Name: Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Kernen aus dem Rückenmark adulter Mäuse für massiv parallele Single-Nukleus-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Genexpressionsprofilen in schwierig zu dissoziierendem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das intramurale Programm der NINDS (1 ZIA NS003153 02) und NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wir danken L. Li und CI Dobrott für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen und C. Käthe für die Überprüfung der Handschrift.

Alle tierische Arbeit wurde nach einem Protokoll genehmigt von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care und Use Committee durchgeführt. Ausgewogene Proben von männlichen und weiblichen ICR/CD-1 Wildtyp Mäusen, zwischen 8 und 12 Wochen alt, wurden für alle Experimente verwendet. Mäuse sollten in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Animal Care und Use Committee Richtlinien behandelt werden.
1. Vorbereitung von Materialien und Puffer
<ol><li>Bereiten Sie alle Puffer Tag der Nutzung und Pre-chill auf Eis (siehe Tabelle 1).<ol>
<li>Wenn Reinigungsmittel-mechanische Lyse, bereiten Sie Waschmittel Lyse-Puffer (> 500 μL pro Probe), niedrigen Saccharose Puffer (> 6 mL pro Probe), Saccharose Dichte Puffer (> 12,5 mL pro Probe) und die Wiederfreisetzung Lösung (> 1 mL).</li>
		<li>Wenn hypoton-mechanische Lyse, bereiten hypotone Lyse Puffer (> 5 mL pro Probe), HEB Medium (> 5 mL pro Probe), niedrigen Saccharose Puffer (> 3 mL pro Probe) Saccharose Dichte Puffer (> 12,5 mL pro Probe), und die Wiederfreisetzung Lösung (> 1 mL).</li>
		<li>Hinzu kommen 25 μL der Dithiothreitol (DTT) 25 mL des Puffers niedrigen Saccharose und eine weitere 25 μL von DVB-t, 25 mL des Puffers Saccharose Dichte Gradienten vor dem Starten des Protokolls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bedecken Sie die sezierenden Oberfläche mit Alufolie zu minimieren Kontamination der Probe mit Fasern aus Papiertüchern oder Bank-Protektoren, die mikrofluidische Kanäle verwendet werden, für die Erfassung der einzelnen Kerne verstopfen können.</li>
	<li>Sprühen Sie resektionsinstrumente und Sitzbank Platz mit einer RNase Dekontaminationslösung. Darüber hinaus spray innen von der Dounce Homogenisator (bei Verwendung von Reinigungsmittel-mechanische Zelle Lysis) und Oak Ridge Rohr mit einer RNase Dekontaminationslösung. Spülen Sie das Dounce und Oak Ridge Rohr mit hochreinen, RNase-freies Wasser.</li>
	<li>Pre-chill alle Röhrchen (50 mL konisch, Oak Ridge) und Dounce Homogenisator Röhren auf dem Eis.</li>
	<li>Feuer Polieren eine Reihe von Pasteur Pipetten (bei Verwendung von hypoton-mechanische Zelle Lysis).</li>
</ol>2. Vorbereitung des Rückenmarks
<ol><li>Wenn frische Gewebe, einschläfern der Maus durch CO2 Einatmen. Sprühen Sie nach Euthanasie das Fell der Maus mit 70 % Ethanol, Haar-Verunreinigungen in der Probe zu minimieren.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Maus mit scharfen, RNase-freie chirurgische Scheren. Als nächstes leichtes Anheben der Bauch Haut mit Pinzette und machen einen Schnitt entlang der Länge des Körpers, um die inneren Organe aussetzen.</li>
	<li>Ausweiden der Maus durch Ziehen an die inneren Organen aus der Körperhöhle mit Pinzette. Verwenden Sie keine Papiertücher auf den Bereich sauber oder Organe zu entfernen, da diese Verunreinigungen einführen kann. Mit Schere, Schnitt die vertebrale Spalte zwischen L2 und L3 Wirbelsäule Wirbel. Hinweis: Mit der Praxis, kann dieser Schritt in weniger als 30 Sekunden erreicht werden.<ol>
<li>Passen Sie zum Auswerfen des Rückenmarks eine 3 mL-Spritze mit eiskaltem PBS mit einer Nadel 25 G ¼ Zoll. Setzen Sie die Spitze der Nadel in die sakrale Ende der Wirbelsäule. Verwenden Sie zwei Finger Einklemmen der Wirbel um eine gute Abdichtung um die Spitze der Nadel zu erstellen und auf den Kolben drücken, um das Rückenmark Rostral auswerfen. Legen Sie das Rückenmark in einer Petrischale mit eiskaltem PBS.</li>
