Name: Ein Hyperandrogenic Mausmodell, PCO-Syndrom zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines PCOS-Mausmodells mit Dihydrotestosteron-Pellets zur Untersuchung von Hyperandrogenismus und dessen Auswirkungen auf die Nachkommen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (Zuschüsse R00-HD068130, S.W) und dem Baltimore Diabetes Research Center: Piloten und Machbarkeit Stipendium (S.W).

Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Protokolle für DHT Pellet Vorbereitung und Eingliederung "und" für reproduktive und metabolischen Tests. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendeten waren eine gemischte Hintergrund (C57/B6, CD1, 129Sv) und waren gepflegt mit Nahrung und Wasser Ad Libitum in einem 14/10 h-Hell-Dunkel-Zyklus bei 24 ° C in der Broadway-Forschungsgebäude Tierhaus an der Johns Hopkins University School of Medizin. Alle Verfahren wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Erstellen Sie PCOS-wie Maus-Modell
<ol><li>
DHT-Pellet-Vorbereitung
	<ol>
<li>Autoklaven Silastic Schläuche zu sterilisieren. Geschnitten Sie Silastic Rohre auf eine Länge von 15 mm mit einer Rasierklinge;</li>
		<li>Versiegeln Sie einseitig durch die Injektion von medizinischen Klebstoff Silikon in das Rohr mit einer 20 G abgestumpften Nadel an einer 3 mL Spritze befestigt. Kolben muss aus der Spritze und dann Klebstoff eingefügt in das Reservoir zurückgezogen werden. Der Kolben wieder eingefügt und Klebstoff nach unten gedrückt, bis sie anfängt, sich von der Nadel. Die abgestumpften Nadel erfolgt durch die scharfe Spitze Seite der Nadel 20 G mit einer starken Schere schneiden. Die Länge des Siliziums in der Röhre sollte mehr als 2 mm betragen, damit für die Postproduktion Trimmen sein;</li>
		<li>Über Nacht trocknen; Suchen Sie nach Luftblasen auf der geschlossenen Seite. Diejenigen mit keine Luftblasen sind für DHT Pellets verwendet. Andere können für keine-DHT Kontrolle Pellets verwendet werden.</li>
		<li>Tragen Sie Handschuhe, Maske, Schutzbrille und Kittel vor DHT-Pellet in eine Kapuze DHT auf der Haut zu vermeiden.</li>
		<li>Gießen Sie DHT Pulver in einem Kunststoff wiegen Boot und drücken Sie die offene Seite des Klebers in das DHT-Pulver Röhren (produziert in a1. 1) begrenzt.</li>
		<li>DHT-Pulver kann mit einer Büroklammer verstopft werden nach unten, die begradigt ist.  Weiter bis DHT eine Höhe von 4 mm (oder gewünschte Länge erreicht). Überprüfen Sie die Länge von DHT mit einem Lineal, und verschließen Sie die offene Seite mit Silikon, trocken über Nacht.</li>
		<li>Schneiden Sie jede versiegelte Seite um an die Länge des Siliziums 2 mm lang. Die Gesamtlänge der Pellet wird 8 mm betragen.</li>
		<li>Beide Seite des leeren Silastic Schläuche als Kontrolle (keine-DHT) Pellet zu versiegeln.</li>
		<li>Pellets werden in einem 50 mL konische Rohr gewickelt mit Folie (zum Lichteinfall zu verhindern) bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung. Die DHT-Pellets erhalten volle Wirksamkeit für mindestens 3 Monate Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DHT einsetzen und Ersatz
	<ol>
<li>Bis zu 20 DHT eingetaucht sind Pellets oder Kontrolle Pellets separat in einem 50 mL konische Röhrchen mit 30 mL sterile 0,9 % Kochsalzlösung für 24 h bei 37 °C für Gleichgewichtherstellung kurz vor einsetzen.</li>
		<li>Vor der Operation sind die Oberflächen und Handschuhe sind mit Clidox desinfiziert und die Arbeitsflächen mit saubere Kunststoff gesicherte saugfähiges Papier (op Pad).  Alle Instrumente, die mit Tieren in Kontakt gekommen sind vor dem Eintritt in die Tierstation durch Autoklavieren dekontaminiert.  Instrumente, trockenen und kühlen vor Gebrauch dürfen.</li>
