Name: Genetischen Einbeziehung der Biosynthesized L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und seine Anwendung auf Protein-Konjugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die genetische Einbettung von biosynthetisiertem L-DOPA für die Protein-Konjugation in E. coli. Diese Methode ermöglicht spezifische und effiziente Proteinmodifikationen in der chemischen Biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), und die grundlegende Wissenschaft Research Program (2018R1A6A1A03024940) durch National Research Foundation of Korea (NRF) von der Korea-Regierung finanziert.

(1) Plasmid Bau
<ol><li>Konstruieren ein expressionsplasmid (Madothertrucker-Dual-TPL-GFP-WT), die das TPL-gen aus Citrobacter Freundii unter der Kontrolle der konstitutiven Promoter und das grün fluoreszierende Protein (GFP) Gen mit einem seiner drückt6-Tag unter der Kontrolle der AraBAD Förderer. Ersetzen Sie für Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG das Codon für den Standort (E90) von DOPA mit einem Bernstein-Codon (TAG), mit einem Site-verwiesene Mutagenese-Protokoll. Die Details für den Bau dieses Plasmid wurde in unserem vorherigen Bericht18beschrieben.</li>
	<li>Ein tRNA/AaRS-Ausdruck Plasmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 für die genetische Einbeziehung von DOPA zu konstruieren. pEVOL ist ein spezielles Plasmid-Vektor zwei Kopien des AaRS Gene mit unabhängigen Veranstaltern zum Ausdruck zu bringen, und die detaillierte Informationen des Plasmids wird in einem früheren Bericht19beschrieben.</li>
	<li>Verwenden Sie im Handel erhältlichen Plasmid Vorbereitung Kits, um hochreine Plasmid DNA zu erhalten. Überprüfen Sie die Reinheit der vorbereitet DNAs mit Agarose-Gelelektrophorese, falls erforderlich.</li>
</ol>(2) Kultur Vorbereitung
<ol><li>
Elektroporation
	<ol>
<li>Verwendung der Elektro-kompetente E. Coli DH10β Belastung für dieses Experiment. 1 µL jedes Plasmid DNA (pEVOL-DHPRS2 und Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG) zu 20 µL kompetente Zellen hinzufügen. Mischen Sie sie vorsichtig, um eine homogene Mischung, mit einer Pipette zu machen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mischung auf die Elektroporation Küvetten. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Schieben Sie die Küvette in die Kammer zu festen Küvette-Kammer zu kontaktieren.</li>
		<li>Die Küvette mit 25 µF schockieren und 2,5 kV für 0,1 cm-Küvetten.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL vorgewärmte super optimale Brühe (SOC), mit 2 % (w/V) Tryptone, 0,5 % (w/V) Hefe-Extrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2und 20 mM Glukose, die Küvette und die Zellen zu einem Kultur-Schlauch übertragen. Die Zellen zu retten, indem sie Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit schütteln.</li>
		<li>10-100 µL der geretteten Zellen auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit 35 µg/mL Chloramphenicol und 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Starter-Kultur-Vorbereitung
	<ol>
<li>Eine einzige transformierte Kolonie in 5 mL LB-Medium mit Antibiotika immun. Inkubieren Sie die Kolonie für 12 h bei 37 ° C mit schütteln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ausdruck und Aufreinigung von GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen System
<ol><li>