		<li>An dieser Stelle frieren Sie das Gewebe ein und bei-80 ° C lagern Sie oder verwenden Sie sofort für Waschmittel-mechanische (Schritt 3) oder hypotone-mechanische (Schritt 4) Lyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn mit tiefgefrorenem Gewebe, pflegen das Gewebe auf Trockeneis, fahren Sie mit Spülmittel-mechanische (Schritt 3) oder hypotone-mechanische (Schritt 4) Lyse.</li>
</ol>3. Reinigungsmittel-mechanische Zelle Lysis
<ol><li>Legen Sie die Lendenwirbelsäule Rückenmark in einen vorgekühlt Dounce-Homogenisator und fügen Sie 500 mL Waschmittel Lyse Puffer vorab gekühlt. Hinweis: Eine Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark ist 325,5 mg ± 63,9 mg Standardfehler des Mittelwertes (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g des Gewebes kann erfolgreich eingesetzt werden.</li>
	<li>Dounce mit 5 Schlägen der Stößel ("lose" zerstoßen), dann ca. 5-10 Schläge der Stößel B ('eng' Stößel). Aufhebung der Homogenisator aus der Lyse Lösung zwischen Strichen und vermeiden Sie Einführung Bläschen.</li>
	<li>Legen Sie ein 40 mm Sieb über einer vorgekühlt 50 mL konische Rohr und Prewet mit 1 mL der niedrigen Saccharose Puffer.</li>
	<li>Die Dounce-Homogenisator, enthält die rohen Kerne in der Lyse Puffer 1 mL der niedrigen Saccharose Puffer hinzu und Mischen von 2 – 3 Mal pipettieren.</li>
	<li>Die 40 mm-Sieb übergehen Sie die rohen Kerne Prep in das vorgekühlt 50 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Die 40 mm-Sieb, 3 mL des Puffers niedrigen Saccharose und 500 mL des Puffers Lyse das Endvolumen bringen übergehen Sie einen zusätzliche 1 mL niedrigen Saccharose Puffer.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, wenn mehrere Schnüre, Bündelung in der gleichen konische Röhre kombinieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.200 x g für 10 min bei 4 ° C. Nach Abschluss der Zentrifugation Dekantieren Sie überstand. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>4. hypoton-mechanische Zelle Lysis
<ol><li>Ort die Lendenwirbelsäule Rückenmark in 5 mL des Puffers hypotone Lyse in einer Gewebekultur-Schale. Das stumpfe Ende Frühjahr Schere halbieren das Rückenmark und dann Frühjahr Schere um die Schnur in 3 – 4 mm Stücke schneiden verwenden, aber nicht hacken. Hinweis: 50 mg – 1,5 g des Gewebes kann erfolgreich eingesetzt werden.</li>
	<li>Auf dem Eis für 15 min, 2 – 3 Mal wirbelnden inkubieren.</li>
	<li>Zugeben Sie 5 mL HEB Medium den hypotone Lyse Puffer verdünnen.</li>
	<li>Genannte Gewebe 10 mal mit einem serologischen 5-mL-Pipette, oder bis alle Teile des Gewebes durch die Öffnung der Pipette reibungslos bewegen.</li>
	<li>Mit einer Reihe von drei feuerpolierte Pasteur Pipetten mit zunehmend schmaler Durchmesser genannte (~ 900 – 600 mm).<ol>
<li>Für jede Pipette genannte 5 - 15 Mal, Gewebe zu begleichen, 1 – 2 mL überstand mit getrennten Kerne entfernen und ein 40 mm-Sieb in ein vorgekühlt 50 mL konische Röhrchen übergehen lassen.</li>
		<li>Sicherstellen Sie nach der Verreibung mit der kleinsten Größe Pasteurpipette, dass die Homogenat reibungslos durch die PIPETTENSPITZE fließt. Die 40 mm-Sieb übergehen Sie die restliche Lösung in der 50 mL konische Röhrchen. Hinweis: Die Gesamtzahl der verreibungen eingestellt werden wie gewünscht. Die Hirnhaut des Rückenmarks Maus bleibt, aber es ist wichtig, sichtbaren Klumpen des Rückenmarks genannte. Die 40 m Sieb übergehen Sie die restlichen Homogenat. Vermeiden Sie Luftblasen während der Verreibung Einführung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterten Probe bei 1.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Nach Abschluss der Zentrifugation, Dekantieren und den überstand verwerfen. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>5. Homogenisierung und Saccharose Dichtegradient
