Name: Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Erfahren Sie die spezifische Markierung von Neutrophilen mit MUB40-Peptid zur Visualisierung entzündungsvermittelter Prozesse in Geweben. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Granulasekretion und unterstützt die Forschung zu inflammatorischen Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) und ANR JCJC gewährt (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Alle hier beschriebene Methoden wurden überprüft und genehmigt von den französischen Organisationen CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) und CNIL (Kommission Nationale Informatique et Liberté).
1. Neutrophile im Histopathologie Gewebe mit Gewebekulturen Färbung gekennzeichnet MUB40
<ol><li>Um das Gewebe für die Histopathologie zu erhalten, befestigen Sie Gewebeentnahme/Abschnitte in einem geeigneten Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bis zu 4 h je nach der Dicke der Probe. Legen Sie die Proben im Kühlschrank 4 ° C, während der Fixierung. Hinweis: Alternative Fixierung Methoden/Timings können je nach individuellen Anforderungen des Benutzers ersetzt werden.<ol>
<li>Entfernen der PFA, fügen Sie 16 % Saccharose-Lösung mit genügend Volumen, um die Probe vollständig zu bedecken, und legen Sie die Probe bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.</li>
		<li>Entfernen Sie 16 % Saccharoselösung und fügen Sie 30 % Saccharoselösung bei einem großen genug um die Probe vollständig zu bedecken hinzu, und legen Sie sie bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.</li>
		<li>Entfernen Sie die 30 % Saccharose-Lösung und tupfen Sie überschüssige Lösung aus dem Gewebe mit einem Papiertuch. Die Gewebe-Abschnitt in optimale Temperatur (OCT) Medien und Snap-Freeze in 2-Methylbutane in Trockeneis-Ethanol Badewanne (-72 ° C) abgekühlt. Sobald (nach ~ 2 min) gefroren, entfernen Sie Blöcke aus der 2-Methylbutane und legen Sie sie auf Trockeneis, bis alle Blöcke fertig und bereit für die langfristige Lagerung sind. Speichern Sie die gefrorenen Blöcke bei-80 ° C für die langfristige Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Abend vorher Gewebe Blöcke sind zu schneiden, entfernen Sie sie aus dem-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie bei-20 ° C über Nacht equilibrate.<ol>
<li>Mit einem Kryostaten, schneiden Sie OCT-eingebettetes Gewebe in 10 - 30 μm dicke Scheiben und adsorbieren Sie, qualitativ hochwertige Glas-Objektträger. Hinweis: Dicker oder dünnere Scheiben können abhängig von den experimentellen Anforderungen verwendet werden.</li>
		<li>Zeichnen Sie mit einem Wachs-Stift oder anderen hydrophoben Methode ein Feld um die Gewebe-Scheibe auf den Objektträger und lassen Sie trocknen.</li>
		<li>Vorbereiten der Färbelösung durch Ausführen einer 1:1,000 Verdünnung der MUB40-Cy5 (oder andere fluoreszierende MUB40Version, 1 mg/mL Stammlösung) in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung. Die optimale MUB40 Endkonzentration sollte 1 μg/mL. Hinweis: Untere Endkonzentrationen verwendet werden (0,1-0,01 μg/mL), aber kann um zu niedrigeren Signalintensität führen. Achtung: Saponin Pulver kann Atmung Reizungen verursachen. Achten Sie darauf, Saponin in einem Schaltschrank oder geschützten Bereich wiegen. Alternative Permeabilisierung Methoden können z. B. Triton verwendet werden. Fügen Sie zusätzliche Markierungen bei vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen (zB., 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Phalloidin, fluoreszierende Antikörper).</li>
		<li>Tauchen Sie vorsichtig die Objektträger in eine Lösung von 0,1 % Saponin-PBS dreimal.</li>
		<li>Sorgfältig blot entfernt überschüssige Flüssigkeit um den Gewebe-Abschnitt und fügen Sie genug Färbelösung um Abschnitt Gewebe vollständig zu bedecken. Legen Sie die Folie in eine feuchte Kammer zur Vermeidung von Verdampfung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie es vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Tauchen Sie vorsichtig die Folie in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung 3 X. Dann tauchen Sie sanft die Folie in PBS-Lösung 3 X. Schließlich tauchen Sie sanft das Abrutschen in destilliertem H2O 3 X. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie.</li>
