & Dymax 400 Watt EC-Netzteil</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Wird für die Sterilisation von HMCA-Platten mit dem inversen UV-Mikroskop</td></tr><tr><td>IX81</td><td>verwendet Olympus</td><td></td><td>Wird für die automatische Bildaufnahme</td></tr><tr><td>verwendet Inkubator für Mikroskope</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Unverzichtbar für Zeitrafferexperimente mit Bildaufnahme, voreingestellt auf 37 & Grad; C, 5% CO2 und Aufrechterhaltung einer befeuchteten Atmosphäre</td></tr><tr><td>Submikron motorisierter Tisch Typ SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Wird zur Vorbestimmung von Bildaufnahmebereichen verwendet, für die automatische Bildaufnahme</td></tr><tr><td>14-Bit, ORCA II C4742-98 gekühlte Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td> Hochempfindlich, <td></td><td>wird für die Bildgebung</td></tr><tr><td>verwendet Fluoreszenzfilterwürfel für die PI-Detektion</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Spezifikationen des Filterwürfels: Anregungsfilter 530-550 nm, dichroitischer Spiegel 565 nm Langpass- und Emissionsfilter 600-660 nm</td></tr><tr><td>Die Olympus Cell^P Betriebssoftware</td><td>Olympus</td><td></td><td>Software zur Steuerung von Mikroskop, motorisiertem Tisch, Kamera und Bilderfassung</td></tr><tr><td>Matlab R2014B Analysesoftware</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Wird verwendet, um eine hauseigene grafische Benutzeroberfläche für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>zu entwickeln Excel-Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Wird für Datenverwaltung, Berechnung, Diagrammerstellung und Statistik verwendet</td></tr></tbody></table>

analyse der krebs zellinvasion und anti-metastatischen drogen-screening mit hydrogel micro-kammer array (hmca)-basierte platten

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Krebsmetastasen ist bekannt, 90 % der Letalität Krebs verursachen. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der mit der Durchdringung/Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe initiiert. Somit ist Invasion ein entscheidender Schritt in Metastasen, machen die Invasion Prozessforschung und Entwicklung von Anti-metastatischen Drogen hochsignifikant. Um diese Nachfrage zu begegnen, besteht die Notwendigkeit, 3D in-vitro- Modelle zu entwickeln, die die Architektur von soliden Tumoren zu imitieren und ihrer Mikroumgebung am ehesten zu in Vivo Staat auf der einen Seite, aber zur gleichen Zeit werden reproduzierbar, robust und geeignet für hohe Ergiebigkeit und hohe Content Messungen. Derzeit, lehnen die meisten Invasion Assays auf anspruchsvolle mikrofluidischen Technologien, die ausreichend sind für die Forschung aber nicht für hochvolumige Drogen-Screening. Andere Tests mit Platte-basierten Geräten mit isolierten einzelnen Sphäroide in jede Vertiefung sind Material verbrauchen und geringen Stichprobengröße pro Zustand haben. Das aktuelle Protokoll soll eine einfache und reproduzierbare biomimetische zellbasierte 3D-System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide schaffen. Wir entwickelten ein 3D-Modell für Invasion Assay anhand HMCA Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Wirkstoffforschung. Dieses Gerät ermöglicht die Produktion von zahlreichen einheitliche Sphäroide pro Bohrloch (hohe Stichprobengröße pro Zustand) umgeben von ECM-Komponenten, während gleichzeitig und kontinuierlich beobachten und messen die Sphäroide bei einem Element Auflösung für mittlere Durchsatz-Screening von Anti-metastatischen Drogen. Diese Plattform wird hier durch die Produktion von HeLa und MCF7 Sphäroide zur Veranschaulichung einzelne Zelle und kollektive Invasion vorgestellt. Wir vergleichen den Einfluss der ECM-Komponente-Hyaluronsäure (HA) auf die invasive Kapazität von Kollagen um HeLa Sphäroide. Schließlich stellen wir Fisetin (Invasion Hemmer) HeLa Sphäroide und Stickstoffmonoxid (NO) (Invasion Aktivator), MCF7 Sphäroide. Die Ergebnisse werden von Inhouse-Software analysiert die halbautomatische, einfache und schnelle Analyse ermöglicht die Multi-Parameter-Prüfung erleichtert.

