Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)
6. April 2019
Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.
Afrikanische Trypanosomen sind verantwortlich für menschliche afrikanische Trypanosomiasis, oder Schlafkrankheit und tierische afrikanische Trypanosomiasis. Die Trypanosomen, die Schlafkrankheit verursachen, sind tsetse fliegen übertragene protistische Parasiten, die in vielen geographischen Brennpunkten in Subsahara-Afrika vorhanden sind. Der Nachweis des Parasiten ist für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge unerlässlich.
Eine Serologie kann falsche positive und leider falsche negative Ergebnisse liefern. Um die Erkennung im Blut zu unterstützen, müssen Trypanosomen konzentriert werden. Es wurden verschiedene Techniken zur Parasitenkonzentration eingesetzt.
Die empfindlichste Methode ist die Trennung von Parasiten vom Blut durch eine Säule von Anionenaustauscher, DEAE-Zellulose gefolgt von Zentrifugation und mikroskopischer Beobachtung. Folglich ist die DEAE-Zellulose-Methode die beste und bleibt bis heute, die Referenzmethode zur Visualisierung und Isolierung von Parasiten aus dem Blut für die menschliche afrikanische Trypanosomiasis-Diagnose, insbesondere unter Felderkrankungen. Diese Methode, die am besten geeignete Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis bietet auch gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.
Alle Untersuchungen, die dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren entsprechen, und die Zustimmung wurde von den französischen Behörden eingeholt, und alle verwendeten Protokolle wurden von unserer lokalen Ethikkommission genehmigt. Wägen Sie jede Substanz nach dem schriftlichen Protokoll ab. Destilliertes Wasser hinzufügen und sich mit Kaliumdihydrogenphosphat präzise an pH8 anpassen, um die folgenden gepufferten Lösungen, konzentrierte Phosphatpuffersalze 2X, herzustellen.
Destilliertes Wasser und Glukose für phosphatgepufferte Salzglukose hinzufügen. Für 100 Milliliter Elutionspuffer 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin und fünf Mikrogramm Milliliter Phenolrot zu Phosphat gepufferter Kochstoffglukose hinzufügen. 100 Gramm DEAE-Zellulose werden zunächst mit drei Litern destilliertem Wasser gewaschen und dann abgelassen.
Feine Partikel werden entsorgt. Die Wasswerden werden wiederholt, bis der Überstand klar ist. Konzentrierte Phosphatgepufferte Saline 2X wird zugegeben und die DEAE-Zellulose gerührt.
Der pH-Wert wird mit einem Molkaliumphosphat auf acht eingestellt. Die Zellulose wird dann zweimal mit destilliertem Wasser und zweimal mit Phosphat gepufferter Salzglukose gewaschen. Die DEAE-Zellulose und Phosphat gepufferte Saline-Glukose werden in gleichen Mengen gemischt.
Legierung geviertelt und gelagert bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius oder bei minus 20 Grad Celsius für längere Lagerung. Trypanosome infiziertes Blut wird in flüssigem Stickstoff gespeichert. Ein Legierungsquart von einem Milliliter wird bei Raumtemperatur aufgetaut.
Parasiten werden sorgfältig aus dem Kryotube mit einer Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze gesammelt. Die Lebensfähigkeit aufgetauter Parasiten wird durch die Beweglichkeit beurteilt, die durch Lichtmikroskopie-Beobachtung vor der Infektion visualisiert wird. Parasiten werden in die Peritonealhöhlen von zwei Mäusen injiziert, 500 Mikroliter pro Maus.
Jeden Tag nach der Infektion wird die Parasitenämie durch Das Sammeln eines Tropfens Blut aus dem Schwanz mit einer Nadel bewertet und durch Mikroskopie überprüft. Wenn die Parasitenaufe auf einem geeigneten Niveau ist, wird infiziertes Blut gesammelt. Eine 10-Milliliter-Spritze wird in einer Klemme oder einem Halter unterstützt und ein vorgeschnittenes Stück Filterpapier hinzugefügt.