Ausdruck der GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen system
	<ol>
<li>Übertragen Sie die Starterkultur (2 mL) auf 100 mL PA-5052 mittleren20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % [w/V] Spur Metalle, 0,5 % [w/V] Glycerin, 0,05 % [w/V] Glucose und Aminosäuren 5 % [w/V] [pH 7.25]) mit 35 µg/mL Chloramphenicol, 100 µg/mL Ampicillin, 100 mM Pyruvat, brenzcatechins 10 mM, 25 mM Ammoniak und 300 µM Dithiothreitol (DTT) gefolgt von einer Inkubation bei 30 ° C mit schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL 0,2 % (w/V) L-Arabinose wenn die optische Dichte (OD) bei 550 nm erreicht 0,8. Inkubation der Probe für 12 h bei 30 ° C mit schütteln.</li>
		<li>Spin-down der Zellen bei 11.000 x g für 5 min, den überstand verwerfen und Einfrieren der Zelle Pellet bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zell-Lyse
	<ol>
<li>Die Zelle Pellet auf Eis Auftauen und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL Lyse-Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM Imidazol und 300 mM NaCl.</li>
		<li>Beschallen die resuspendierte Zellen auf Eis für 10 min. Einsatz 80 % Beschallung Amplitude mit einem Puls von 25 s ein und 35 s aus.</li>
		<li>Spin-down der Zelle lysate bei 18.000 x g bei 4 ° C für 15 min. Transfer der Überstand zu einem frischen Schlauch für Reinigung und das Pellet zu verwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NI-NTA Affinitätschromatographie
	<ol>
<li>Der Überstand Ni-NTA (Nitrilotriacetic Säure) Harz (300 µL der Harz-Aussetzung für eine 100-mL-Kultur) hinzu und binden Sie die Proteine, die Ni-NTA-Harz bei 4 ° C durch sanft schütteln Sie die Suspension für 1 h.</li>
		<li>Die Aussetzung einer Polypropylen Spalte übertragen und waschen Sie das Harz 3 X mit 5 mL Waschpuffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl.</li>
		<li>Eluieren Proteine 3 X mit 300 µL der Elution Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl.</li>
		<li>Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Absorption bei 280 nm. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient (24.630 M-1cm-1) für GLP-E90DOPA bei 280 nm wurde berechnet, indem ein Protein Aussterben Koeffizient Rechner (z.B. https://web.expasy.org/protparam/) und das unabhängig gemessene Aussterben Coefficiennt (2630 M-1cm-1) für DOPA. Als eine alternative Methode verwenden Sie die Bradford Protein Assay21 für eine Bestimmung der Konzentration des Proteins.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Oligomerisierung von gereinigten GLP-E90DOPA
<ol><li>Fügen Sie 1 µL Sodium periodate H2O (6 mM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (300 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.</li>
	<li>Die Oligomerisierung Reaktion bei 25 ° C für 48 h Vorgehen zu ermöglichen.</li>
	<li>Analysieren Sie das Reaktionsgemisch durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) (SDS-PAGE), wie in Schritt 6 beschrieben.</li>
</ol>(5) Konjugation von GFP-E90DOPA mit einem Alkinen Sonde durch SPOCQ
<ol><li>Fügen Sie 1 µL der Cy5.5 Verbindung Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4,0 mM) (10 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (20 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL des Natriums in H2O periodate (400 µM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zum Reaktionsgemisch.</li>