Die einzigartige HMCA imaging-Platte wird für die Invasion-Assay von 3D Tumor Sphäroide verwendet. Der gesamte Test, mit der Sphäroid Bildung beginnend und endend mit der Invasion und zusätzliche Manipulationen erfolgt innerhalb der gleichen Platte. Für die Bildung der Sphäroid HeLa-Zellen werden in das Array Becken geladen und siedeln in der Hydrogel MCs durch die Schwerkraft. Das Hydrogel MCs, die Anhänger/niedrige Anlage Eigenschaften haben, erleichtern die Zell-Zell-Interaktion und di...

Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.

Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Das Ziel dieses einfachen reproduzierbaren biomimetischen 3D-Zell-basierten Systems ist es, invasionskapazitätsbasierte Analysen in großer Population von Tumorsphäroid für antimetastatische setische Arzneimittelscreening zu erleichtern. Der Hauptvorteil unseres Hydrogel-Mikrokammer-Arrays ist, dass es die Produktion einer großen Anzahl einheitlicher Sphäroide ermöglicht, die die gleiche Brennebene pro Brunnen bevölkern. Die Sphäroidposition bleibt aufgrund der Hydrogel-Mikrokammer-Arraystruktur auch nach extrazellulärer Matrixaddition erhalten, was die genaue kontinuierliche Überwachung der Sphäroide und des Invasionsprozesses erleichtert.Darüber hinaus können die morphologische Charakterisierung und fluoreszierende Färbung zahlreicher Sphäroide und eindringender Zellen vor Ort durchgeführt und zeiteffizient mit einer Ein-Element-Auflösung analysiert werden. Die Demonstration des Hydrogel-Mikrokammer-Arrays für die Herstellung von Sechs-Well-Bildplatten wird Maria Sobolev aus unserem Labor sein. Um die Hydrogel-Mikrokammer-Arrayplatten vorzubereiten, zuerst sechs Polydimethylsiloxan oder PDMS auf 70 Grad Celsius vorheizen und eine sechswellige Glasbodenplatte auf ein trockenes Bad legen, das mehrere Minuten auf 75 Grad Celsius vorgeheizt wird.Wenn die Platte warm ist, gießen Sie einen 400-Mikroliter-Tropfen vorgeheizter, niedrigschmelzender Agarose auf den Boden jeder Bohrung der Sechs-Brunnen-Platte, und legen Sie vorsichtig einen Stempel über jeden Tropfen. Lassen Sie das Setup für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, gefolgt von 20 Minuten bei vier Grad Celsius für volle Agarose-Gelation. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, schälen Sie das PDMS vorsichtig von jedem Brunnen ab und lassen Sie die Agarose-Gele mit Mikrokammern gemustert.Nachdem die UV-Lampe ihre höchste Intensität erreicht hat, legen Sie die geprägte Platte für drei Minuten in das Lichthärtungssystem und füllen Sie die UV-sterilisierten Makrobrunnen mit sterilem PBS. Dann bedecken Sie die Platte, und wickeln Sie sie mit Parafilm für vier Grad Celsius Lagerung bis zum Gebrauch. Um die Zellen zu laden, entfernen Sie die PBS aus jedem Brunnen, und laden Sie vorsichtig 50 Mikroliter der von Interesse sindden Zellen auf jedes Hydrogel-Array.Nachdem sie den Zellen erlaubt haben, sich 15 Minuten lang durch Schwerkraft abzusetzen, fügen Sie vorsichtig sechs bis acht Aliquots von 500 Mikrolitern frischem Medium an den Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens außerhalb des Ring- und Hydrogel-Arrays. Inkubieren Sie die Zellen für den entsprechenden Zeitraum bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit für die Bildung von Sphäroiden. Dann übertragen Sie die Sphäroide für 10 Minuten in eine Biosicherheitshaube auf Eis.Wenn die Platte abgekühlt ist, lehnen Sie eine Pipettenspitze am Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens neben dem Hydrogel-Array an, und entfernen Sie das gesamte Medium um das Array herum. Dann entfernen Sie das Medium aus dem Array-Tank, lehnen Sie eine Gel-Ladepipettenspitze am Rand des Array-Tanks sehr sorgfältig, wobei Sie darauf achten, die Mikrokammern und Sphäroide nicht zu stören. Als nächstes verwenden Sie eine vorgefrorene, feine Pipettenspitze, um zwei Aliquots von 150 Mikrolitern der Kollagenmischung von Interesse am Rand des Arrays nacheinander hinzuzufügen, wodurch die Mischung langsam freigesetzt wird, um Sphäroiddislokationen zu vermeiden.Nachdem die zweite Runde von Kollagen zu jedem Brunnen hinzugefügt wurde, geben Sie die Sphäroide