Zubereitete DEAE-Zellulose wird bis zu acht oder neun Millilitern in die Spritze gegossen. Die Säule wird mit dem Elutionspuffer gewaschen. Zwei Milliliter infiziertes Blut werden sorgfältig auf die Säule gelegt und Trypanosomen werden in der Kolonne in einem 50 Milliliter Zentrifugationsrohr gesammelt.
Der Elutionspuffer wird regelmäßig entsprechend dem Transit von Trypanosomen hinzugefügt. Der Transit der Trypanosomen durch die Säule wird überprüft, indem man in regelmäßigen Abständen einen Tropfen der Säuleneluate nimmt und Trypanosomen mittels Lichtmikroskopie beobachtet. Wenn Trypanosomen im Eluat nicht mehr beobachtet werden, wird das konische Rohr bei 1,800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Der Überstand wird entsorgt und Trypanosomen in der Palette werden mit einem Hämozytometer gezählt. Gesammelte Trypanosomen werden anschließend in dem Medium verdünnt, das für die geplante Untersuchung erforderlich ist. Diese Methode, die passendste Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis, liefert gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.
Diese Studien wurden entwickelt, weil DEAE-Zellulose-gereinigte Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Wirten und insbesondere Nagetieren gewonnen werden können. Die Trypanosome-Lebensfähigkeit in Gegenwart pharmazeutischer Wirkstoffe wird durch mikroskopische Beobachtung beurteilt. Die Lebensfähigkeit von Parasiten ist mit der Beweglichkeit verbunden und kann daher mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher oder höherer Vergrößerung per Auge überprüft werden.
Die Lebensfähigkeit von Parasiten wird durch Messung des Prozentsatzes der motilen Formen bewertet. Verdünnungen von Testverbindungen werden in jeden Brunnen einer 96 Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt, während Kontrollbrunnen mock behandelt werden. Jede Konzentration wird in Dreifachausführung beurteilt.
Die Anzahl der lebensfähigen Parasiten für jede Verdünnung wird mit der Anzahl der Parasiten in Kontrollbrunnen verglichen. Die Wirkung von Pentamidin, einem Referenzmedikament, das in der humanafrikanischen Trypanosomiasis-Therapie verwendet wird, wird in dieser Abbildung dargestellt. Trypanosome Makrophagen-Kokulturen ermöglichen die Untersuchung der Wirtparasiten-Interaktion auf zellulärer Ebene.
In Makrophagenparasiten-Kokulturen induzieren extrazelluläre Trypanosomen die Produktion von Makrophagenarginase, die Arginin zu Ornithin hydrolysieren. Ornithin ist der Vorläufer von Polyamen und Trypanothion, essentiell für das Überleben und Wachstum von Parasiten. Darüber hinaus verringert Arginin-Erschöpfung die Produktion von Trypanocidal-Stickstoffmonoxid.
In der Folge reduziert die Zugabe eines Arginase-Inhibitors, S-L-Cystein zu Kokulturen dramatisch das Makrophagen-induzierte Parasitenwachstum. Arginase Induktion wird durch Trypanosome ausgeschieden und oder sezerniert Faktoren vermittelt. Dieser Arginase-induzierende Faktor wurde als Orthin-Kinesin identifiziert.
Die Kinesin bindet an C-Typ Lektin-Mannose-Bindungsrezeptoren. Arginase wird induziert und produziert Ornithin, das Das Parasitenwachstum begünstigt. Arginase wird nicht durch Kinesin in Makrophagen mit 12,5 Millimolar Mannose oder in Makrophagen von Mäusen, wo die Makrophagen-Mannose-Rezeptoren gelöscht wurden, induziert.