		<li>2 Monate alten weibliche Mäusen verwendet (4 – 5 Mäuse/Käfig). Mäuse sind intraperitoneal mit Xylazin injiziert (3,5 mg/kg bw) und Ketamin (78,8 mg/kg bw) mit einer Insulin-Spritze. Berechnungen für mischen und Dosieren Anästhesie ist in Tabelle 1.</li>
		<li>Nach ausreichende Anästhesie, erreicht ist gemessen am Verlust der Zehe Reflex und Atmung verlangsamte, wird die Maus für die Operation vorbereitet.</li>
		<li>Die Haut des Gebiets mit Betadine mit steriler Gaze desinfizieren und reinigen mit 70 % Ethanol.  Das Gebiet wird wieder mit Betadine bemalt werden.</li>
		<li>Schneiden Sie ein Loch ca. 5 mm unter der Haut in der Nähe des Halses Länge mit Schere. Mit einer 10 G Trochar stellen Sie einen kleinen Tunnel (15 mm) in Richtung rostral. Das Pellet wird dorsal mit der Trochar eingefügt.</li>
		<li>Die Eröffnung ist dann mit chirurgischen Klebstoff versiegelt. Manuell ungefähre Ränder die Wunde mit Zange und sanftes Bürsten Striche, eine dünne Schicht flüssigen Klebstoff auf die angenäherten Wundränder anzuwenden. Aufbau 3 dünne Schichten Kleber um sicherzustellen, dass der Klebstoff gleichmäßig über die Wunde. Der Kleber sollte 1 cm auf jeder Seite des adaptiert Wundränder erweitern. Naht oder chirurgische Clips können auch verwendet werden, um das Loch zu schließen. Setzen Sie wieder Mäuse Käfig, einzeln untergebracht, mit einem Wärmekissen für Erholung. Ersetzen Sie Pellet alle 4 Wochen, um ein konstantes Niveau von Androgen Belichtung zu erhalten. Das ursprüngliche Pellet werden entfernt und neue Pellet wird wie beschrieben in A1.15 in der ähnlichen Position eingefügt werden.</li>
		<li>Testen Sie estrous Zyklizität nach 3 Tagen von DHT einsetzen. Estrous Zyklus-Phase wird durch vaginale Zytologie beurteilt.  Vaginale Zellen werden mithilfe einer Pipette p10 um sterile Kochsalzlösung (etwa 10 µL) in die vaginale Hohlraum zu Spritzen und dann Rückzug der Kochsalzlösung mit der gleichen sterilen PIPETTENSPITZE für 16 aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt.  Vaginale Zellen abgestoßen von vaginalen Wand mischen mit Kochsalzlösung und gesammelt werden.</li>
		<li>Kochsalzlösung mit Zellen in eine beschriftete Folie zu verbreiten. Jede Folie kann sechs Proben enthalten. Folien sind beschriftet, damit beachten die Probe an jedem der sechs Standorte platziert wird.</li>
		<li>Nach der Saline wurde vollständig auf die Folie legen Dias in einen Behälter mit 100 % Ethanol, Zellen zu beheben ausgetrocknet. Folien sollten mindestens 5 min lang behoben werden, aber können auf unbestimmte Zeit bis zur weiteren Verwendung in Fixiermittel bleiben.</li>
		<li>Setzen Sie Folien in befleckenden Lösungen für 1 min für Puffer B und C. Wash Folien mit Leitungswasser und bei Zimmertemperatur trocknen.</li>
		<li>Zellmorphologie unter einem 10 X Objektiv Lichtmikroskop zu untersuchen.  Referenzen27,28,29beschreibt Zellmorphologie Proestrus (P), Östrus (E), Metestrus (M) und Diestrus (D) zu unterscheiden.</li>
		<li>Anzahl Tage in jedem inszenieren und dividiert durch die Gesamtzahl der Tage Prozent Zeit auf jeder Stufe zu berechnen.</li>
		<li>Testen Sie Glukosetoleranz 21 Tage nach dem Einsetzen von DHT durch Fasten die Mäuse über Nacht (16 h) und 2 g/kg Körpergewicht von 20 % Dextrose intraperitoneale Injektion. Zum Beispiel wenn ein Maus-Körper-Gewicht 25 g, wird diese Maus mit 250 µL 20 % Dextrose mit einer 50 cc (0,5 mL) Insulin Spritze injiziert werden. Blutzuckerspiegel bewertet Blutzuckermessgerät und Teststreifen durch Stichproben Blut vom Schweif Ader in 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Dies bezeichnet man im detail an anderer Stelle30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blutentnahme