	<li>Lassen Sie die SPOCQ Reaktion bei 25 ° C für 1 Stunde gehen. Wenn eine lichtempfindliche Sonde verwendet wird, decken Sie das Reaktionsgefäß mit Alufolie ab.</li>
</ol>6. Reinigung der beschrifteten GLP
<ol><li>Verdünnen Sie das Reaktionsgemisch SPOCQ durch Zugabe von Phosphatpuffer, mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl, bis zu 500 µL.</li>
	<li>Übertragen Sie die verdünnte Lösung auf eine zentrifugale Filterspalte Spin. Zentrifugieren Sie die Spin-Spalte bei 14.000 X g bei 4 ° C für 15 min und entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X um jede überschüssige Cy5.5-ADIBO zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die gereinigte Probe aus der Spalte "Spin" auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Alternativ führen Sie eine Reinigung durch Dialyse gegen den gleichen Puffer.</li>
	<li>Speichern Sie die gereinigten GFP bei 4 ° C.</li>
</ol>(7) SDS-PAGE-Analyse und Fluoreszenz-Gel Scannen
<ol><li>SDS-PAGE-Analyse durch Zugabe von 5 µL Probenpuffer Protein Proteinproben vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien) und 2 µL von DVB-t (1,00 M), 13 µL des gereinigten oder derbe, beschriftet GFP (13,6 µM oder 0,38 mg/mL). Eine Analyse der Oligomere GFP verwenden Sie eine höhere Konzentration von GFP (67,8 µM oder 1,9 mg/mL). Denaturieren Sie die Proteine durch sie bei 95 ° C für 10 min Inkubation.</li>
	<li>Legen Sie eine 4 % - 12 % Bis-Tris SDS-PAGE Gel Kassette (gekaufte, vorgefertigten Gel Kassetten) auf die Elektrophorese-Zelle und fügen einen laufenden Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie die Proteinproben und einem Molekulargewicht Marker. Laufen Sie die Elektrophorese für 35-40 min. bei 200 V. Hinweis: Vermeiden Sie jegliche Exposition die Proteinproben Licht durch die Durchführung aller Prozesse in der Dunkelheit, um Foto-Bleichen der fluoreszierenden Sonde zu minimieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Scanner für die Fluoreszenz-Bildgebung. Wickeln Sie eine Protein-Gel von Elektrophorese und legen Sie es auf einem Fluoreszenz-Scanner. Scannen Sie das Gel mit einem geeigneten Wellenlänge-Einstellung. Wählen Sie für Cy5.5 den Cy5-Modus in der Scanner-Software zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Färben Sie das Gel mit einem kommerziellen Protein Beflecken Reagenz.</li>
</ol>8. MALDI-TOF-MS-Analyse durch Trypsin-Verdauung
<ol><li>Inkubieren Sie 100 µL der gereinigten GLP-E90DOPA (2,2 mg/mL oder 80 µM) in einem Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (w/V) SDS und 25 mM DTT bei 60 ° C für 1 h.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL Iodoacetamide in H2O (IAA, 4.0 M) (500 Äquiv, GFP-E90DOPA) auf die gereinigte GLP-E90DOPA Lösung (80 µM) in den gleichen Puffer. Inkubieren Sie die Mischung bei 25 ° C für 30 min mit Lichtschutz.</li>
	<li>Verdauen Sie die GLP-E90DOPA Probe durch Zugabe von Trypsin (1: 100-Protease-Substrat-Protein-Verhältnis [w/w]) zu und inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 4 h.</li>
	<li>Reinigen Sie die verdaute Peptid-Probe C18 Spin Spalten eine Entsalzung Standardmethode mit.</li>
	<li>Analysieren Sie die verdauten Peptide durch die gemeldeten Protokoll für Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) mit Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) als ein Matrix-23.</li>
</ol>

