Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese
28. September 2018
Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Zusammensetzung und dynamische Organisation der photosynthetischen Proteinkomplexe in der pflanzlichen Thylakoidmembran zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse funktioneller Wechselwirkungen zwischen nativen Proteinkomplexen ermöglicht und die Plastizität der Proteinkomplexorganisation unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen aufklärt. Richten Sie den Gelgießer mit 0,75-Millimeter-Abstandshaltern um acht Zentimeter mal 10 Zentimeter nach Herstelleranleitung ein.
Legen Sie einen Gradientenmischer auf eine Rührplatte und verbinden Sie ihn mit der Peristaltikpumpe durch Schläuche. Befestigen Sie eine Spritzennadel am anderen Ende des Schlauches und legen Sie die Nadel zwischen Glas und Aluminiumplatte. Legen Sie einen Magnetrührer in die schwere Kammer.
Bereiten Sie 3,5% und 12,5% Acrylamidlösungen in 15-Milliliter-Konifugenröhren vor, wie im Textprotokoll beschrieben, um sie für den Trenngelgradienten zu verwenden. Um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, halten Sie die Zentrifugenrohre bei der Vorbereitung der Lösungen auf Eis. Fügen Sie 5%APS und TEMED direkt hinzu, bevor Sie die Lösungen an den Gradientenmischer anbringen.
Pipette die 12.5%Lösungen für die schwere Kammer. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kanal, der die leichte und schwere Kammer verbindet, indem Sie das Ventil öffnen, das die beiden Kammern verbindet, so dass die Lösung in die Lichtkammer eindringen kann. Schließen Sie das Ventil und pipette die Spuren der Lösung zurück in die schwere Kammer.
Schließlich pipette die 3,5%Lösung für die Lichtkammer. Schalten Sie den Magnetrührer ein. Öffnen Sie die Ventile, und schalten Sie die Peristaltikpumpe ein.
Lassen Sie die Gellösungen zwischen Glas und Aluminiumplatte mit einer Durchflussrate von etwa 0,5 Milliliter pro Minute fließen. Die Nadel muss sich jederzeit über der Flüssigkeit begeben. Wenn die schweren und leichten Kammern geleert haben, füllen Sie sie mit reinstem Wasser.
Und lassen Sie Wasser die Geloberfläche sanft überlagern. Die Gelpolymerisation dauert etwa ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die 3%Acrylamid-Lösung für das Stapelgel bei Raumtemperatur vor.
Pipette das Stapelgel auf dem polymerisierten Trenngel und legen Sie einen Probengelkamm zwischen glas- und Aluminiumplatte, um Luftblasen zu vermeiden. Nachdem Das Gel 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur polymerisiert werden kann, entfernen Sie den Kamm vorsichtig unter reinem Reinstwasser. An dieser Stelle kann das Gel bei positiven vier Grad Celsius in feuchten Bedingungen für ein paar Tage gelagert werden.
Isolierte Thylakide mit eiskaltem 25BTH20G Puffer auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen. Bereiten Sie zwei Röhren für jede Thylakoidprobe vor, um sowohl Beta-DM als auch Digitonin-Lösung durchzuführen. Fügen Sie nun ein gleiches Volumen an Waschmittelpuffer hinzu.
Mischen Sie das Waschmittel und thylakoid Probe sanft mit einer Pipette und vermeiden Sie Luftblasen. Solubilisieren Sie die Thylakoide für zwei Minuten auf Eis für die Beta-DM-Lösung. Oder 10 Minuten bei Raumtemperatur mit kontinuierlich sanftem Mischen auf einer Wippe oder einem Shaker zur Digitonin-Löslichkeit.
Nach der Inkubation das unlösliche Material durch Zentrifugation bei 18 000 g für 20 Minuten bei positiven vier Grad Celsius entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie der Probe 1/10 Volumen Coomassie-brillanten blauen Puffer hinzu. Richten Sie das Gel in einem vertikalen Elektrophoresesystem ein.
Füllen Sie die obere Pufferkammer mit einem blauen Kathodenpuffer und gießen Sie den Anodenpuffer in die untere Pufferkammer. Die Thylakoidproben in die Brunnen laden. Starten Sie die Elektrophorese und erhöhen Sie schrittweise die Spannung, wie im Textprotokoll aufgeführt.
Führen Sie das Gel bei positiven vier Grad Celsius entweder mit einem Kühlraum oder mit einem Kühlsystem die Geltemperatur ein. Ändern Sie den blauen Kathodenpuffer in einen klaren Kathodenpuffer, wenn die Probenfront etwa 1/3 des Gels migriert hat. Nach dem elektrophoretischen Lauf scannen Sie das Gel mit einem Fotoscanner zur Bildarchivierung.