Weitere Beispiele für Zellbiologie und biochemische Experimente mit DAEA-Zellulose gereinigten Trypanosomen werden in Studien gezeigt, in denen neuartige Zytoskelettproteine wie BILBO1 identifiziert wurden. FÜR die Biogenese wichtiger Zytoskelettstrukturen und das Überleben von Parasiten ist BILBO1 erforderlich. Damit ist BILBO1 ein wichtiges Ziel für interventionelle Interventionen bei pathogenen Trypanosomen.
In dieser Abbildung ist ein Bild zu sehen, das die Immunofloureszenz-Kennzeichnung einer Blutkreislaufkulturform zeigt, trypanosoma brucei cell sondiert mit einem Anti-BILBO1-Antikörper. Zusätzlich wurden Glukose- und Threoninstoffwechsel mit DEAE-Zellulose-gereinigten Trypanosomen beschrieben und die an diesen Prozessen beteiligten Enzyme experimentell validiert. Eine schematische Darstellung des Glukose- und Threoninstoffwechsels in den blutdurchströmten Trypanosomen ist in dieser Abbildung dargestellt.
Die Reinigung afrikanischer Trypanosomen aus Blut durch Anionenaustauschen von DEAE-Zellulosesäulen mit jüngsten Verbesserungen bleibt der Goldstandard für den Trypanosomennachweis, nicht nur bei natürlichen Wirten mit geringen Parasitemien in endemischen Gebieten, sondern auch für den Bedarf an Parasiten in großer Zahl für experimentelle Untersuchungen. Untersuchungen haben die Identifizierung von Trypanosome-Molekülen ermöglicht, die eine wesentliche Rolle beim Überleben und Wachstum von Parasiten spielen. Identifizierte Ziele könnten die Grundlage für einen zukünftigen Impfstoff mit potenziellen Antigenen für Mensch und Tier in einem einen Gesundheitsansatz darstellen.
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Übersicht
Afrikanische Trypanosomen sind die Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis beim Menschen und bei Tieren, die durch die Tsetsefliege übertragen wird. Eine genaue Nachweisung dieser Parasiten im Blut ist entscheidend für Diagnose und Behandlung und erfordert Konzentrationsverfahren zur wirksamen Identifizierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Parasitologie
- Infektionskrankheiten
- Diagnostische Methoden
Hintergrund
- Die afrikanische Trypanosomiasis, auch als Schlafkrankheit bekannt, ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem in Afrika südlich der Sahara.
- Serologische Tests können falsch positive und falsch negative Ergebnisse liefern, was die Diagnose erschwert.
- Die Konzentration von Trypanosomen im Blut ist entscheidend für eine genaue Detektion.
- Es existieren verschiedene Methoden zur Anreicherung dieser Parasiten.
Zweck der Studie
- Verbesserung der diagnostischen Methoden zum Nachweis von afrikanischen Trypanosomen in Blutproben.
- Bereitstellung gereinigter Parasiten für weitere biologische und medizinische Forschung.
- Vertiefung des Verständnisses von Trypanosomiasis und deren Auswirkungen auf die Gesundheit.
Verwendete Methoden
- Nutzung einer Anionenaustauschersäule zur Trennung von Trypanosomen basierend auf ihrer Oberflächenladung.
- Anwendung von Anreicherungstechniken zur Erleichterung des Nachweises von Parasiten.
- Beurteilung der Wirksamkeit der Methode hinsichtlich der Bereitstellung gereinigter Proben.
- Beurteilung der Eignung der Methode für verschiedene biologische Untersuchungen.
Hauptergebnisse
- Die Anionenaustauschersäule trennt Trypanosomen effektiv von Säugerblutzellen.
- Diese Methode liefert gereinigte Parasiten, die für immunologische und biochemische Untersuchungen geeignet sind.
- Die Ergebnisse deuten auf eine verbesserte Genauigkeit bei der Diagnose der afrikanischen Trypanosomiasis hin.
- Die Technik ist auf verschiedene Forschungsbereiche anwendbar, einschließlich der Molekularbiologie.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist ein zuverlässiges diagnostisches Werkzeug für die afrikanische Trypanosomiasis.