<ol><li>Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+hydroxylase%3A+The+initial+step+in+norepinephrine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).</li>
<li>Pinder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+dopamine+derivatives+capable+of+crossing+the+blood-brain+barrier+in+relation+to+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism.</a> Nature. 228 (5269), 358(1970).</li>
<li>Waite, J. H., Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenolic+substance+of+mytilus+edulis%3A+novel+adhesive+containing+L-DOPA+and+hydroxyproline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline.</a> Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).</li>
<li>Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanics+of+mussel+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanics of mussel adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).</li>
<li>Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyarginine-containing+polyphenolic+proteins+in+the+adhesive+plaques+of+the+marine+mussel+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).</li>
<li>Waite, J. H., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoprotein+from+the+adhesive+pads+of+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis.</a> Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).</li>
<li>Nicklisch, S. C., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+The+role+of+redox+in+DOPA-mediated+marine+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion.</a> Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).</li>
<li>Silverman, H. G., Roberto, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2100433/">Understanding marine mussel adhesion.</a> Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).</li>
<li>Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+adhesives+and+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired adhesives and coatings.</a> Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+cross-linking+with+genetically+incorporated+3%2C4-dihydroxy-L-phenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.</a> ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+approach+to+transform+low-affinity+peptides+into+protein+probes+with+cotranslationally+expressed+chemical+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker.</a> Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).</li>
<li>Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+non-canonical+amino+acid+design+to+covalently+crosslink+an+antibody-antigen+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex.</a> Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).</li>
<li>Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15366882">Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).</li>
<li>Borrmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+oxidation-controlled+cyclooctyne-1%2C2-quinone+cycloaddition+%28SPOCQ%29+for+fast+and+activatable+protein+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).</li>
<li>Ayyadurai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective%2C+sensitive%2C+and+reversible+biosensor+by+the+genetic+incorporation+of+a+metal-binding+site+into+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).</li>
<li>Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+protein+nanoparticles+containing+iron%28III%29-DOPA+complexes+for+pH-responsive+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).</li>
<li>Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+a+redox-active+amino+acid+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).</li>
<li>Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+L-dihydroxyphenylalanine+%28DOPA%29+biosynthesized+by+a+tyrosine+phenol-lyase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase.</a> Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Gobom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+affinity+sample+preparation.+A+protocol+for+MALDI-MS+peptide+analysis+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics.</a> Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).</li>
<li>Mukai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproductive+Escherichia+coli+cells+with+no+specific+assignment+to+the+UAG+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon.</a> Scientific Reports. 5, 9699(2015).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomically+recoded+organisms+expand+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomically recoded organisms expand biological functions.</a> Science. 342 (6156), 357-360 (2013).</li>
<li>Bryson, D. I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29035361">Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases.</a> Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).</li>
<li>Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+amber+suppressor+tRNAs+for+efficient+bacterial+production+of+proteins+containing+nonnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+strategy+for+selective+phosphoserine+incorporation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).</li>
<li>Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+multiple+unnatural+amino+acids+via+evolution+of+a+quadruplet-decoding+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome.</a> Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+reactions+for+labeling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal reactions for labeling proteins.</a> ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll werden die Biosynthese und die direkte Einbindung von DOPA beschrieben. Die Bakterienzelle verwendet bei dieser Methode kann eine weitere Aminosäure synthetisieren und verwenden es als unnatürlich Baustein für die Proteinsynthese. Die genetische Einbeziehung der unnatürlichen Aminosäuren ist eine Schlüsseltechnologie für die Entwicklung der unnatürlichen Organismus mit einer erweiterten genetischen Code gewesen. Jedoch diese Methode wurde technisch unvollständigen und zur Effizienzsteigerung der Einbe...