<ol><li>Nach Schritt 3 oder 4 Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL niedrigen Saccharose Puffer. Schwenken Sie vorsichtig um die Pellets von der Wand zur Erleichterung der Wiederfreisetzung zu entfernen. Lassen Sie die Probe sitzen für 2 min auf Eis und die Aussetzung auf einem Oak Ridge Rohr übertragen.</li>
	<li>Mit Hilfe der Homogenisator bei Einstellung 1, die Kerne im niedrigen Saccharose Puffer für 15-30 s, halten Sie die Probe auf dem Eis zu homogenisieren. Hinweis: Verwendung 15 s bei Verwendung einer lumbalen Rückenmarks oder 30 s wenn gebündelt Proben oder eine ganze Rückenmark.</li>
	<li>Mit Hilfe einer serologischen Pipette Schicht 12,5 mL Dichte Saccharose Puffer unter niedrigen Saccharose Puffer Homogenat, kümmert sich nicht um eine Blase zu erstellen, die die Dichte Schichten stört.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.200 x g für 20 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Nach Abschluss der Zentrifugation sofort Dekantieren des Überstands in einer flinken Bewegung. Hinweis: Ein Restvolumen (weniger als 400 mL) von Saccharose Puffer kann verworfen werden, wenn gewünscht, ein leiser und sauberer Endprobe zu produzieren, aber dieses Restvolumen enthält Kerne und erhalten werden kann, um die Kerne Ertrag zu maximieren.</li>
	<li>Mit 100 mL - 1 mL der Lösung Wiederfreisetzung, Aufschwemmen der Kerne auf der Wand bleiben. Vermeiden Sie das Myelin "Stirnrunzeln", das mit der Waschmittel-Basis Vorbereitung bleibt.</li>
	<li>Filtern Sie die Kerne durch ein 30 – 35 mm Porengröße Sieb und sammeln Sie in einem vorgekühlt Rohr.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Kerne liefern mit einem Hemocytometer Kerne unter einem 10 X-Objektiv zu zählen. Hinweis: Trypan blau kann hinzugefügt werden, Kerne, visualisieren die blau erscheinen soll. Beachten Sie die Höhe der zelltrümmer.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 6 oder 7.</li>
</ol>(6) massiv parallele SnRNA-Sequenzierung: akademische Plattform7
<ol><li>Führen Sie die massiv parallele SnRNA Sequenzierung (z. B.Drop-Seq) Methode wie oben beschrieben7 mit folgenden Änderungen:4<ol>
<li>Stellen Sie Kerne, eine Endkonzentration von 225 Kerne pro mL.</li>
		<li>Bereiten Sie Barcodes Perlen in einer Konzentration von 250 Perlen pro mL.</li>
		<li>Die Lyse-Puffer mit 0,7 % Sarkosyl vorzubereiten.</li>
		<li>Passen Sie die Volumenströme bis 35 mL / min. für Perlen, 35 mL / min. für Kerne und 200 mL / min. für Öl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) massiv parallele SnRNA-Sequenzierung: kommerzielle Plattform26
<ol><li>Führen Sie massiv parallelen SnRNA-Sequenzierung mit dem kommerziellen Plattform (z.B.Chrom Zelle Gene Expression Einzellösung) Produkte nach dem Hersteller Anleitungen26 mit der folgenden Änderung:<ol>
<li>Fügen Sie nach rückwärts-Transkription einen zusätzliche PCR-Zyklus um die berechnete Anzahl von Zyklen für cDNA Amplification basierend auf die gezielte Zelle Erholung zum Ausgleich der verminderten cDNA aus Kernen im Vergleich zu Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
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<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
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<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
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<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
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<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
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 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
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</ol>