		<li>Fügen Sie eine kleine Menge (~ 20 μl) Eindeckmedium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5 % N-Propyl Gallat, 90 % Glycerin) neben der Gewebe-Scheibe und einem Glas Deckgläschen auf den Objektträger legen Sie sanft hin. Schonend und gleichmäßig drücken Sie das Deckglas auf Abschnitt Gewebe und mit einem Papiertuch, entfernen Sie vorsichtig alle Montage-Medien, die an den Rändern des Deckglases extrudiert.</li>
		<li>Legen Sie die montierte Folie in einem dunklen Schrank für 24 h erlauben die Montage-Medien zu festigen. Alternativ legen Sie die montierte Folie bei 37 ° C für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bild des Gewebes Scheiben auf einem fluoreszierenden Mikroskop nach der gewünschten Erwerbsmethode.</li>
</ol>2. Visualisierung von Neutrophilen Aktivierung mit Retro-Inverso-MUB40-Cy5 Peptid
<ol><li>Erhalten Sie menschlichen Neutrophilen verwenden das folgende Protokoll. Bereiten Sie die folgenden Lösungen und legen Sie sie in einer anoxischen Kabinett über Nacht. Einwirkung von Sauerstoff wird zur Aktivierung von Neutrophilen und weiter induzieren Zelle Tod16,17beginnen. Hinweis: Neutrophile können alternativ gereinigt werden "auf der Bank" für MUB40-Kennzeichnung Experimente; Beachten Sie jedoch, dass Sauerstoff Exposition Neutrophilenzahl Aktivierung auswirken wird.<ol>
<li>Bereiten Sie die folgende Lösung: Lösung 1 [0,9 % Natriumchlorid (NaCl)]: 500 mL H2O. Filter die Lösung 4,5 g NaCl hinzufügen. Lösung 2 (Dextran 6 %): 100 mL 6 g Dextran in NaCl 0,9 % Lösung hinzufügen. Lösung 3 (Waschen-Puffer): Auflösen von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in PBS pH 7,2 bis eine EDTA-Endkonzentration von 2 mM. Unmittelbar vor Gebrauch lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA) in der PBS/EDTA-Lösung so, dass die Endkonzentration BSA 10 % w/V auf.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Blutentnahmeröhrchen 650 X g für 20 min ohne Pause.</li>
		<li>Ohne Unterbrechung der getrennten Blut, übertragen Sie die Blutentnahmeröhrchen auf einer anoxischen Kabinett und sammle Plasma Brüche (oben) in einem 50 mL konische Röhrchen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Plasma-haltigen Rohr aus dem anoxischen Kabinett und Zentrifuge bei 2.900 x g für 20 min mit Pausen, um die Thrombozyten pellet.</li>
		<li>Ohne Unterbrechung die gebeizte Thrombozyten, überweisen Sie sanft die Plasma Röhre zurück auf der anoxischen Kabinett und Pipettieren der Thrombozyten Armen Plasma in ein frisches 50 mL Röhrchen (nachstehend "Plasma").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trennung von roten Blutkörperchen Leukozyten<ol>
<li>Verwenden die Röhrchen mit der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) aus Schritt 2.1.3., kombinieren die Erythrozyten in einer konischen 50 mL-Tube (5 Blut Sammlung Rohr Inhalt pro 50 mL-Tube).</li>
		<li>Fügen Sie NaCl 0,9 % hinzu, bis das Gesamtvolumen 44 mL erreicht. 6 mL Dextran 6 % (letzte) hinzugeben.</li>
		<li>Mischen Sie vorsichtig die Blut/Dextran-Mischung durch Umdrehen der Röhre 10 - 20 Mal. Lassen Sie das Rohr Sediment für mindestens 30 Minuten.</li>
		<li>Während Ablagerung stattfindet, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten 5,8 mL Plasma in einem 15 mL konische Röhrchen 4,2 mL Percoll-Lösung hinzu, und mischen Sie gut durch das Rohr invertieren.</li>
		<li>Sammeln der oberen Teil der Dextran bei dem Versuch, Pipettieren Erythrozyten zu vermeiden.</li>
		<li>Ziehen Sie die Schraubkappe, entfernen Sie die Dextran-Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 10 min mit Pausen.</li>
		<li>Vorsichtig setzen Sie den Schlauch wieder in anoxischen Kammer ohne zu stören die gebeizte Zellen, und entfernen Sie die Flüssigkeit über pipettieren.</li>