	<ol>
<li>Sammeln Sie Blut an verschiedenen Tagen nach DHT einlegen (wir beschränken Auffangvolumen 100 µL für Steroid und 30ul für LH/FSH-Assay) zwischen 9 und 10:00 von mandibulären Vene Blutungen mit Lanzette. Dies ist in11beschrieben.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Blut bei 6.000 X g bei 4 ˚C für 10 min, und sammeln Sie die Serum-Schicht in einer anderen 1,5 mL Röhrchen, die bis zum Test bei-80 °C gelagert werden kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bewerten Sie reproduktive Profile der weiblichen Nachkommen von chronisch DHT eingefügt Dämme
<ol><li>
Paarung
	<ol>
<li>Die weibliche Maus getestet werden wird 15 Tage nach Pellet Einfügung in den Käfig mit einem bewährten fruchtbaren männlichen (, die Welpen mit einer weiblichen Maus zuvor hat) verschoben.</li>
		<li>Dokumentieren des Damms Körpergewicht wöchentlich um festzustellen, ob die Maus schwanger ist. Dam-Gewichtszunahme von mehr als 3 g in einer Woche zeigt Schwangerschaft.</li>
		<li>Sammeln Sie Blut von Dämmen die zweite Woche nachdem wir erhöhtes Körpergewicht von Staudämmen größer als 3 g aus der Vorwoche beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pubertät durch vaginale Öffnung und erste Brunst bewertet
	<ol>
<li>Überprüfen Sie vaginale Öffnung durch Sichtkontrolle täglich nach Welpen entwöhnt sind bei 21 nach der Geburt Tag (PND), Anogenital Abstand messen und aufzeichnen Lebensjahr vaginale Öffnung.</li>
		<li>Sobald Scheide öffnet, sammeln Sie vaginale Zellen täglich, wie beschrieben in 1.2.8–1.2.11, estrous Zyklizität zu überprüfen.</li>
		<li>Zellmorphologie als beschrieben 1.2.12 zu beobachten, und die erste Brunst ist definiert als das Datum, dass alle Zellen verhornten Epithelzellen sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Körper-Gewicht und Ohr-Punsch
	<ol>
<li>Tauchen Sie die lanzettenspitze in die Tattoo-Paste und markieren Sie jeder Welpe mit Tattoo auf der Zehe zu, wie in Referenz12 s. 7 PND beschrieben, und wiegen Sie Mäuse Alle 7 Tage bis 70 Tage alt.</li>
		<li>In Abbildung 1 zwischen 12 bis 16 PND verwenden Ohr Punch Mäuse aufzählen System. Sex zu unterscheiden, Bauchseite des Körpers zu untersuchen, werden Weibchen sichtbare Brustwarzen haben.</li>
		<li>Sammeln Sie Blut am 21, 26, 70 PND nach der Geburt wie oben beschrieben in 1.3.1</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hormonelle Assay
	<ol>
<li>DHT-Spiegel im Blutserum sind beide Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) gemessen und per Flüssigkeitschromatographie Tandem mass Spectrometry (LC-MS)23,24,31,32. T wird durch LC-MS oder eine Ratte/Maus ELISA, die von der University of Virginia Liganden Assay Kern in der Mitte für Forschung in Reproduktion23,24validiert wurden gemessen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+sex+steroids+in+murine+blood+and+reproductive+tissues+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).</li>
<li>Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+Seoul+virus+infection+are+not+related+to+adult+sex+steroid+concentrations+in+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats.</a> J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).</li>
<li>Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+alters+the+activity+of+conventional+and+IFN-producing+killer+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells.</a> J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).</li>
</ol>