Um 2-SDS PAGE durchführen, montieren Sie das vertikale Elektrophoresesystem mit einem Millimeter Abstandshaltern. Bereiten Sie ein Standard-SDS-Gel mit einem 2D-Kamm vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie die Spur aus dem BN-Gel und legen Sie es in einem Fünf-Milliliter-Rohr.
Dann fügen Sie zwei Milliliter Laemmli Puffer und inkubieren Sie den Streifen für 45 Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die Spur mit Hilfe eines Abstandsabstands auf dem Gel, um Luftblasen zu vermeiden. Fünf Mikroliter Molekulargewichtsmarker auf einem schmalen Stück Filterpapier anpfeifen und das Papier in den Standardbrunnen legen.
Um den BN-Gelstreifen und das Markerpapier zu versiegeln, gießen Sie eine 0,5%Agarose in Laufpuffer auf den Gelstreifen und lassen Sie ihn erstarren. Elektrophorese nach Standardprotokollen durchführen. Nach dem elektrophoretischen Lauf visualisieren Sie die Proteine mit SUPRO Ruby Fleck oder Silber färbung.
Repräsentative Ergebnisse von Thylakoid-Protein-Komplexmustern von Beta-DM- und digitonin-solubilisierten Proben werden hier gezeigt. Die kleinen Komplexe wandern während des elektrophoretischen Laufs schneller und befinden sich daher im unteren Teil des Gels. Während sich die großen Komplexe im oberen Teil des Gels befinden.
Digitonin bewahrt proteinkomplexe in größeren Baugruppen in der Regel, während Beta DM die labilen Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den Komplexen stört. Die Untereinheitszusammensetzung von Proteinkomplexen von Beta-DM und digitonin-solubilisierten Thylakoiden wird hier vorgestellt. Die Untereinheiten jedes Komplexes werden aus der vertikalen Linie unterhalb des ausgerichteten Komplexes gefunden.
Grundsätzlich stellt jeder Punkt im 2-D-Gel ein individuelles Protein dar. Aber in der Praxis können mehrere Proteine mit derselben Molekularmasse an einem einzigen Punkt vorhanden sein. Die Identifizierung der Flecken basiert auf einer Massenspektrometrieanalyse.
Nach Anwendung dieses Verfahrens kann man mit anderen Methoden wie Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse der aus dem blauen nativen Gel eluierten Proteinkomplexe fortfahren, um strukturelle Einblicke in die Proteinkomplexe zu erhalten. Um unbekannte Proteinuntereinheiten zu identifizieren, können die einzelnen Proteinflecken aus zweidimensionalem SDS PAGE mit Massenspezifikation analysiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid und Digitonin extrem schädlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Analyse der Organisation und Zusammensetzung pflanzlicher Thylakoid-Proteinkomplexe mittels blauer nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Obwohl die Methode für Arabidopsis thaliana optimiert ist, kann sie an andere Pflanzenarten angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Photosynthese
- Proteinkomplexanalyse
Hintergrund
- Das Verständnis der Zusammensetzung photosynthetischer Protein-Komplexe ist entscheidend für die Pflanzenbiologie.
- Thylakoidmembranen spielen eine zentrale Rolle bei der Photosynthese.
- Die Organisation von Protein-Komplexen kann sich unter verschiedenen Umweltbedingungen unterscheiden.
- Mittels BN-PAGE ist die Analyse nativer Protein-Komplexe möglich.
Zweck der Studie
- Aufklärung der Organisation und Zusammensetzung der Thylakoid-Protein-Komplexe.
- Untersuchung funktioneller Wechselwirkungen zwischen Protein-Komplexen.
- Beurteilung der Plastizität der Organisation von Protein-Komplexen.
Verwendete Methoden
- Blau-native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE)
- Zweidimensionale SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE)
- Aufbau eines Gradientenmischers zur Gelpräparation
- Verwendung einer Peristaltikpumpe und eines Magnetrührers zum Gießen der Gele
Hauptergebnisse
- Das Protokoll zeigt erfolgreich die Zusammensetzung der Thylakoid-Proteinkomplexe auf.
- Funktionelle Wechselwirkungen zwischen nativen Proteinkomplexen können analysiert werden.
- Die dynamische Organisation von Proteinkomplexen kann unter wechselnden Bedingungen bewertet werden.