		<li>Sanft wieder aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL Plasma und sehr langsam an die Spitze der die Percoll-Lösung. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mischen der Schichten, wenn die Zellen an der Spitze Pipettieren zu induzieren.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Percoll-Lösung-Röhre von anoxischen Kammer (Vermeidung mischen) und Zentrifuge bei 800 X g für 20 min ohne Pause. Peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) bleibt auf die Percoll-Lösung-Oberfläche und Neutrophilen werden Pellets mit der Erythrozyten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung von kontaminierenden Erythrozyten<ol>
<li>Bereiten Sie 14 mL Pufferlösung zu waschen, indem Sie 14 mL Waschpuffer 700 μl PBS + 10 % BSA hinzufügen.</li>
		<li>Setzen Sie die Percoll-Lösung-Röhre wieder in der anoxischen Kammer. Entfernen Sie die Percoll und PBMCs über pipettieren und auszusetzen Sie gebeizte Zellen in 1 mL der Pufferlösung waschen wieder. Das Pellet wieder ausgesetzt sein wird eine rote Farbe aufgrund von kontaminierenden Erythrozyten haben.</li>
		<li>Die neu suspendierten Zellen 200 μL des Anti-CD235a (Glycophorin) magnetische Beads hinzufügen, vorsichtig mischen und mindestens 15 min inkubieren. Dieser Schritt lädt die kontaminierenden Erythrozyten mit magnetischen Beads, damit sie entfernt werden können.</li>
		<li>Waschen der Trennsäule mit 2 mL des Waschens Puffer 3 X.</li>
		<li>Halten Sie eine 15 mL konische Rohr unter der Spalte "Trennung" pipette langsam die Neutrophilen/RBC-Mischung auf den oberen Rand der Spalte. Sammeln Sie die Zellen in der 15 mL konische Röhre, wie sie durchfließen. Die Durchströmung sollte bewölkt sein und verlieren seine rote Farbe durch die Erythrozyten bleiben an der Spalte gebunden.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL Waschpuffer an die Spitze der Säule und sammeln Sie sich in der gleichen 15 mL konische Rohr. Bis zum Ende des Spülprogramms 2 mL sollte der durchströmten klar sein, was bedeutet, dass die Neutrophilen gesammelt worden sind.</li>
		<li>Mischen Sie vorsichtig das Rohr um sorgen für gleichmäßige Verteilung der Neutrophilen und 10 μL für Zellzählung zu sammeln. Beachten Sie das Endvolumen für Zelle zählen Zwecke. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Standardzelle Zählmethode auf.</li>
		<li>Entfernen der Neutrophilen Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren die Neutrophilen bei 300 X g für 20 min mit Pausen.</li>
		<li>Setzen Sie sedimentierte Neutrophilen anoxischen Kammer zurück und entfernen Sie waschen Puffer über pipettieren. Wieder aussetzen der Neutrophilen Pellet im Plasma mit einer maximalen Zelldichte von 107 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufzählung der gereinigten Neutrophilen und Visualisierung mit MUB40<ol>
<li>Fügen Sie 1 μL des RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL), 1 mL der eine Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ohne Phenol rot. Durch Pipettieren gut mischen.</li>
		<li>Für die Zwecke dieses Protokolls wurde das Ergebnis erläutert, wie wenn ein potenter Neutrophilen Aktivierung Reagenz, N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (FMLP), wird hinzugefügt. Die RPMI/RI-MUB401 μm FMLP hinzufügen-Cy5 Rohr und Mix über Pipettieren rauf und runter. Hinweis: Jeder Versuchsdurchführung wird von diesem Punkt vorwärts, je nach der Fragen unterscheiden.</li>
		<li>1 mL RPMI/RI-MUB40überführen-Cy5/FMLP-Mischung zu einer Glasschale unten Mikroskopie. Dieses Gericht fügen Sie ein Volumen von gereinigten Zellen entspricht 106 total Neutrophilen hinzu. Mischen Sie, indem Sie sanft pipettieren.</li>
		<li>Legen Sie die Schale in einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop und starten Sie Bildaufnahme zu. Beispielsweise empfiehlt es sich, Grundlinie Bilder vor der Zugabe von einer Aktivierung von Neutrophilen Reagenz wie FMLP oder Bakterien erwerben. In diesem Beispiel beginnen die Übernahme von RPMI/RI-MUB40-Cy5/Neutrophilen, und bei einer späteren Timepoint pipette die Aktivierung von Neutrophilen Reagenz in der Glasschale und Bildaufnahme fortsetzen. Hinweis: Änderungen an diesen Schritten können basierend auf wissenschaftlichen Bedürfnisse erfolgen.</li>
		<li>Prozess erworbenen Bilder/time-Zeitraffer Filme wie bezieht sich auf die speziellen Mikroskop verwendet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