Nichts preisgeben.

Hyperandrogenism ist ein wesentliches Merkmal des PCOS. Das Serum DHT-Spiegel (zwei Falten höher in DHT Mäuse als bei keine-DHT Mäusen) verwendet in diesem Protokoll sind niedriger als die von anderen Forschern in früheren Studien gemeldet und sind so kalibriert, dass um Frauen mit PCOS5,19proportional zu imitieren, 20,21. Im Gegensatz zu anderen Modellen ändert dieses 2-fold DHT-Modell nicht ...

Hyperandrogenism ist das Markenzeichen von PCO-Syndrom (PCOS) nach NIH-Kriterien und der überschüssige Androgen und PCOS (AE-PCOS) Gesellschaft. Frauen mit PCOS haben Schwierigkeiten, schwanger und haben ein erhöhtes Risiko von Schwangerschaft Komplikationen1. Selbst wenn sie schwanger werden, haben ihre weiblichen Nachkommen eines negativen gesundheitlichen Ergebnisse2,3. Tiermodelle sind entwickelt worden, mit verschiedenen Strategien4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 und viele Funktionen von PCOS (Anovulation und oder wertgemindert Glukose und Insulin Toleranz) mit erhöhtem Körpergewicht und Adipositas verbunden mit erweiterten Adipocyte Größe und Gewicht erhöhte Adipocyte ausstellen. Es gibt zwei Hauptstrategien, Tiermodellen zu produzieren, die verwendet werden, um PCOS zu studieren. Behandlung mit einem hohen Grad von Androgenen direkt (exogene Androgen Injektion/einstecken) oder indirekt (z. B. Sperrung Androgen-Umwandlung zu Östrogen mit Aromatase-Hemmer) ist nach der Geburt13. Ein weiterer ist von fetalen Hyperexposure von Androgenen während Schwangerschaft14,15 , die Nachkommen zu studieren. Zum Beispiel entwickeln weibliche Nachkommen von Rhesus-Affen16,17, Schafe18und Nagetiere ausgesetzt männliche Androgen während der intrauterinen Zeit PCOS-ähnliche Züge später im Leben. Diese Modelle deutlich erweitert unser Verständnis von erhöhten Androgen Effekte und fetale Programmierung und uterine Auswirkungen auf die Umwelt. Diese Modelle haben jedoch ihre eigenen Grenzen: 1) Tiere entwickeln Korpulenz und daher ist es schwierig, die Auswirkungen der Hyperandrogenemia von Adipositas verursachten Fortpflanzungs- und Stoffwechselstörungen; zu trennen (2) vor der Schwangerschaft Frauen mit PCOS weisen bereits hohe Androgen, somit Eizellen Androgen überschüssige vor der Befruchtung ausgesetzt worden; (3) die pharmakologischen Dosen von Testosteron (T) oder Dihydrotestosteron (DHT) verwendet, nach der Geburt oder während der Schwangerschaft können die Androgen-Umgebung von PCOS nicht wider. Testosteron und DHT Niveaus im Eierstock follikelflüssigkeit und/oder Serum gemessen wurden, und Testosteron und DHT-Spiegel sind 1,5 bis 3,9 fache höher bei Frauen mit PCOS5,19,20,21 ,22,23 im Vergleich zu Frauen unberührt. Wir haben einen Erwachsenen Maus Modell23,24,25 , die innerhalb von zwei Wochen über die Einleitung einer chronischen DHT aus Einfügung eines Pellet-mit 4 mm Länge des reproduktiven und metabolische Dysfunktion entwickelt Kristallpulver DHT (Gesamtlänge der Pellets beträgt 8mm). Dieses Modell produziert Serum-DHT-Spiegel, die über 2-fach höher (als 2xDHT bezeichnet) sind als die Kontroll-Mäusen ohne DHT Behandlung. Die 2xDHT Mäuse weisen nicht auf Veränderungen der basalen Serum Östradiol, Testosteron, LH und tun nicht Adipositas zu entwickeln, und zeigen ähnliches Eierstockkrebs Gewicht, Serumspiegel von Cholesterin, freie Fettsäuren, Leptin, TNF und IL-623,24, 25 gegenüber steuert sogar bis zu 3,5 Monate nach DHT Einfügung23,24,25. Bei der Paarung von Weibchen, die bereits Funktionen von PCOS entwickelt haben, können wir darüber hinaus die Auswirkungen einer Hyperandrogenic mütterlichen Umgebung auf die metabolischen und reproduktive Gesundheit der Nachkommen15studieren.
Dieses neue Paradigma (NIH und AE-PCOS Gesellschaft Kriterien relevant) Modelle die Krankheit durch die Produktion relativ ähnliche Niveaus der Androgene, die von Frauen mit PCOS 2 - 3-fold höhere Testosteron oder DHT-Spiegel im Vergleich zu Frauen unberührt. Dieses Modell wird jedoch beibehalten durch ständige exogene DHT und nicht von programmierten endogene Hyperandrogenism, sobald DHT entzogen wird. Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, Schwerpunkt 1) wie man das DHT Pellet; (2) wie ein Lean-PCOS wie Mausmodell zu generieren; (3) Strategien zur weibliche Nachkommen aus dieser Dämme zu bewerten. Andere Messungen und Bewertung der Phänotypen in dieser Handschrift nicht behandelt, aber können in5,15,23,24,25,26gefunden werden.

