Oberfläche-verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanoprobe Ratiometry zur Erkennung von mikroskopischen Eierstockkrebs über Folsäure Rezeptor Targeting

Diese Methode verwendet die topische Anwendung von Nanopartikeln, um mikroskopische Tumoren abzubilden, insbesondere bei Malignitäten, die noch keinen Zugang zur Vaskulatur haben, wie die Metastasierung von Eierstockkrebs. Diese Technik ist ratiometrisch, bildgebungsgerichtete und nicht zielgerichtete Nanopartikel in einem einzigen Scan, um falsche Signale zu verringern und das wahre Ausmaß des Tumors zu offenbaren. Diese Nanopartikel können durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion zur hochpräzisen Bildgebung von Eierstockkrebs und vielen anderen Tumortypen verabreicht werden.

Für die Gold-Nanosternkernsynthese einen konischen Kolben mit 800 Millilitern frisch zubereiteter Ascorbinsäurelösung auf eine magnetische Rührplatte bei vier Grad Celsius legen und einen stetigen Wirbel induzieren. Schnell acht Milliliter frisch zubereitete Tetrachlorausäurelösung in den Wirbel geben. Innerhalb von Sekunden bilden sich Nanosterne und die Lösung wird von einer dunkelblauen Farbe ausgehen.

Gießen Sie die Nanostar-Suspension in 50-Milliliter-Konikonröhren für die Zentrifugation und aspirieren Sie alle bis auf die letzten 200 Mikroliter Überstand aus jedem Rohr am Ende des Spins. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Nanopartikel in jeder Röhre wieder aufzuhängen, bevor Sie alle Nanopartikel in einer einzigen Dialysekassette bündeln. Dann dialysieren Sie die Nanopartikel für mindestens drei Tage gegen zwei Liter deionisiertes Wasser, das das Wasser täglich verändert.

Für die Bildung von Kieselsäureschalen 10 Milliliter Isopropanol, 500 Mikroliter TEOS, 200 Mikroliter entionisiertes Wasser und 60 Mikroliter Farbstoff zu einem 50-Milliliter-Konischen Rohr hinzufügen. Und fügen Sie drei Milliliter Ethanol und 200 Mikroliter Ammoniumhydroxid in eine 15-Milliliter-Röhre. Als nächstes beschallen Sie die dialysierten Nanosterne, um alle Cluster zu zerstreuen und 1,2 Milliliter Nanosterne in die Röhre zu geben.

Legen Sie die 50-Milliliter-Röhre auf einen Wirbelmischer und induzieren Sie einen stetigen Wirbel. Fügen Sie die Nanostar-Lösung schnell in die 50-Milliliter-Röhre mit etwa fünf weiteren Sekunden Mischen, bevor Sie das Rohr schnell auf einen Shaker für 15 Minuten bei 300 U/min bei Raumtemperatur übertragen. Die beiden Röhren müssen schnell und unter konstanter Nixierung kombiniert werden, um sicherzustellen, dass die Silication-Reaktion auf den Nanosternen stattfindet und um die freie Kieselsäureproduktion zu minimieren.

Am Ende der Inkubation füllen Sie das Rohr mit Ethanol, um die Reaktion zu löschen und die Nanosterne durch Zentrifugation zu sammeln. Aspirieren Sie alle bis auf die letzten 500 Mikroliter Überstand, die darauf achten, das Pellet nicht zu stören und die Nanopartikel in einem Milliliter frischem Ethanol wieder aufzusetzen. Dann übertragen Sie die Lösung auf ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr für vier Ein-Milliliter-Ethanolwäsche durch Zentrifugation, wodurch das Pellet durch Ultraschall zwischen jeder Wäsche etwa eine Sekunde lang wieder aufsetzt wird.