für eine Stunde in den Inkubator zurück, um die extrazelluläre Matrix vollständig zu gelieren. Wenn die Matrix erstarrt ist, fügen Sie 400 Mikroliter vorgewärmt1%niedrigschmelzende Agarose auf die Oberseite des Gels, und inkubieren Sie die Platte, bedeckt bei Raumtemperatur, für fünf bis sieben Minuten, bevor Sie für zwei Minuten bei vier Grad Celsius für Agarose-Gelation abkühlen. Dann, die Pipette am Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens lehnen, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter komplettes Medium zu jedem Brunnen hinzu.Um einen Invasionstest durchzuführen, laden Sie die Hydrogel-Mikrokammer-Arrayplatte auf eine motorisierte invertierte Mikroskopstufe, die mit einem 37-Grad-Celsius- und 5%Kohlendioxid-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre ausgestattet ist, und verwenden Sie ein vier- oder zehnfaches Objektiv, um die Positionen für die Bildaufnahme in jedem Brunnen vorab zu bestimmen, so dass der gesamte Arraybereich bewertet wird. Dann erfassen Sie hellfeldbilder alle zwei bis vier Stunden für insgesamt 24 bis 72 Stunden, um die Zellinvasion vom Sphäroidkörper in die umgebende extrazelluläre Matrix zu verfolgen. Exportieren Sie am Ende der Bildaufnahme die Zeitrafferbilder aus der Bildaufnahmesoftware zum Speichern in einem markierten Bilddateiformat in einen dedizierten Ordner.Öffnen Sie als Nächstes die grafische Benutzeroberfläche, und klicken Sie auf Helles Feld laden. Passen Sie die Segmentierungsparameter des Bildes an, um eine präzise Segmentierung der Sphäroide und ihrer Invasionsbereiche zu erreichen, und klicken Sie auf Segmentierung region of Interest, um einen Rahmen um jedes Sphäroid zu erstellen. Wenn die automatische Segmentierung falsch ist, drücken Sie Löschen oder Hinzufügen, und nehmen Sie die entsprechenden Korrekturen manuell vor.Klicken Sie auf Tracking, um die Sphäroide in jedem der Zeitrafferbilder zu nummeriert. Klicken Sie dann auf Messen, um eine Kalkulationstabelle mit allen Parametern zu generieren, und speichern Sie die Kalkulationstabelle in einem geeigneten Format für die Datenverarbeitung und statistische Analyse. Um den Einfluss von Hyaluronsäure auf den spontanen HeLa-Sphäroid-Invasionsprozess zu untersuchen, wurden in diesem Experiment zweitagereife Sphäroide mit Kollagen- und Hyaluronsäure-Gemischlösung überzogen und mit zweitagereifen Sphäroiden verglichen, die allein mit Kollagenlösung bedeckt waren.Nach 50 Stunden Inkubation zeigten die in Kollagen und Hyaluronsäure eingebetteten Sphäroide eine geringere Zelldispersion in die umgebende extrazelluläre Matrix im Vergleich zu den Sphäroiden, die allein in Kollagen eingebettet waren. Tatsächlich zeigt die Analyse der Invasionsbereichskinetik im Laufe der Zeit für 99 Sphäroide mit Single-Spheroid-Auflösung deutlich, dass die Zugabe von Hyaluronsäure zum Kollagen die Zelldispersion aus dem Sphäroid hemmt, was zu kleineren Invasionsbereichen führt. Die Behandlung der HeLa-Sphäroidkultur mit einem bioaktiven Flavonoid mit zyto- und migrastatischen Eigenschaften für 24 Stunden führt zu einer gehemmten Zelldispersion um die Sphäroide im Vergleich zu unbehandelten HeLa-Sphäroiden.Tatsächlich ergab die Analyse der Invasionsbereiche von 488 Sphäroiden am Ende des Experiments eine signifikante Hemmung nach der Behandlung mit nur 10 Mikromolaren des Arzneimittels. Aufgrund der geringen Befestigungscharakteristik des Hydrogels erleichtert diese mikrokammerbasierte Technologie die Bildung von Sphäroidauchen auch bei sehr wenigen Zellen. Dies ist insbesondere bei wertvollen, begrenzten Krebsstamm- oder Patienten-abgeleiteten Primärzellproben von Vorteil.Die Hydrogel-Mikrokammer-Bildgebungsplatte ermöglicht die Analyse der genauen räumlichen Lage der Sphäroide bei Langzeitexperimenten zur Bewertung des Invasionsprozesses auf Ein-Elemente-Ebene und bietet ein hohes Maß an statistischer Robustheit und Genauigkeit. Zukünftige Anwendungen dieser Methode umfassen die nebeneinander liegende Multizellkultivierung von Tumor- und Stromalzellen in verschiedenen Regionen innerhalb des Makrobrunnens und das Abrufen einzelner Sphäroide für die nachgeschaltete molekulare Analyse.