<table><tbody><tr><td>Kristallines 5&alpha;-DHT-Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Silastic Schlauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>0,04 Zoll/1 mm Innendurchmesser x0,085 Zoll/2,15 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Medizinisches Klebesilikon</td><td>Faktor II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>Schutzbrille, Laborkittel, Handschuhe und Masken.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Pipettenspitzen ohne Filter</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger für Abstrich</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik zum Färben von Zellen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>aufgesetzte Nadel: 20 G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lineal: beliebig lang als 10 cm mit Millimeterskala.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Chirurgische Klammer</td><td>AutoClip&reg; System, Fine Science Tool</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, niedrig dosierte U-100 Insulinspritze</td></tr><tr><td>Trokar</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>Deutschland</td></tr><tr><td>Ohrlocher</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>Testosteron Ratte/Maus ELISA Kit</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT ELISA Kit</td><td>Alpha Diagnostic International</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>One Touch Ultra Glucometer</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-Touch-Ultra-Teststreifen</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Clidox</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische Unterlage</td><td>Fisher Scientific</td><td>50587953</td><td>Hersteller: Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Betadine Antiseptic Solution</td><td>Walgreens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (n-Butylcyanacrylat)</td><td>3M Science. Auf das Leben</td><td></td><td></td> angewandt</tr></tbody></table>

ein hyperandrogenic mausmodell, pco-syndrom zu studieren

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia spielt eine entscheidende Rolle in der reproduktiven und metabolische Funktion bei Frauen und ist das Markenzeichen der PCO-Syndrom. Entwicklung eines schlanken PCOS-wie Maus-Modells, das Frauen mit PCOS imitiert ist klinisch relevant. In diesem Protokoll beschreiben wir ein solches Modell. Durch das Einfügen einer Länge von DHT (Dihydrotestosteron) Crystal Pulver Pellets 4 mm (Gesamtlänge der Pellets beträgt 8 mm), und monatlich zu ersetzen, können wir eine PCOS-wie Maus-Modell mit Serum DHT Level 2 fache höher als Mäuse nicht implantiert mit DHT (keine-DHT) zu produzieren. Wir beobachteten reproduktive und metabolische Dysfunktion ohne Gewicht und Körperzusammensetzung zu ändern. Während ein hohes Maß an Unfruchtbarkeit ausstellen, eine kleine Teilmenge dieser PCOS-wie weibliche Mäuse schwanger kann und ihre Nachkommen verzögerte Pubertät und erhöhte Testosteron als Erwachsene zeigen. Diese PCOS-wie schlanke Maus-Modell ist ein nützliches Tool um die Pathophysiologie von PCOS und die Nachkommen aus diesen PCOS-wie Dämme zu studieren.

