Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern
October 4th, 2018
Hier ist ein Protokoll für Medium-High Throughput Analyse von Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene präsentiert. Phospho-Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Zellbiologie und Immunologie zu beantworten, wie sind Signalwege von verschiedenen Reizen oder Medikamenten beeinflusst? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Ihnen ermöglicht, einzellige Signalanalyse in der mittleren bis hohen Durchsatz-Mode durchzuführen. Nach der erneuten Aussetzung der Zellen in ergänztem RPMI 16/40 Medium, übertragen Sie die erforderliche Menge an Zellsuspension auf die Brunnen einer 96 well V-Bodenplatte.
Übertragen Sie die Platte in ein vorgeheiztes 37 Grad Celsius Wasserbad und lassen Sie es dort für 10 Minuten ruhen. Dann fügen Sie 60 Mikroliter festen Puffer eins zu jedem Brunnen einer neuen 96 Well Platte, um die fixe Platte einzurichten. Legen Sie diese Platte in das 37 Grad Celsius Wasserbad.
Übertragen Sie eine 50-Mikroliter-Steuerprobe auf die Platte und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Optional fügen Sie den Zellen 10 Mikroliter pro Milliliter Anti-IgM hinzu, um den Simulationszeitkurs zu starten und durch Pipettieren nach oben und unten zu mischen. Übertragen Sie eine 50-Mikroliter-Probe zu jedem Zeitpunkt auf die Fixplatte, wobei Sie jede Probe so mischen, wie sie hinzugefügt wird.
Nachdem die letzte Probe hinzugefügt wurde, lassen Sie die Fixplatte im Wasserbad für 10 Minuten. Waschen Sie zunächst die Zellen dreimal mit PBS. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Als nächstes bereiten Sie eine frische 96 Gut V-Bodenplatte mit Barkodierung Reagenzien, durch Pipettier von fünf Mikroliter jedes Barcoding Reagenz in jedem Brunnen Füllung die Anzahl der Brunnen erforderlich, um jede der Proben zu färben. In der festen Zellplatte die Zellen in jedem Brunnen mit 190 Mikroliter PBS wieder aufsetzen. Dann übertragen Sie jeden Brunnen der Zellen auf den entsprechenden Brunnen in der Barkodierungsplatte, wobei sie jeden brunnen gründlich mischen.
Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln ruhen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Danach die Zellen in jedem Brunnen zweimal mit der Strömungswäsche waschen.
Dann fügen Sie 190 Mikroliter Strömungswäsche zu jedem Brunnen der Zellen hinzu. Kombinieren Sie alle Barcode-Proben in einem 15-Milliliter-Rohr und übertragen Sie jede Kompensationssteuerung auf ein separates 1,7-Milliliter-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Um zu beginnen, übertragen Sie zwei Milliliter Perm Puffer drei auf eine 15 Milliliter Tube. Bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren, damit es eiskalt wird, wenn es benutzt wird. Wenn Sie bereit sind, fügen Sie 1,5 Milliliter eiskalten Permpuffer in das 15-Milliliter-Rohr, das die Barcode-Zellpopulation tropfenweise enthält, während sie sich vorwirbeln, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
Fügen Sie 100 Mikroliter eiskalten Permpuffer zu jeder der Kompensationskontrollen auf die gleiche Weise hinzu. Die Zellen bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten sofort in einen Gefrierschrank geben. Wenn Sie bereit sind, mit der Antigenfärbung zu beginnen, entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und übertragen Sie sie in eine Eisbox.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Überschuss an Strömungswäsche. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Barcode-Zellpopulation in einem Volumen der Durchflusswäsche wieder auf, so dass es 25 Mikroliter Zellsuspension pro Phospho-Antikörper-Färbung gibt.
Setzen Sie die Kompensationskontrollen in 200 Mikroliter Nließwäsche wieder aus. Um Antikörper für die Färbung vorzubereiten, fügen Sie 10 Mikroliter phosphospezifischer Antikörper, verdünnt in Flow Wash, zu jedem Brunnen einer frischen 96-Gut-V-Bodenplatte hinzu. Fügen Sie 15 Mikroliter Oberflächenmarker, verdünnt in Flow Wash und 25 Mikroliter Zellsuspension zu jedem Brunnen für ein endgültiges Volumen von 50 Mikroliter pro Brunnen.