B.S.M. wird als Erfinder auf MUB40 Patente aufgeführt:
MUB40: Europäische Patent EP11290403.2, 09.09.2011.
RI-MUB40: Europäische Patent EP Nr. 17306746.3, 12.11.17.

Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB40 Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB40 offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB40 als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von fluores...

Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB40. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt und Ort der Neutrophilen Aktivierung geortet werden. Dieses Protokoll ist ideal für Forscher, die Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release studieren möchten. Jenseits ihrer antimikrobiellen Funktionen werden Neutrophile jetzt als immunmodulatorische Zellen in einer Vielzahl von Krankheiten und Immunreaktionen (angeborene und adaptive)1,2geschätzt. Neutrophile sind im meisten entzündlichen Gewebe, bei hohen Stückzahlen im infizierten Gewebe, entzündliche Tumoren3, während IBS und Morbus Crohn Schübe4, und in Bereichen der nicht-infektiöse Entzündung wie die Synovia der rheumatoiden Arthritis ( RA) Patienten5. Neutrophilen enthalten vier Klassen von vorgeformten Körnchen namens Azurophil (α), spezifische (β1), Tertiär (β2) Granulat und sekretorischen Vesikel (γ)6. Bei der Migration zu einer entzündlichen Site rekrutierte Neutrophilen werden aktiviert und sequenziell sezernieren Granulat Inhalte (bestehend aus Adhäsion, antimikrobielle Substanzen und immunmodulatorischen Molekülen), die fördert weitere Rekrutierung und trägt zur Infektion Auflösung (aber auch zu Host Gewebeschäden)7. Während Neutrophile gelten ein kritischer Aspekt der angeborenen Immunität, bisher gibt es sind einige Nachweisreagenzen zur Verfügung, um sie zu studieren, und noch weniger, die kann verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der lebenden Neutrophilen zu beurteilen.
Aktuelle Methoden zur Erkennung von neutrophilen Granulozyten verlassen sich auf monoklonale Antikörper gegen die Zelloberfläche exponierten Antigene, wie Ly - 6 G2 oder Proteine im einzelnen gespeichert in Neutrophilen Granulat unter basalen Bedingungen (z. B. Myeloperoxidase erzeugt Lactoferrin). Vorteile von monoklonalen Antikörpern sind ihre starke Bindung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit unter verschiedenen Assay-Bedingungen. Es gibt jedoch einige Nachteile mit monoklonalen Antikörpern und Anti-Ly - 6G im besonderen. Diese Nachteile sind die Spezifität, Ly - 6G auf der Mehrzahl der myeloischen Zellen im Knochenmark und auf alle einschließlich der eosinophilen Granulozyten vorliegt; Entschlüsselung von Neutrophilen aus eosinophilen mit dieser Marker erfordert daher mehr komplexe Ansätze8. Eine weitere häufige Kompromiss mit monoklonalen Antikörpern ist ihre oft begrenzte Spezifität Wirtsspektrum, Vergleichsstudien mit mehreren Tierarten erschwert. Ein dritter Nachteil der Antikörper Abfragung Methoden, insbesondere bei Verwendung von lebenden Zellen oder in vivo, ist ihr Potenzial Zellfunktionen zu stören oder zu Zellaktivierung führen. Beispielsweise wird die Verwaltung von Anti-Ly - 6 G, Mäuse häufig auf Neutrophilen Erschöpfung und vorübergehende Neutropenie9angewendet. Zudem ist nachgewiesen, dass Antikörper Injektion Neutrophilenzahl Antitumor-Funktion10stimulieren kann. Schließlich verrät Antikörpernachweis der Neutrophilen nicht den Aktivierungsstatus der Zelle.