Um Thiole in die Partikeloberflächen einzuführen, setzen Sie das Pellet nach der letzten Wäsche in einem Milliliter eines 85%Ethanols, 10%3-Mercaptopropyl-Trimethoxysilan und 5%deionisierter Wasserlösung für eine ein- bis zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur wieder auf. Waschen Sie am Ende der Inkubation die thiol-funktionalisierten Nanopartikel wie angegeben durch Zentrifugation, wodurch das Pellet durch Ultraschall zwischen den Waschungen wieder aufgesetzt wird. Für den Antikörper reagieren funktionalisierte Antifolatrezeptor-Nanosonden 200 Mikrogramm Antifolat-bindender Proteinantikörper mit einem zehnfachen Molarenüberschuss von PEG-Kreuzlinker in 500 Mikroliter HEPES-Puffer.

Nach 30 Minuten den Antikörper durch Zentrifugation in einem Zentrifugalfilter konzentrieren und den Antikörper durch Invertieren des Filters in ein neues Rohr für eine zusätzliche Zentrifugation zurückgewinnen. Mischen Sie dann die thiol-funktionalisierten Nanopartikel mit dem konzentrierten Antikörper und inkubieren Sie die Mischung mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um nicht zielgerichtete Nanosonden zu bilden, fügen Sie fünf Milligramm Methoxy-terminiertes PEG 5000-Maleimid, das in DMSO gelöst ist, zu den thiol-funktionalisierten Nanopartikeln in 500 Mikroliter HEPES-Puffer für eine mindestens 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.

Für Nanoprobe-Injektion drehen Sie beide Nanosonden-Aromen herunter und setzen Sie die Pellets in frischem MES-Puffer mit einer Konzentration von 600 Picomolar wieder auf. Mischen Sie die Nanopartikel und laden Sie einen Milliliter der resultierenden Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Spur-Nadel pro Maus ausgestattet ist, und injizieren Sie das gesamte Volumen in den Bauch jeder Maus. Dann massieren Sie den Bauch sanft, um die Nanopartikel in der Peritonealhöhle zu verteilen.

Nach mindestens 25 Minuten sichern Sie die Gliedmaßen eines eingeschläferten tieres auf einer chirurgischen Plattform und verwenden Sie gezackte Zangen und Sezierschere, um die Haut zu entfernen, um das Peritoneum freizulegen. Incise das Peritoneum. Befestigen Sie die Peritonealklappen an der Plattform und waschen Sie die Innenseite der Peritonealhöhle mit mindestens 60 Milliliter PBS.

Übertragen Sie dann die Plattform auf ein Raman Spektralphotometer mit aufrechter optischer Konfiguration und einer motorisierten Stufe und bebildern Sie den Bauch unter den entsprechenden Bildparametern. Dies ist entscheidend, dass fokale Ebene für den Raman-Scan auf der Oberfläche der meisten der Eingeweide ist. Wenn die Organe a-ebene sind, wird das erworbene Signal nicht nützlich sein.

Zur Qualitätskontrolle können die Nanopartikel während des Syntheseprozesses mit einer Vielzahl von Methoden charakterisiert werden, darunter Transmissionselektronenmikroskopie, dynamische Lichtstreuung, Nanopartikelverfolgungsanalyse und ultraviolette sichtbare Absorptionsspektroskopie. Raman-Messungen zeigen das Vorhandensein der einzigartigen Spektren jedes Geschmacks von Nanopartikeln während der gesamten Synthese. Typische Reaktionsausbeuten und Konzentrationen hängen stark von der Pipettiertechnik während der Waschschritte ab.

Die Raman-Spektren können verarbeitet werden, um die Fluoreszenz zu entfernen und normalisiert zu EinheitSfläche, um die Signalstärke zu kompensieren, bevor die klassischen kleinsten Quadrate angewendet werden. Obwohl die klassischen am wenigsten quadrierten Werte in jedem Nanosonden-Referenzspektrum nicht einzeln die spezifischen Positionen der Tumoren angeben, zeigen die punktweisen Verhältnisse das Vorhandensein der disseminierten mikroskopischen Ausbreitung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Nanopartikel bei jedem Schritt der Synthese zu validieren, da die Qualität der Nanopartikel die Endergebnisse stark beeinflusst.

Diese Technik demonstriert das Potenzial für Forscher, SERRS-Nanosonden zum Nachweis von tumorbezogenen Markern in Tiermodellen und ausgeschnittenen Patientengeweben mit hoher mikroskopischer Präzision zu verwenden.