Serum-DHT-Spiegel und Glukose-Toleranz-test
DHT-Spiegel wurden aus gesammelten Serum durch beide ELISA und LC-MS gemessen nach Protokoll 1,24 – 1,25, und 2,9, 3.0. Die DHT Absolutwerte unterscheiden sich zwischen Massenspektrometrie und ELISA, jedoch die relative Falte, die von DHT Vs keine-DHT einsetzen ist ähnlich von beiden Assays und über Experimente15,23,<su...

Wir beschreiben die Entwicklung von einem schlanken PCOS-wie Maus-Modell mit Pellet-Dihydrotestosteron, die Pathophysiologie der PCOS und die Nachkommen aus diesen PCOS-wie Dämme zu studieren.

Ein Hyperandrogenic Mausmodell, PCO-Syndrom zu studieren

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Reproduktion zu beantworten. Und die Endokrinologie. Und gelten für die Studie des Polyzystischen Ovar-Syndroms oder PCOS und Hyperandrogenismus.Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie eine konsistente, einheitliche, langfristige Freisetzung von Hormonen auf kostspielige effektive Weise ermöglicht. JHUs, die das Verfahren behandeln, werden Ping Xue, ein Techniker aus meinem Labor sein. Für Dihydrotestosteron oder DHT-Pellet-Vorbereitung, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein 15-Millimeter-Stück Silikonschläuche zu schneiden.Und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer abgestumpften 20-Spur-Nadel, um zwei bis fünf Millimeter medizinisches Klebstoffsilikon in ein Ende des Rohres zu injizieren. Lassen Sie die Schläuche über Nacht trocknen. Und überprüfen Sie auf Luftblasen am versiegelten Ende.Das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung gießt DHT-Pulver in ein Plastik-Wegboot in der Fließhaube. Beeindrucken Sie das geöffnete Ende des klebebedeckten Rohres in das Pulver. Mit einer großen begradigten Büroklammer das Pulver in den Schlauch stampfen, bis das DHT die entsprechende experimentelle Tiefe erreicht.Dann versiegeln Sie die geöffnete Seite des Rohres über Nacht mit Silikon. Am nächsten Morgen schneiden Sie jede versiegelte Seite, um eine zwei Millimeter lange Silikonlänge auf beiden Seiten des DHT und keine DHT-Kontrollpellets zu erhalten. Dann die Pellets in dem 50 Milliliter konischen Rohr mit Folie bei Raumtemperatur für bis zu drei Monate verpackt lagern.Für pcOS Mausmodellgeneration Equilibrate bis zu 20 DHT oder Steuerpellets in separaten 50 Milliliter konische Röhren mit 30 Milliliter n.0,9 Prozent Saline für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag bestätigen Sie die fehlende Reaktion auf Zehenkneifen in einer zwei Monate alten weiblichen Maus und verwenden Sie sterile Gaze, um sequenzielle povidone-Jod und 70 Prozent Ethynolpeelings in den chirurgischen Bereich zu verabreichen. Als nächstes machen Sie einen fünf Millimeter Schnitt durch die Haut in der Nähe des Halses.Und verwenden Sie einen zehnSpurwagen, um einen 15-Millimeter-Tunnel in rostraler Richtung zu bauen. Verwenden Sie den Trokar, um ein Pellet dorsal in den Tunnel einzufügen und den Schnitt mit dem chirurgischen Klebstoff zu versiegeln. Die Wundkanten mit Zangen manuell annähern und mit sanften Bürstenschlägen drei dünnschichtige Schichten flüssigen Klebstoffs auf einen Zentimeter von jeder Seite der entgegengesetzten Wundkanten auftragen.Dann legen Sie die Maus allein in einem Käfig auf einem Heatpad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Ersetzen sie das Pellet alle vier Wochen, um ein konstantes Androgen-Expositionsniveau aufrechtzuerhalten. Drei Tage nach dem Einsetzen von Pellets verwenden Sie eine p10-Pipette, um zehn Mikroliter steriler Saline in die Vaginalhöhle zu spritzen und die Pipettespitze zu verwenden, um die Saline sofort wiederherzustellen.Verteilen Sie die vaginale Zell-Saline-Probe auf eine beschriftete Folie. Und lassen Sie die Saline bei Raumtemperatur trocknen. Fixieren Sie die getrockneten Dias in einem Behälter von 100 Prozent Ethynol für mindestens fünf Minuten.Dann färben Sie die Dias für jeweils eine Minute in Puffer B und Puffer C aus einem dif-schnellen Färbekit. Am Ende des Puffers