Wir haben festgestellt, dass eine 40-amino Acid Peptid namens MUB40, die in einer Reihe von Tests zu beschriften Neutrophilen in Vitro oder in Vivo Bedingungen sowie die Aktivierungsstatus des live Neutrophilen11assay verwendet werden können. MUB40 leitet sich vom MUB7012, eine Domäne der Lactobacillus Reuteri Oberfläche Schleim-Bindeprotein ursprünglich für seine Fähigkeit, Schleim13,14binden beschrieben. MUB40 interagiert mit glykosylierten Lactoferrin, das in hohen Konzentrationen in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden ist. MUB40 können diese Module durch standard Permeabilisierung Schritte in Histopathologie oder Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Protokolle für robuste Färbung der festen Neutrophilen ausgesetzt werden. Wenn live Neutrophilen in einem inaktivierten Zustand gehalten werden, das MUB40 Peptid ist aus dem Granulat Inhalt ausgeschlossen, und Zellen keine Flecken, positiv mit dem Marker. Nach der Aktivierung können MUB40 binden an exponierten Lactoferrin und zu robusten Färbungen mit das Peptid führen. So kann MUB40 verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der gereinigten Neutrophilen, so dass es einen attraktive Marker der infektiösen Prozess folgen bestimmen. Auch Möglichkeit, binden an aktivierte Neutrophilen Leben MUB40 als Werkzeug verwendet werden, um Bereiche der Neutrophilen Entzündung in live Tiermodellen (z. B. einer Maus Arthritis Modell15) zu erkennen. Die Protokolle in diesem Manuskript Detail wie Eindringmittel beschriftet MUB40 einsetzbar, Neutrophile in Histologie Gewebe und wie man die Aktivierung des live gereinigten Neutrophilen in-vitro-Tests zu offenbaren.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Fluoreszierendes MUB40Peptid (mit anderen konjugierten Fluorophoren erhältlich)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Retro-inverso fluoreszierendes MUB40-Peptid. Synthetisiert mit D-Aminosäuren und resistent gegen Proteasen (erhältlich mit anderen konjugierten Fluorophoren)</td></tr><tr><td>Parformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Fixiermittel für die Histologie</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Lösung zur Entfernung von überschüssigem PFA</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Wird zum Einfrieren von Gewebe vor dem Kryostatenschnitt</td></tr> <tr>verwendet<td>2-Methylbutan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Wird zum Einfrieren von Gewebe vor dem Kryostatenschnitt</td></tr><tr><td>verwendet Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Wird für ein Trockeneisbad zum Einfrieren von Gewebe</td></tr><tr><td>verwendet Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Wird zum Schneiden von Geweben</td></tr><tr><td>verwendet Glasmikroskopie-Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Hi precision Deckglas</td></tr><tr><td>Dako Kugelschreiber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Zur Vermeidung von Flüssigkeitsverlust bei der Gewebefärbung</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Zur Permeabilisierung von Zellen für die ZF-Färbung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>zur DNA-Färbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Bindet Aktin</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading Eindeckmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Verlängert das ZF-Signal und die Beständigkeit gegen Photobleiche</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Mikroskop</td><td>Verschiedenes</td><td>Wird</td><td>zur Abbildung von IF-Objektträgern</td></tr><tr><td>verwendet Anoxischer Schrank</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td>Wird zur Reinigung von lebenden inaktivierten Neutrophilen</td></tr> verwendet <tr><td>Natriumchlorid NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Waschpufferkomponente</td></tr><tr><td>MACS BSA Puffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Waschpufferkomponente</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Gradient für die Reinigung von Neutrophilen</td></tr><tr><td>CD235a Glykophorin magnetische Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Zur Entfernung von kontaminierenden Erythrozyten</td></tr><tr><td>LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Zur Entfernung von Erythrozyten aus Neutrophilen</td></tr><tr><td>RPMI-1640 ohne Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Wird für Neutrophilen-Assays</td></tr></tbody></table> verwendet