Wir haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist, Kerne mit qualitativ hochwertigen RNA für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu isolieren. Wir angepasst SnRNA-Seq Methoden um alle Zelltypen im Rückenmark zu profilieren. Zunächst fanden wir, dass typische Zelle Dissoziation Methoden für einzelne Zelle RNA Sequenzierung, unwirksam waren, wie Rückenmark Neuronen Absterben von Zellen besonders anfällig sind. Darüber hinaus verursachen Zelle Dissoziation Methoden Ausdruck der verschiedenen Aktivitäten und Stressantwort G...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Das Nervensystem besteht aus heterogenen Gruppen von Zellen, in denen vielfältige morphologische, Biochemische und elektrophysiologische Eigenschaften angezeigt. Während die Masse RNA Sequenzierung nützlich für die Bestimmung der Gewebe-Änderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen wurde, schließt es die Erkennung von transcriptional Änderungen auf der Ebene der einzelnen Zelle. Jüngste Fortschritte in der einzelligen transkriptionelle Analyse konnten die Einteilung der heterogenen Zellen in funktionellen Gruppen anhand ihrer molekularen Repertoire und können auch genutzt werden, um Gruppen von Neuronen zu erkennen, die vor kurzem aktiv gewesen. 1 , 2 , 3 , 4 in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung der einzelnen Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq) die Untersuchung der Genexpression in Einzelzellen, bietet einen Blick in Zelltyp Vielfalt ermöglicht. 5
Die Entstehung der skalierbare Ansätze wie massiv parallelen ScRNA-FF, lieferte Plattformen zur Sequenz heterogene Gewebe, einschließlich viele Regionen des zentralen Nervensystems. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch einzelne Zelle Dissoziation Methoden Zelltod sowie experimentelle Veränderungen in der Genexpression führen. 16 neuere Arbeiten adaptierte Einzelzelle sequenziermethoden um Erhaltung der endogenen transcriptional Profile zu aktivieren. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 diese Strategien wurden besonders geeignet zur Erkennung von unmittelbaren frühen (IEG) Genexpression nach Sinnesreiz oder Verhalten. 3 , 4 In der Zukunft könnte diese Strategie auch verwendet werden, dynamische Veränderungen in den Geweben bei Krankheitszuständen oder in Reaktion auf stress zu studieren. Dieser Methoden einzelne Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist ein vielversprechender Ansatz, das beinhaltet keine Stress auslösende Zelle Dissoziation und kann verwendet werden, schwierig, Gewebe (z. B. das Rückenmark) zu distanzieren, sowie gefrorene Gewebe. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted von früheren Kerne Isolierung Methoden nutzt20,21,22,23,25 SnRNA-Seq in der Regel schnelle Gewebe Störungen und Zelle lyse unter kalten Bedingungen, Zentrifugierung und Trennung der Kerne von zelltrümmer. 4 Kerne für die nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation auf mehreren Plattformen in mikrofluidischen Tröpfchen Kapselung absperrbar. 4 , 7 , 24 , 25 diese Methode ermöglicht einen Überblick über die transkriptionelle Aktivität aus Tausenden von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt.
Es gibt mehrere Strategien für die Freigabe von Kernen von Zellen vor Isolation und Sequenzierung, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile. Hier beschreiben wir vergleichen zwei Protokolle zur Isolierung von Kernen aus dem Erwachsenen Rückenmark für die nachgelagerten massiv parallelen SnRNA-Seq ermöglichen: Waschmittel-mechanische Lyse und hypotone-mechanische Lyse. Waschmittel-mechanische Lyse liefert komplette Gewebe Störungen und eine endgültige Mehrertrag von Kernen. Hypotone Maschinenbau-Lyse enthält eine steuerbare Maß an Gewebe Störungen, bietet eine Möglichkeit für die Auswahl ein Gleichgewicht zwischen der Menge und Reinheit der letzten nuklearen Ausbeute. Diese Ansätze bieten vergleichbare RNA-Ausbeute, ermittelte Anzahl von Genen pro Kern und Zelltyp profiling und können auch beide verwendet werden erfolgreich für SnRNA-Seq.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8,0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH = 8,0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Unmittelbar vor der Verwendung DTT hinzufügen</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Kristallgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Kristallgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0,04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0,2 U/ &mu; L RNAse Inhibitor</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteur-Pipeten aus Borosilikatglas mit Baumwollstopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Glasgewebe Dounce (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Glas Stößel mit großem Abstand</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Glasstößel mit kleinem Abstand</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenisator</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Dispergierwerkzeug (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Zellensieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Festwinkelrotor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Sterologische Pipetten: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barcoding Beads</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminationslösung</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Reagenzglas mit Zellsiebkappe (35 &mu; m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios Zellsortierer</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Einzelzelle 3' Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von erwachsenen rückenmark kerne für massiv parallele single-kern-rna-sequenzierung