Lassen Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen. Danach die gebeizten Zellen zweimal mit Flow Wash waschen. Zentrifuge bei 500 mal G für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 150 Mikroliter Nließwäsche wieder auf. Führen Sie dann eine Flusszytometrieanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Im vorgestellten Protokoll wird die dreidimensionale Taktierung durch die Kombination von drei Taktkodiern durchgeführt.
Einzelne Proben werden dann durch nachfolgendes Gating auf jedem Barkodierungsreagenz im Vergleich zur seitlichen Streufläche entwirren. Die basalen und stimulationinduzierten Phosphorylierungswerte von 20 Signalmolekülen nach dem B-Zellrezeptor werden dann in B-Zellen von CLL-Patienten und normalen Kontrollen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert. Das stat3 Phospho-Tyrosin 705 ist deutlich nach oben reguliert.
Zellen werden mit Anti-IgM für bis zu 30 Minuten stimuliert, um Signalaberrationen zu identifizieren, die durch den B-Zell-Rezeptor-Weg induziert werden. Während CLL-Zellen von Patienten mit unmutiertem IGVH eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Anti-IgM-Stimulation aufweisen, ist sie für AKT-Phosphor-Serin 473 nur statistisch signifikant. Die Zellen werden dann dem PI 3-Kinase-Delta-Inhibitor Idelalisib ausgesetzt, um zu testen, ob das abnorme AKT pS473-Signal umgekehrt werden kann.
Wie hier gezeigt, werden die aberranten Werte bei der Behandlung in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant reduziert, was zeigt, dass Kinase-Inhibitoren angewendet werden können, um abnorme Signalisierung in CLL-Zellen zu normalisieren. Bevor Sie dieses Verfahren versuchen, sollten Sie daran denken, Barkodierungsreagenzien und Antikörper zu titrieren und zu überprüfen, ob ausgewählte Oberflächenmarker mit Fixierungs- und Permeabilisierungsreagenzien kompatibel sind. Die Zellen müssen für die Phosphoranalyse in Suspension gehalten werden, dennoch kann das Protokoll nach Verfahren an abnorme Zellen oder Gewebe angepasst werden, um eine einzellige Suspension zu erhalten, wie z. B. die gesamte Trypzination.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die mittel- bis hochdurchsatzfähige Analyse von Proteinphosphorylierungsereignissen auf zellulärer Ebene mittels Phospho-Fluoreszenz-Zytometrie vor. Diese Methode ist effektiv zur Charakterisierung von Signalübertragungsstörungen, zur Identifizierung und Validierung von Biomarkern und zur Beurteilung der Pharmakodynamik.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Immunologie
- Signaltransduktion
Hintergrund
- Phospho-Fluoreszenz-Zytometrie ermöglicht die Einzelzell-Signalanalyse.
- Diese Technik kann untersuchen, wie Signalwege durch verschiedene Stimuli oder Medikamente beeinflusst werden.
- Sie eignet sich für die mittel- bis hochdurchsatzfähige Analyse.
- Die Methode verbessert die Fähigkeit, zelluläre Reaktionen auf detaillierter Ebene zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll für die Analyse der Proteinphosphorylierung bereitzustellen.
- Die Identifizierung von Biomarkern in der zellulären Signalübertragung zu erleichtern.
- Die Pharmakodynamik verschiedener Behandlungen zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Zellen werden in ergänztem RPMI 16/40 Medium resuspendiert.
- Eine bestimmte Menge der Zellsuspension wird auf eine 96-Well V-Bodenplatte übertragen.
- Die Platte wird in einem vorgeheizten Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubiert.
- Fester Puffer wird hinzugefügt, um die Fixplatte für die Analyse einzurichten.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine effiziente Analyse von Signalwegen.
- Sie liefert Einblicke in die Auswirkungen von Medikamenten auf die zelluläre Signalübertragung.
- Die Einzelzellauflösung verbessert das Verständnis zellulärer Reaktionen.
- Ergebnisse können zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele führen.
Schlussfolgerungen
- Phospho-Fluoreszenz-Zytometrie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Proteinphosphorylierung.
- Das Protokoll ermöglicht eine hochdurchsatzfähige Analyse, wodurch es für verschiedene Forschungsanwendungen zugänglich wird.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um komplexe Signalnetzwerke zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