analysis-cancer-cell-invasion-anti-metastatic-drug-screening-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Dieses Video beschreibt einen Invasionsassay mit einem Dreikammer-Array, das auf der elektrischen Impedanz basiert. Diese Technik misst das invasive Potenzial von Krebszellen unter dem Einfluss löslicher Faktoren, die von den residenten Stromazellen in Tumormikroumgebungen sezerniert werden.

Dreikammer-Array-basierter Impedanz-Assay: Eine Echtzeit-Analysetechnik zur Bewertung des invasiven Potenzials von Krebszellen durch Messung der elektrischen Impedanz

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

Der In-vitro-Zellinvasionstest wird verwendet, um das Potenzial von Krebsmetastasen zu messen, indem das zelluläre Potenzial für Invasion und Migration mithilfe von Zellkultureinsätzen, die Proteinmatrix enthalten, quantifiziert wird. Die Zellen werden herausgefordert, durch die Proteinmatrix und eine poröse Membran in Richtung eines Chemoattractants zu wandern und dann durch Lichtmikroskopie quantifiziert zu werden.

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Dies ist eine effektive Methode, um nach Suppressoren oder Treibern von Krebsmetastasen zu suchen. Zellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert werden, werden in das Gefäßsystem der Chorioallanto-Membran des Huhns injiziert, um metastatische Kolonien zu bilden. Kolonien mit verminderter oder erhöhter Invasivität werden herausgeschnitten, erweitert, neu injektiert, um ihren Phänotyp zu bestätigen, und schließlich mit Hochdurchsatzsequenzierung analysiert.

Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Der CAM-Delam-Assay zur Bewertung der metastasierenden Kapazität von Krebszellen ist relativ schnell, einfach und kostengünstig. Die Methode kann zur Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die die Metastasenbildung regulieren, und zum Drogenscreening eingesetzt werden. Ein optimierter Assay zur Analyse menschlicher Tumorproben könnte eine klinische Methode zur personalisierten Krebsbehandlung sein.

CAM-Delam-Assay zur Bewertung metastasierender Eigenschaften durch Quantifizierung der Delaminations- und Invasionskapazität von Krebszellen

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Lernen Sie die Analyse von Krebszellinvasion mit Hydrogel-Mikrokammer-Arrays für Hochdurchsatz-Screenings anti-metastatischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht präzise Überwachung von Tumorsphäroiden in 3D.

Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

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