Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

Dieses Protokoll ist wichtig, da die Entwicklungsoptimierung und Übertragung von Multiplex-Immunfluoreszenzprotokollen komplex und anspruchsvoll ist. Für viele Labore ist der Halt eines optimierten Protokolls von unschätzbarem Wert. Die multispektrale Immunfluoreszenz ermöglicht es uns, sowohl den Standort als auch die Identität mehrerer Zelltypen in und um den Tumor zu beurteilen.

Dies ist eine leistungsstarke Kombination von Informationen in immunonkologischen Studien. Die überzeugendste Anwendung für Multiplex-Immunfluoreszenz ist die Immunonkologie. Aber die Fähigkeit, mehrere Immunzelltypen in Setu zu vermessen, kann über alle Autoimmun- und Entzündlichen Therapien hinweg genutzt werden.

Die Kenntnis der Lage und des Phänotyps von Immunzellen in und um Festkörperzellen ist sowohl prognostische als auch vorhersehbare Reaktionen auf die tumorspezifische Immuntherapie. Die Optimierung und Validierung des Protokolls sind wichtige Schritte, die nicht überstürzt werden sollten. Neue Entwickler sollten sich mit den neuen Arten von Artefakten vertraut machen, die mit multispektraler Bildgebung verbunden sind.

Um das Basis-Multiplex-Protokoll zu lokalisieren, laden Sie es auf den automatisierten Stainer vor. Filtern Sie für all'anstelle von preferred'auf dem Protokollbildschirm. Bevor Sie Änderungen vornehmen, speichern Sie das ursprüngliche Protokoll und klicken Sie auf die Registerkarte Protokolle, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Opal 6 Multiplex, um Kopieren auszuwählen.

Ändern Sie den Namen im neuen Fenster in 7 Multiplex Protocol 1', und wählen Sie die Registerkarte aus, die dem richtigen Gerät zugeordnet ist. Passen Sie das Protokoll in der Zusatztabelle S1' an und klicken Sie auf Reagenz hinzufügen, um einen zehnminütigen Paroxid-Hemmschritt hinzuzufügen, indem Sie den Peroxidase-Inhibitor als Reagenz auswählen. Bestätigen Sie, dass die Blockierschritte einen Proteinkinase-Inhibitor-Blockierungspuffer verwenden, dass sich jeder primäre Antikörper auf das entsprechende Reagenz bezieht, dass die sekundären Anti-Körper-Schritte ein Meerrettich-Peroxidase-Polymer verwenden und dass der spektrale Dapi, der mit dem multispektralen Automatisierungskit geliefert wird, verwendet wird.

Stellen Sie sicher, dass das Protokoll den Peroxidase-Inhibitor enthält, gefolgt von sechs sequenziellen Färbeläufen, die jeweils einen Proteinblockierschritt, einen primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, einen Tyramidboden und dann Antigen-Retrieval enthalten, um die Antikörper zu entfernen. Um die Drop-Steuerelemente hinzuzufügen, kopieren Sie den Namen 7 Multiplex Protocol 1', und ändern Sie ihn in 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Ändern Sie das CD68-Antikörper-Reagenz in Mouse IgG, und speichern Sie das Protokoll.

Erstellen Sie dann sechs weitere neue Protokolle, eines für jede Ablagesteuerung und eines für die vollständige Iso-Typsteuerung auf die gleiche Weise. Erstellen Sie ein Drop-Control-Protokoll für jedes Ziel auf die gleiche Weise, wie ich Es Ihnen hier gezeigt habe. Um ein Forschungsdetektionskit vorzubereiten, füllen Sie den 30 Milliliter offenen Behälter, der für 1X Tris-gepufferte Salin markiert ist, mit 1X Tris-gepufferter Saline, und platzieren Sie den Behälter in der Position, die am weitesten vom Griff entfernt ist, im Multiplex Research Kit 1.

Beschriften Sie zwei 30 Milliliter offene Behälter muli-spektralen Block' und multispektrale sekundäre, und füllen Sie den Mutli-Spektral-Blockbehälter mit 30 Milliliter blockierenden Puffer-Antikörper-Verdünnungsmittel aus dem Multi-Spectral Staining Kit. Füllen Sie den multispektralen Sekundärbehälter mit 30 Milliliteranti-Maus-Anti-Toll-Anti-Toll-Anti-Antikörper-Polymer aus dem Multi-spektralen Färbung Kit und fügen Sie 600 Mikroliter Antikörperverdünnung in jedem der zehn 7 Milliliter offenen Behälter hinzu. Als nächstes fügen Sie den konzentrierten Primärantikörper in den entsprechenden Rohren in die in der Tabelle angegebenen Volumina hinzu und mischen Sie ihn durch sanftes Pipettieren.

Fügen Sie 3 Milliliter doppelt destilliertes Wasser, plus 12 Tropfen Spektraldapi in einen 7 Milliliter offenen Behälter und 3 Milliliter Peroxidase block in einen zweiten 7 Milliliter offenen Behälter. Jeden liathalisierten Boden mit 75 Mikroliter Dimethylsulfoxid wieder aufhängen und durch Pipettieren mischen. Dann lagern Sie die Tyramid-Signalverstärkung Bodenbestände bei 4 Grad Celsius bis fertig.

Bei der Vorbereitung der einzelnen TSA Bodenverdünnungen. Registrieren Sie alle Reagenzien auf dem Auto-Stainer, legen Sie dann jeden Behälter in ein Reagenzien-Rack und laden Sie alle Reagenzien auf den automatisierten Färbe. Der Färber erkennt das Vorhandensein und bestätigt das Volumen jedes Reagenzes.