DOPA ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen beteiligt. Diese Aminosäure wird von Tyr von Tyrosin-Hydroxylase und molekularer Sauerstoff (O2)1synthetisiert. Da DOPA eine Vorstufe von Dopamin ist und die Blut - Hirn-Schranke durchdringen kann, hat es bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit2eingesetzt. DOPA findet sich auch in Muschel Adhäsion Proteine (MAPs), die für die Hafteigenschaften der Muscheln in nassen Bedingungen3,4,5,6,7zuständig sind. Tyr wird zunächst an den Positionen kodiert, wo DOPA findet sich in Karten und dann durch tyrosinasen8,9in DOPA umgewandelt wird. Wegen seiner interessanten biochemischen Eigenschaften wurde DOPA in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt. Die Dihydroxyl Gruppe von DOPA ist chemisch anfällig für Oxidation und die Aminosäure ist in L-Dopaquinone, ein Vorläufer der Melanine umfunktioniert. Aufgrund seiner hohen Electrophilicity wurden für Vernetzung und Konjugation mit Thiole und Amine10,11,12,13L-Dopaquinone und seine Derivate eingesetzt. 1,2-Chinonen können auch als ein Diens für Cycloaddition Reaktionen und werden durch Belastung gefördert Oxidation-gesteuerten Cyclooctyne-1,2-Quinone (SPOCQ) deutscher14seit biokonjugaten. Darüber hinaus die Dihydroxyl Gruppe kann Metallionen wie Fe3 + und Cu2 +Chelat und Proteine mit DOPA haben für Drug Delivery und Metallion sensing15,16verwendet worden.
DOPA hat genetisch in Proteine mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) und die Aminoacyl-tRNA synthestase (AaRS) Paar17 integriert und verwendet für Protein Konjugation und Vernetzung10,11, 12,13. In diesem Bericht werden experimentelle Ergebnisse und Protokolle für die genetische Einbeziehung von DOPA Biosynthesized von billige Ausgangsmaterialien und ihre Anwendungen auf biokonjugaten beschrieben. DOPA ist Biosynthesized mit einem TPL und ausgehend von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak in Escherichia coli. Biosynthesized DOPA ist direkt integriert Proteine ein weiterentwickelter aa-tRNA und AaRS Pair für DOPA zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ist das Biosynthesized Protein mit DOPA mit einem fluoreszierenden Sonde und vernetzt zu produzieren Protein Oligomere ortspezifisch konjugiert. Dieses Protokoll wird nützlich sein für Protein Wissenschaftler zur Biosynthese mutierte Proteine mit DOPA und konjugieren der Proteine mit biochemischen Sonden oder Drogen für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Plasmid Construction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td><td></td><td></td><td>enthalten optional das gelbe Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position. Ko, W. et al. Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>Plasmid pEvol-DHPRS2</td><td></td><td></td><td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. und Schultz, P. G. Ein verbessertes System für die unnatürliche Aminosäuremutagenese in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetischer Einbau von L-Dihydroxyphenylalanin (DOPA), biosynthetisiert durch eine Tyrosinphenol-Lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/C8CC00281A (2018).</td></tr><tr><td>DH10&beta;</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Host Plasmid Mini-Prep Kit</td><td>Nukleogen</td><td>5112</td><td>200/Packung</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron Biotechnologie</td><td>32034</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td>2. Kulturvorbereitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1) Elektroporation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropulser&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropulser-Küvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0,1 cm Elektrodenabstand, Packung mit 50</td></tr><tr><td>Ampicillin Natrium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td><stark>3. Expression und Reinigung von GFP-E90DOPA durch biosynthetisches System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.1 Expression von GFP-E90DOPA durch biosynthetisches System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Pyrocatechol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1387</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0943</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure, 98%</td><td>Alfa Aesar A13875</td><td></td><td>100 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch, wasserfrei, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0891</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Kaliumphophat, einbasisch, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1127</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat, wasserfrei, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>M0146</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>D(+)-Glukose, wasserfrei, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>D0092</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Glycerin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0269</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Spurenmetallmischung a5 mit co</td><td>Sigma</td><td>92949</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>L-Prolin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1257</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Phenylalanin, 98,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1982</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>JUNSEI</td><td>49550-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Arginin, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1149</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 