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Eine einzelne Zelle Genexpression sondieren ermöglicht die Identifizierung von Zelltyp und Zellstatus. Einzelne Zelle RNA Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium transcriptional Profile der Zellen, vor allem in heterogenen Geweben wie das zentrale Nervensystem entstanden. Dissoziation-Methoden, die für die einzelne Zelle Sequenzierung erforderlich können jedoch auf experimentelle Veränderungen in der Gen-Ausdruck und Zelle Tod führen. Darüber hinaus sind diese Methoden in der Regel auf frischem Gewebe, wodurch Studien zur Archivierung und Bio-Bank Material beschränkt. Einzigen Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist eine attraktive Alternative für transkriptionelle Studien, da es genau identifiziert Zelltypen, erlaubt die Untersuchung von Gewebe, das gefrorene oder schwer zu distanzieren, und reduziert die Dissoziation-induzierte die Transkription. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Protokoll für schnelle Lokalisierung der Kerne für nachgeschaltete SnRNA-Seq. Diese Methode ermöglicht die Trennung der Kerne von frischen oder gefrorenen Rückenmark Proben und kann mit zwei parallelen Tröpfchen Kapselung Plattformen kombiniert werden.

Hier haben wir Isolierung der Kerne aus dem Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark für nachgeschaltete massiv parallelen RNA Sequenzierung durchgeführt. Das Protokoll beteiligten drei Hauptkomponenten: Gewebe Störungen und zellulären Lyse, Homogenisierung und Saccharose Dichte Zentrifugation (Abbildung 1). Innerhalb von Sekunden ergab die Waschmittel-mechanische Lyse eine grobe Kerne Vorbereitung mit einer großen Anzahl von Kernen sowie Mobilfunk und G...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Die einzellige RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Transkriptionsprofilen von Zellen, insbesondere im heterogenen Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von Kernen für die SEQUENZierung von RNA mit einem Kern. Durch die Verwendung von Kernen anstelle von Zellen kann diese Methode auf schwer zu dissoziierendes Gewebe sowie auf gefrorenes Gewebe angewendet werden.Darüber hinaus kann diese Methode angewendet werden, um zelltypspezifische Veränderungen in Zellen nach Krankheit oder Verletzung zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit mauseulärlicheM, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes machen Sie einen Schnitt entlang der Länge des Körpers, um die inneren Organe freizulegen.Entfernen Sie die Maus, indem Sie die inneren Organe aus der Körperhöhle mit Zangen ziehen. Verwenden Sie keine Papiertücher, um den Bereich zu reinigen oder Organe zu entfernen, da dies Verunreinigungen mit sich bringen kann. Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule zwischen den Wirbelsäulen L2 und L3.Um das Rückenmark auszuwerfen, passen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit eiskaltem PBS mit einer 25

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte, inputarme Probenvorbereitung für die Einzelkernsequenzierung, einschließlich der Dissektion von Maus-Superior-Cervix- und Sternganglien, Zelldissoziation, Kryokonservierung, Nukleusisolierung und Hashtag-Barcoding.

Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus schockgefrorenem, archiviertem Lebergewebe für Einzelkern-RNA-seq, ATAC-seq und Gelenk-Multiomics (RNA-seq und ATAC-seq) vor.

Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Lebergewebe für Einzelzell-Multiomics

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Die Biologie des intermuskulären Fettgewebes (IMAT) ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von menschlichem Gewebe weitgehend unerforscht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die zelluläre Zusammensetzung dieses einzigartigen Fettdepots zu identifizieren.

Isolierung von Zellkernen aus humanem intermuskulärem Fettgewebe und nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Lernen Sie die Isolierung von Kernen aus dem Rückenmark adulter Mäuse für massiv parallele Single-Nukleus-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Genexpressionsprofilen in schwierig zu dissoziierendem Gewebe.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

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