das mub40 peptid für den einsatz bei der aufdeckung von neutrophilen-vermittelte entzündung veranstaltungen

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB40, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB40 direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB40 die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB40 hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.

Ergebnisse der MUB40-gefärbten Gewebe von Histopathology Dias zeigen in der Regel einzelne Zellen in das Gewebe verteilt. MUB40 Flecken Lactoferrin, die ist in Neutrophilen Granulat und Abteilen. So gesehen, in der Regel punctata beflecken oder mehrere große getrennte Bereiche des Signals aus einzelnen Neutrophilen (Abbildung 1) kommen. Es ist hilfreich, fügen eine zweite Zelle Markierung wie DAPI zu helfen, das MUB40 Signal m...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.

Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 ist ein neuartiger Neutrophiler Marker, der an Lactoferrin bindet und einen spezifischen Nachweis in menschlichen und allen bisher getesteten Säugetiergewebeproben ermöglicht. Die Etikettierung von Neutrophilen mit MUB40 ist einfach, schnell und spezifisch. Es ist jetzt weit verbreitet in unserem Labor verwendet und die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose von entzündlichen Erkrankungen.Um zu beginnen, bereiten Sie Lösungen eins, zwei und drei nach dem Textprotokoll, und legen Sie sie in einem anoxischen Schrank über Nacht. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen des gesammelten Blutes bei 650 g für 20 Minuten, um die Zellen von der Plasmafraktion zu trennen. Ohne das abgetrennte Blut zu stören, übertragen Sie die Röhrchen in den anoxischen Schrank und übertragen Sie die Plasmafraktionen in eine 50 Milliliter konische Röhre.Danach entfernen Sie die Plasmaröhre aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie sie 20 Minuten lang bei 2900 g. Achten Sie darauf, die pelletierten Blutplättchen nicht zu stören, übertragen Sie das Rohr in den anoxischen Schrank und Pipette der Thrombozyten arme Plasma in eine frische 50 Milliliter Rohr. Kombinieren Sie die roten Blutkörperchen mit den Blutentnahmeröhrchen in einer konischen 50-Milliliter-Röhre.Dann fügen Sie 0,9% Natriumchlorid-Lösung, bis das Gesamtvolumen erreicht 44 Milliliter, und fügen Sie sechs Milliliter von 6%dextran. Invertieren Sie die Röhre 10 bis 20 Mal, um das Blut und die Dextran-Mischung sanft zu mischen, und lassen Sie das Rohr für mindestens 30 Minuten sedimentieren. Während die Rohrsedimente, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten, indem Sie 4,2 Milliliter Percoll-Lösung zu 5,8 Milliliter Plasma hinzufügen, und invertieren Sie die Röhre zu mischen.Als nächstes sammeln Sie die Neutrophilen mit topem Bruch des Dextrans, wobei Sie darauf achten, keine roten Blutkörperchen zu pipette. Ziehen Sie den Schraubverschluss fest, entfernen Sie das Dextran-Rohr aus dem Anoxic-Schrank, und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 10 Minuten. Achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören, legen Sie das Rohr wieder in den anoxischen Schrank.Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Pipettieren. Das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Plasma wieder aufhängen. Fügen Sie die resuspendierten Zellen langsam an die Oberkörper der Percoll-Lösung an.Entfernen Sie das Percoll-Lösungsrohr vorsichtig aus dem anoxischen Schrank und zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 800 g, um PBMCs von Neutrophilen zu trennen. Als nächstes bereiten Sie 14 Milliliter Waschpufferlösung nach dem Textprotokoll vor. Legen Sie dann das Percoll-Rohr in den anoxischen Schrank.Verwenden Sie eine Pipette, um die Percoll- und PBMCs zu entfernen und das neutrophil haltige Pellet in einem Milliliter Waschpufferlösung wieder aufzuhängen. Als nächstes fügen Sie den resuspendierten Zellen 200 Mikroliter Magnetperlen hinzu. Die Zellen und Perlen mindestens 15 Minuten lang sanft mischen und bebrüten.Danach eine Trennsäule zweimal mit zwei MilliliterWaschpuffer waschen. Während Sie eine