98%</td><td>JUNSEI</td><td>27340-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Asparagin-Monohydrat, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1198</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>JUNSEI</td><td>73190-0410</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Histidinhydrochlorid-Monohydrat, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0604</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Threonin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T2938</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Glycin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0286</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0233</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Alanin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1543</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Isoleucin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I1049</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Valin, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>V0088</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Serin</td><td>SAMCHUN</td><td>S2447</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>SAMCHUN</td><td>A1205</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Lysinmonohydrochlorid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>L0592</td><td>25 g</td></tr><tr><td>3.2 Zelllyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor - 150 Mikroliter bis 150 Milliliter</td><td>SONIC & MATERIALIEN</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>3.3 Ni-NTA Affinitätschromatographie</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Harz</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polypropylensäule</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/Packung, 1 mL Kapazität</td></tr><tr><td>4. Oligomerisierung von gereinigtem GFP-E90DOPA&nbsp; </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumperiodat, 99,8&</td><td>Acros</td><td>419610050</td><td>5 g</td></tr><tr><td><stark>5. Konjugation von GFP-E90DOPA mit einer Alkinsonde durch stammgefördertes oxidationskontrolliertes Cyclooctin; 1,2-Chinon-Cycloaddition (SPOCQ)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1mg</td></tr><tr><td><stark>6. Reinigung von markierten GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfiltern</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/Packung, 500 ul Kapazität</td></tr><tr><td>7. SDS-PAGE Analyse- und Fluoreszenzgel Scanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5 %</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer, 4X</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES Laufpuffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE Gele</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 </td></tr><tr><td>well Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>G:BOX Chemi Fluoreszierend & Chemilumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>Syngene</td><td></td><td>G BOX Chemi XT4</td></tr><tr><td>8. MALDI-TOF MS-Analyse durch Trypsin-Aufschluss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8.1 Vorbereitung der verdauten Peptidprobe durch Trypsin-Aufschluss</td>Tris(<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydroxymethyl)aminomethan, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Salzsäure, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dodecylsulfat-Natriumsalz, 85%</td><td>SAMCHUN</td><td>D1070</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Trypsin-Protease, MS Grade</td><td>Thermofisher</td><td>90057</td><td>5 x 20 & Mikro; g/Pack</td></tr><tr><td>C-18 Spinnsäulen</td><td>Thermofisher</td><td>89870</td><td>25/Packung, 200 & micro; L capacity</td></tr><tr><td>8.2 Analyse des verdauten Peptids mittels MALDI-TOF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirile, 99,5</td>%<td>SAMCHUN</td><td>A0125</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Sigma</td><td>C2020</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1666</td><td>100 g</td></tr><tr><td>MTP 384 Zielplatte geschliffener Stahl BC-Ziele</td><td>Bruker</td><td>8280784</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF Massenspektrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genetischen einbeziehung der biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) und seine anwendung auf protein-konjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen gefunden. Wegen seiner besonderen biochemischen Eigenschaften hat die Aminosäure Mehrfachnutzung in biochemische Anwendungen. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll für die genetische Einbeziehung der Biosynthesized DOPA und seine Anwendung auf Protein Konjugation. DOPA ist Biosynthesized durch ein Tyrosin Phenol-Lyase (TPL) von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak und die Aminosäure ist direkt durch die genetische Einbau-Methode mit einem weiterentwickelten Aminoacyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA synthestase Paar in Proteine aufgenommen. Dieses direkte Einbindung System beinhaltet effizient DOPA mit wenig Einbindung anderer natürlicher Aminosäuren und bessere Proteinausbeute als das Vorgängersystem genetische Aufnahme für DOPA. Protein-Konjugation mit DOPA-haltige Proteine ist effizient und ortsspezifische und zeigt seine Nützlichkeit für die verschiedensten Anwendungen. Dieses Protokoll bietet Protein Wissenschaftler mit detaillierten Verfahren für die effiziente Biosynthese von mutierten Proteine mit DOPA an gewünschten Standorten und deren Konjugation für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