C inkubieren Sie die Dias drei Sekunden lang mit Leitungswasser waschen und bei Raumtemperatur trocknen. Um die estre Zyklizität zu bestimmen, betrachten Sie die Dias unter dem zehnfachen Ziel eines Lichtmikroskops.Zählen Sie die Tage in jeder Phase und dividieren Sie durch die Gesamtzahl der Tage, um die Prozentzeit in jeder Phase zu berechnen. Um die Glukosetoleranz zu testen, 20 Tage DHT-Einfügung, fasten Sie die Mäuse über Nacht. Wiegen Sie die Mäuse am nächsten Morgen, und verwenden Sie ein Glukometer und Teststreifen, um Basilikum Glukosespiegel der Schwanzvene Blut zu messen.Injizieren Sie die Mäuse mit zwei Gramm pro Kilogramm Körpergewicht von 20 Prozent Dextrose. Dann messen Sie den Glukosespiegel der Schwanzvenenblutproben bei 15, 30, 60, 90, 120 Minuten nach dextrose Verabreichung. Um weibliche Nachkommen von DHT eingesetzten Damen zu erwerben, bewegen Sie die weibliche Maus, um im Käfig mit einem nachgewiesenen fruchtbaren Männchen an Tag 15 getestet, nach Pellet-Einfügung.Dokumentieren Sie das Körpergewicht der Dame jede Woche, um festzustellen, ob die Maus schwanger ist. Tauchen Sie am siebten Tag eine Lanzenspitze in Tattoopaste und markieren Sie jeden Welpen mit einem Tattoo auf der Zeh. Wiegen Sie die markierten Mäuse alle sieben Tage bis zum 70. Lebensjahr.Zwischen dem postnatalen Datum 12 bis 16, Ohr schlagen die Mäuse, um sie nach dem System zu nummerieren, wie in der Abbildung dargestellt. Um das Geschlecht zu unterscheiden, untersuchen Sie die ventrale Seite jeder markierten Maus. Die Weibchen werden sichtbare Brustwarzen haben.Um Blutproben für verschiedene nachgeschaltete Analysen zu sammeln, verwenden Sie eine Lanze, um das ungefähre experimentelle Blutvolumen zwischen neun und zehn Uhr durch submandibuläre Venenblutungen zu sammeln. Und zentrifugieren Sie die Proben, um serum sammlung zu ermöglichen. Dann lagern Sie die Serenproben in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Analyse.Um die Pubertät in den weiblichen Nachkommen des DHT zu beurteilen, überprüfen Sie jeden Tag nach der Entwöhnung am 21. Tag die vaginale Öffnung durch visuelle Inspektion. Und verwenden Sie Kaliber, um den anogenitalen Abstand zu messen. Obwohl die absoluten Werte des Serums DHT zwischen Massenspektrometrie und Elisa-Analyse unterschiedlich sind, ist die relative Volksveränderung von DHT im Vergleich zur No-DHT-Einfügung sowohl von Assays als auch von Experimenten hinweg ähnlich.DHT-Spiegel sind von der Vorkonzeption bis zur Schwangerschaft sowohl bei DHT- als auch bei keinen DHT-Mäusen signifikant erhöht. Allerdings sind die DHT-Spiegel bei DHT-Mäusen doppelt höher als bei keinen DHT-Mäusen sowohl bei präkonzeptionalen als auch bei gestationalen Zeitpunkten. Erwachsene DHT-Töchter weisen Unterschiede in der Fortpflanzungsfunktion auf.Zum Beispiel, gestörte esestrous Zyklizität im Vergleich zu erwachsenen keine DHT-Töchter erleben deutlich längere Zeiten in Metestrus Diestrus und weniger Zeit in pro-esterous und esterous. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Pellets für 24 Stunden zu inkubieren, bevor sie für die gleichmäßige Freisetzung des Hormons verwendet werden. Nach diesem Verfahren können auch die reproduktiven und metabolischen Folgen einer DHT-Exposition untersucht werden.Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endrochronologie und mütterlichen fetalen Interaktionen, um PCOS und die Auswirkungen von Hyperandrogenismus auf niedrigem Niveau bei weiblichen Mäusen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DHT extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Maske und Einer Brille sowie das Arbeiten in einer Biosicherheitshaube immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt eine Möglichkeit, Dihydrotestosteron (DHT)-Pellets vorzubereiten und einzusetzen, um das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) bei Mäusen zu modellieren. Das Beispielprotokoll demonstriert das Vorgehen an Mäusen, die für Reproduktions- und Stoffwechselstudien verwendet werden.