- Die Anpassungsfähigkeit der Methode für verschiedene Pflanzenarten ist bestätigt.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode liefert Einblicke in die Organisation photosynthetischer Protein-Komplexe.
- Sie vertieft das Verständnis der Anpassungsfähigkeit pflanzlicher Proteine an Umweltveränderungen.
- Das Protokoll kann ein wertvolles Werkzeug für Forschende sein, die die Pflanzenbiologie untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Zusammensetzung und dynamischen Organisation photosynthetischer Protein-Komplexe liefert mechanistische Einblicke in Energiewandlungswege, die für die Entwicklung bio-basierter Produkte relevant sind. Die Blaue Native-PAGE ermöglicht die Analyse funktioneller Wechselwirkungen nativer Multiprotein-Assemblierungen und unterstützt die Zielvalidierung in photosynthetischen Systemen. Diese Methode hilft, frühe Hypothesen abzusichern, indem sie die Stabilität der Komplexe und deren Wechselwirkungen unter wechselnden Umweltbedingungen aufklärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem die Zusammensetzung und Untereinheitenorganisation nativer Protein-Komplexe in Thylakoidmembranen aufgeklärt werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch direkte Visualisierung der Plastizität und Stabilität von Komplexen unter kontrollierten Solubilisierungsbedingungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem stabile von labilen Protein-Protein-Wechselwirkungen anhand von Digitonin im Vergleich zu Beta-DM-Detergenzien unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet solubilisierte Thylakoid-Komplexe für die nachgeschaltete Analyse mittels standardisierter BN-PAGE-Trennung mit reproduzierbaren Migrationsmustern vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt auflösbare Komplexe-Profile, die den Vergleich von Assemblierungszuständen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Plattform-Wiederverwendung: Ermöglicht eine anschließende 2D-SDS-PAGE zur Identifizierung von Untereinheiten und erweitert so die Nützlichkeit über die anfängliche Komplexcharakterisierung hinaus.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die komplexen Organisationen im Entdeckungsstadium mit der funktionalen photosynthetischen Leistung unter wechselnden Umweltstressoren.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt, wie Umweltstörungen die Bildung von Suprakomplexen beeinflussen, und liefert Erkenntnisse für vorhersagende Modelle zur Robustheit von Stoffwechselwegen.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Überwachung der Dissoziation oder Neubildung von Komplexen als mögliche Indikatoren für die Effizienz der Photosynthese.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen die Integrität nativer Komplexe vor einer reduktionistischen Analyse erforderlich ist, und ermöglicht den Übergang von der Isolierung von Organellen bis hin zu funktionellen Untersuchungen und strukturellen Nachuntersuchungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Integrität der photosynthetischen Elektronentransportkette, indem PSII-, PSI-, Cyt-b6f- und ATPase-Komplexe in ihrer nativen Form aufgetrennt werden.
- Screening: Liefert kompatibel zur Analyse vorbereitete Komplexe mit quantitativer Bandenauflösung zur vergleichenden Untersuchung der Wirkung von Detergenzien auf die Solubilisierung.
- Analytik: Erzeugt migrationsbasierte Messgrößen, die es Teams ermöglichen, Stabilität und Häufigkeit der Komplexe unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Organisation der Komplexe mit der photosynthetischen Funktion und schafft so eine Brücke zu phänotypischen Ergebnissen unter Stressbedingungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung membranständiger Protein-Komplexe in Pflanzensystemen, die durch Anpassung des Protokolls auf andere Arten übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem native Wechselwirkungen erhalten bleiben und komplexe Dynamiken aufgeklärt werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung durch Gießen von Gradientengele und reproduzierbare elektrophoretische Trennung unter kontrollierter Temperatur.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem mechanistische Unklarheiten in der Ingenieurtechnik photosynthetischer Signalwege reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf komplexen Stabilitäts- und Interaktionsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Solubilisierung von Membranproteinen und in nativen elektrophoretischen Techniken.
- Ist abhängig von einem Gradientenmischer, einer peristaltischen Pumpe und vertikalen Elektrophorese-Systemen mit Temperaturregelung.
- Erfordert die Standardisierung von Detergens-Solubilisierungsprotokollen (beta-DM vs. Digitonin), um eine reproduzierbare Erhaltung der Komplexe sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Pflanzenarten aufgrund von Unterschieden in der Zusammensetzung der Thylakoidmembranen.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie die Zerstörung labiler Komplexe durch beta-DM und die Notwendigkeit der Kompatibilität mit Kühlräumen oder Kühlsystemen während der Elektrophorese.