Expressionssystem für die direkte Einbindung von DOPA Biosynthesized von einer TPL ist in Abbildung 1dargestellt. Die Gene für das weiterentwickelte aa-tRNA und AaRS paar befinden sich in ein Plasmid, und das GFP-gen (GFP-E90TAG) mit einem Bernstein Codon an Position 90 befindet sich in einer anderen Plasmid, die Einbeziehung von DOPA zu bewerten von GFP-Fluoreszenz. Das TPL-gen werden in das gleiche expressionsplasmid mit der GFP-gen und konstitutiv ausgedrü...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die genetische Aufnahme von L-Dihydroxyphenylalanine Biosynthesized aus einfachen Ausgangsmaterialien und seine Anwendung auf Protein Konjugation.

Genetischen Einbeziehung der Biosynthesized L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und seine Anwendung auf Protein-Konjugation

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen Biologie zu beantworten, wie z. B. Proteinmodifikation, Konjugation und Biosynthesesystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass L-DOPA spezifisch und effizient bei der Einführung der Tyr-Proteine durch die Verwendung eines biosynthetischen Systems angeführt werden kann. Nach der Konstruktion des Expressionsplasmids werden elektrokompetente E.coli DH10 beta-Stammzellen für dieses Verfahren ausgelegt.Fügen Sie einen Mikroliter jeder Plasmid-DNA zu 20 Mikrolitern kompetenter Zellen hinzu. Verwenden Sie eine Pipette, um vorsichtig zu mischen. Übertragen Sie diese Mischung in 0,1 Zentimeter große Elektroporationsküvetten.Legen Sie eine gefüllte Küvette in die Elektroporationskammer und achten Sie darauf, dass ein fester Kontakt zur Küvettenkammer besteht. Die Küvette wird mit 25 Mikrofarad und 2,4 Kilovolt geschockt. Fügen Sie dann einen Milliliter vorgewärmtes SOC-Medium hinzu.Übertragen Sie die Zellen in ein Kulturröhrchen. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, um die Zellen zu retten. Verteilen Sie 10 bis 100 Mikroliter der geretteten Zellen auf einer Lysogenie-Bouillon-

genetic-incorporation-biosynthesized-l-dihydroxyphenylalanine-dopa

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Ein einfach zu bedienendes, zellfreies Expressionsprotokoll für den rückstandsspezifischen Einbau von nicht-kanonischen Aminosäureanaloga in Proteine, einschließlich Downstream-Analysen, wird für medizinische, pharmazeutische, strukturelle und funktionelle Studien vorgestellt.

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zellfreie Transkription-Translation-System

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Synthetischer Biologie ermöglicht das Engineering von Proteinen mit noch nie dagewesenen Eigenschaften mit Hilfe der co-translational Einfügen von nicht-kanonischen Aminosäuren. Hier präsentierten wir, wie eine Spektral rot verschoben-Variante des ein GLP-Typ Fluorophor mit neuartigen Fluoreszenz spektroskopischen Eigenschaften, genannt "Gold" fluoreszierende Protein (GdFP), über Selektionsdruck Aufnahme (SPI) in E. Coli hergestellt wird.

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Erweiterung des genetischen Codes dient als ein mächtiges Werkzeug für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich Protein Acetylierung zu studieren. Hier zeigen wir, dass eine einfache Protokoll nutzen diese Technik zur Erzeugung von homogen Proteine an bestimmten Standorten in Escherichia coli Zellen acetyliert.

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Einbeziehung einer Cyclopropen-Derivat von Lysin in Antikörper ermöglicht die ortsspezifische, schnelle und effiziente Verknüpfung von kurz-tragenden Moleküle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zu generieren.

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

Eine einfache Protokoll wird präsentiert, um die Oberflächen von Nano-Diamanten mit Polydopamine zu funktionalisieren.

Bio-inspirierte Polydopamine Oberflächenmodifizierung von Nano-Diamanten und der Reduktion von Silber-Nanopartikeln

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Um die Einschränkungen der klassischen ortsgesteuerten Mutagenese zu überwinden, wurden Prolinanaloga mit spezifischen Modifikationen in mehrere fluoreszierende Proteine eingebaut. Wir zeigen, wie sich der Ersatz von Wasserstoff durch Fluor oder des Einzelnen durch Doppelbindungen in Prolinresten ("molekulare Chirurgie") auf grundlegende Proteineigenschaften auswirkt, einschließlich ihrer Faltung und Wechselwirkung mit Licht.

Rückstandsspezifischer Austausch von Prolin durch Prolinanaloga in fluoreszierenden Proteinen: Wie die "molekulare Chirurgie" des Rückgrats die Faltung und Stabilität beeinflusst

Lernen Sie die genetische Einbettung von biosynthetisiertem L-DOPA für die Protein-Konjugation in E. coli. Diese Methode ermöglicht spezifische und effiziente Proteinmodifikationen in der chemischen Biologie.

Genetischen Einbeziehung der Biosynthesized L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und seine Anwendung auf Protein-Konjugation

Weitere Videos entdecken