Behandlung mit subkutanem Dihydrotestosteron (DHT): Mausmodell des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS)

Viele Nagetiermodelle der Endometriose sind durch technische Komplexität, Reproduzierbarkeit und/oder den Bedarf an immungeschwächten Tieren oder speziellen Reportermäusen begrenzt. Wir präsentieren ein vereinfachtes System der Läsionsinduktion mit jeder experimentellen Maus mit einem unabhängig überprüfbaren, objektiven Scoring-System und ohne Notwendigkeit für Ovariektomie oder Überlebensoperation.

Ein syngenes Murinmodell der Endometriose mit natürlich radfahrenden Mäusen

Diese Studie beschreibt die direkte Messung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom unter Verwendung eines stabilen Isotopenglukose-Tracers über die Schwanzvene sowohl im nüchternen als auch im glukosereichen Zustand im Tandem.

Evaluierung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom

Das follikelstimulierende Hormon (FSH) in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen wird mit der Pathogenese mehrerer Krankheiten in Verbindung gebracht. Das ovariektomierte und FSH-behandelte Mausmodell (OVF) kann verwendet werden, um die extragonadalen Wirkungen von FSH zu untersuchen.

Untersuchung unabhängiger Effekte des follikelstimulierenden Hormons in vivo in einem Mausmodell

In dieser Studie wird ein neuartiges Mausmodell vorgestellt, das speziell zur Simulation von Endometriomen, einem klinisch signifikanten Subtyp der Endometriose, entwickelt wurde. Durch die Verwendung von C57BL/6J-Mäusen zielt das Modell darauf ab, die pathophysiologischen Mechanismen aufzuklären, die der endometriombedingten Unfruchtbarkeit zugrunde liegen, und bietet ein verfeinertes Werkzeug, um die derzeitige Wissenslücke in der Reproduktionsmedizin zu schließen.

Etablierung eines experimentellen Mausmodells des Endometrioms zur Untersuchung der damit verbundenen Unfruchtbarkeit

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Induktion von Modellen des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS) bei Mäusen durch kontrollierte Letrozolfreisetzung mit Minipumpen vor. Unter adäquater Anästhesie wurde die Minipumpe subkutan implantiert, und PCOS wurde bei den Mäusen nach einer bestimmten Zeit der Freisetzung der Minipumpe erfolgreich induziert.

Eine modifizierte Technik zur Induktion des polyzystischen Ovarialsyndroms bei Mäusen

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, die Kultur und die Verkalkung der Ratte abgeleitet Ventil interstitiellen Zellen, ein höchst physiologischen in Vitro Modell der Schulterarthrose Aortenklappe Krankheit (CAVD). Ausbeutung von diesem Rattenmodell erleichtert die CAVD Forschung in der Erforschung der Zelle und der molekularen Mechanismen, die diese komplexen Krankheitsgeschehen zugrunde liegen.

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Erfahren Sie die Erstellung eines PCOS-Mausmodells mit Dihydrotestosteron-Pellets zur Untersuchung von Hyperandrogenismus und dessen Auswirkungen auf die Nachkommen.

Ein Hyperandrogenic Mausmodell, PCO-Syndrom zu studieren

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