Sobald alle Reagenzien geladen sind, aktivieren Sie das Protokoll, um über Nacht zu laufen. Montieren Sie die Proben am Ende des Färbevorgangs mit Abdeckzetteln und laden Sie die Proben zum Scannen in den Multi-Spectral Imaging Platform Scanner. Wenn alle Samples gescannt wurden, werden die Bilder als qptiff-Dateien formatiert.

Öffnen Sie ein entsprechendes qptiff-Analysesoftwareprogramm, und klicken Sie auf Folie laden, um einen fünf Filter-Gesamtens-Folienscan der Folie von Interesse zu öffnen. Melden Sie sich an, und wählen Sie mit dem Stempelwerkzeug fünf Bereiche für die multispektrale Bildgebung aus. Wählen Sie unter Wählen Sie für:Select Acquisition'under Size in Fields:select 1x1 and under Field resolution'select 0.5 micrometers 20x.

Basierend auf dieser Cytokeratin Färbung wählen Sie mehrere Regionen mit Cytokeratin positiveM Tumorgewebe, und Cytokeratin negatives Stromalgewebe aus dem Gesamtscan abgebildet werden. Wenn alle multispektralen Bilder ausgewählt sind, wechseln Sie zur Vectra-Software und ändern Sie die Aufgabe von Scan zu multispektraler Bildgebung für jedes Dia. Klicken Sie dann auf Scannen, um die multispektrale Bildgebungssammlung auszuführen.

Wenn die multispektrale Bildaufnahme abgeschlossen ist, verwenden Sie die spektrale Un-Mixing-Software, um Dateien innerhalb des multispektralen Bildordners zu öffnen. Unter Bildformat wählen Sie multi-spectral'Unter Beispielformat'select fluorescence'And unter Spektralbibliothek Quelle'select inForm'Um die Böden auszuwählen, wählen Sie alle sechs Etagen aus und laden Sie sie, und dapi aus den Beispielbibliotheksfolien, und klicken Sie auf Alle vorbereiten. Die spektrale Un-Mixing-Software führt spektrales Unmixen auf allen offenen Bildern mit den mitgelieferten Spektralprofilen durch.

Identifizieren und kommentieren Sie das autofluoreszierende Spektralprofil. Achten Sie darauf, die Auto-Fluoreszenz-Funktion zu überprüfen, um sicherzustellen, dass sie nach dem Abschalten vollständig im Autofluoreszenzkanal erfasst wird, und um verschiedene Probenahmen zu testen, bis sie akzeptabel entfernt werden. Bewerten Sie dann das Färbemuster gegen die chromogenen Einzelflecken desselben Ziels in sequenziellen Dias desselben Gewebes mit einem Pathologen.

Um die Fluoreszenzintensität der einzelnen Kanäle zu bewerten, verwenden Sie das Zählwerkzeug, um die offenen Bilder zu untersuchen. Kehren Sie dann zum Färbeprotokoll zurück, und passen Sie die TSA-Konzentration an alle normalisierten Anzahlen an, die den akzeptablen Bereich überschreiten oder nicht erreichen. In dieser repräsentativen Analyse zeigte das Tonsillengewebe eine klar definierte Cytokeratinfärbung innerhalb der Tonsilenoberfläche, Plattenepithel ohne Hintergrund im Lymphgewebe mit Cytokeratin und PDL-1 Färbung, die im retikulierten Epithel der Krypten sichtbar ist.

Die follikulären Keimzentren waren leicht erkennbar und reich an Ki-67-positiven Lymphozyten. Die Makrophagen in den Keimzentren wurden durch ihre CD-68-Expression identifiziert, wobei einige Makrophagen auch außerhalb des Keimzentrums beobachtet wurden. CD-8-gefärbte Lymphozyten mit einer T-Zell-Verteilung und PD-1-Expression stark gefärbt kleine Lymphozyten clusteriert an der Peripherie des Keimzentrums, sowie in der interfollikulären Region verstreut.

Nachdem das erwartete Färbemuster bei der Mandelgewebekontrolle bestätigt wurde, konnte die gleiche Färbung in einer Lungenkrebsprobe bewertet werden. Isotyp-Negativ- und Fallkontrollen sollten ebenfalls evaluiert werden; nicht nur zur Erkennung von Hintergrund- und Autofluoreszenz, sondern auch bei Schirmeffekten und Spektralblutungen. Drop-Controls sind wichtig für die Bewertung potenzieller Artefakte in der Färbung aufgrund der Multiplex-Immunfluoreszenzmethode während der Optimierung eines neuen Multiplex-Panels.

Jede Fallkontrolle sollte das gleiche Färbemuster wie das vollständige Multiplex-Panel aufweisen, mit Ausnahme des einzelnen primären Antikörpers, der bei jeder spezifischen Steuerung entfernt werden sollte. Immunprofilierung mit multispektraler Immunfluoreszenz ermöglicht die Schichtung von Tumoren und Regionen durch Immunkriterien, die dann durch massive Multiplex-Genom-, Transkriptomik- und Proteomikstudien untersucht werden können. Ich habe Multiplex-Immunfluoreszenz verwendet, um Wirkmechanismen in der Onkologie und Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, die die Identifizierung und Charakterisierung von Immun- und pathogenen Zellen in einem einzigen Abschnitt in Setu ermöglichen.

Bei der Arbeit mit Antikörpern gegen menschliche Proteine, Tyramid und Dapi sollten allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, aber es ist bekannt, dass kein Reagenz oder Material in diesem Protokoll besonders gefährlich ist.