neue, 15 Milliliter konische Röhre unter der Säule halten, pipetten Sie langsam die neutrophile rote Blutkörperchenmischung durch die Säule. Der Durchfluss aus der Säule sollte trüb sein und seine rote Farbe verlieren, was die vollständige Trennung von Neutrophilen von den verbleibenden roten Blutkörperchen bestätigt.Fügen Sie zwei Milliliter Waschpuffer an den oberen Rand der Säule und sammeln Sie den Durchfluss in der gleichen Röhre. Am Ende dieser Wäsche sollte der Durchfluss klar sein. Mischen Sie das Sammelrohr vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neutrophilen gleichmäßig verteilt sind.Dann sammelten 10 Mikroliter des Durchflusses aus der Zellzählung. Danach entfernen Sie das Neutrophilenrohr aus dem anoxischen Schrank und zentrieren Sie das Rohr bei 300 g für 20 Minuten. Legen Sie die sedimentierten Neutrophilen wieder in den anoxischen Schrank und entfernen Sie den Waschpuffer durch Pipetten.Setzen Sie dann das Pellet im Plasma wieder aus. Fügen Sie einen Mikroliter RI-MUB40-Cy5 zu einem Milliliter RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot hinzu und mischen Sie sie über Pipettieren. Fügen Sie dann einen Mikroliter FMLP-Lösung und Pipette zum Mischen hinzu.Übertragen Sie die Mischung auf eine Glasbodenmikroskopieschale. Dann fügen Sie ein entsprechendes Volumen von gereinigten Zellen auf die Schale. Schließlich legen Sie die Schale in ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und starten Sie die Bildaufnahme.In diesem Protokoll wurde MUB40 auf lebenden Zellen verwendet, um neutrophile Sekretion bei simulation mit FMLP zu erkennen. Die Dynamik der Freisetzung von Granulatgehalt, einschließlich Lactoferrin, kann im Laufe der Zeit visualisiert werden, hier in Magenta. MUB40 kann zusätzlich bei festen Neutrophilen angewendet werden.Hier phagozytisieren fluoreszierende Perlen in einer zeitgezeitierten Serie. Der Inhalt des Neutrophilen Granulats ist hier blau beschriftet. Die Neutrophile zeigten wenig bis gar keine Zellfärbung zu frühen Zeitpunkten und allmählich nahm die RI-MUB40-Etikettierung im Laufe der Zeit zu, sowohl auf der Plasmamembran als auch auf der Perlenoberfläche.MUB40 kann auch auf festen entzündlichen Geweben verwendet werden, um Neutrophile gezielt zu erkennen, wie in den Textabbildungen gezeigt. Wir beschreiben hier das Neutrophilenreinigungsverfahren, das routinemäßig in unserem Labor angewendet wird. Jede andere Methode ist geeignet, MUB40-Cy5 Etikettierung wird immer noch funktionieren.Neutrophil kann nach der Reinigung spezifisch mit MUB40 gekennzeichnet werden oder direkt in entzündetem Gewebe von Patienten oder Tiermodellen. Mehrere MUB40-Derivate wurden entwickelt, um seine Verwendung zu erweitern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entzündung, um neutrophile Rekrutierung und Aktivierung bei entzündlichen Erkrankungen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen Degranulationsassay von azurophilen Granula in Maus-Neutrophilen, bei dem Neutrophile stimuliert werden, um myeloperoxidasehaltige azurophile Granula freizusetzen. Die anschließende enzymatische Reaktion wird verwendet, um den Myeloperoxidase-Spiegel zu quantifizieren und so einen Einblick in die Aktivierung von Neutrophilen zu erhalten.

Ein Assay zur Überwachung der Degranulation von azurophilen Granulaten in Neutrophilen nach der Aktivierung

Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.

In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.

Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen

Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.

Überwachung der NeutrophilenElastase- und Cathepsin-G-Aktivität in menschlichen Sputumproben

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Erfahren Sie die spezifische Markierung von Neutrophilen mit MUB40-Peptid zur Visualisierung entzündungsvermittelter Prozesse in Geweben. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Granulasekretion und unterstützt die Forschung zu inflammatorischen Erkrankungen.

Das MUB₄₀ Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

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