- Sie bietet eine Grundlage für weitere Forschungen zur Biologie der Trypanosomen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um die diagnostische Genauigkeit und therapeutische Strategien zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Detektion afrikanischer Trypanosomen im Blut ist entscheidend für die Diagnose und Behandlung der humanen afrikanischen Trypanosomiasis, insbesondere unter Feldbedingungen mit niedriger Parasitämie. Die DEAE-Cellulose-Anionenaustauschmethode bietet ein empfindliches und schnelles Aufreinigungsverfahren, das eine zuverlässige Isolierung von Parasiten für nachgeschaltete immunologische, biochemische und pharmazeutische Untersuchungen ermöglicht. Dies unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der Entdeckung von Antiparasitika, indem lebensfähige Parasiten für In-vitro-Screenings und Wirkmechanismus-Studien bereitgestellt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem gereinigte, lebensfähige Trypanosomen bereitgestellt werden, um die Wirkung von Wirkstoffen auf die Parasitenmotilität und -überlebensfähigkeit zu bewerten.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Ent风险minderung durch standardisierte Parasitenpräparation für konsistente In-vitro-Assays.
- Predictiver Wert: Erleichtert die Identifizierung von Leitverbindungen, indem eine quantitative Bewertung der Wirkstoffeffekte auf die Parasitenviabilität in Dosis-Wirkungs-Formaten ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, einschließlich der Wirkstoffprüfung in 96-Well-Plattenformaten mit dreifachen Bewertungen.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch konsistente Parasitenreinigung und Bestimmung der Vitalität mittels Beweglichkeit.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Produktion großer Parasitenmengen aus infizierten Wirten und unterstützt damit Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt krankheitsrelevante Systeme, indem die Parasiteninfektiosität erhalten bleibt und Ko-Kultur-Studien mit Wirtszellen ermöglicht werden, um Mechanismen wie die Arginase-Induktion in Makrophagen zu untersuchen.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke von der Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem Parasiten für Mechanismus-Studien bereitgestellt werden, die zytoskelettale Proteine (z. B. BILBO1) und Stoffwechselwege betreffen.
- Mechanistische Ent-Risikung: Ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen von Gen-Deletion, -Mutation oder -Überexpression auf das Überleben der Parasiten und stärkt dadurch das Vertrauen in potenzielle Zielstrukturen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein und ermöglicht die Bereitstellung von Parasiten für Assays, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem Parasiten bereitgestellt werden, um Wirt-Parasit-Interaktionen zu untersuchen, wie beispielsweise Arginase-vermittelte Überlebensmechanismen.
- Screening: Stellt Bereitstellung von standardisierten, reproduzierbaren und für Assays geeigneten Parasitenreinigungsverfahren sicher, die mit mikroskopischen Vitalitätsauslesungen kompatibel sind.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messungen abhängiger Variablen (z. B. Anteil beweglicher Parasiten), die Vergleiche über verschiedene Testsubstanzenverdünnungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch Untersuchungen zur Zytoskelettbildung und zu metabolischen Wegen, die für das Überleben der Parasiten essentiell sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Kapazität zur Erzeugung von Parasiten in mehreren Forschungskontexten, von der Immunologie bis zur Molekularbiologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch verminderte mechanistische Unklarheiten in den Überlebenswegen von Parasiten.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Parasitenversorgung für Multi-Assay-Plattformen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen antiparasitärer Programme.
- Portfolio-Impact: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf zuverlässigen präklinischen Wirksamkeitsdaten.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in Parasitologie und Säulenchromatographie für die korrekte Aufbereitung der DEAE-Zellulose und die Einstellung des pH-Werts.
- Beruht auf Instrumentierung wie Zentrifugen, Blutzählkammern und Lichtmikroskopen zur Sammlung der Parasiten und Beurteilung ihrer Vitalität.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams bei der Pufferherstellung, den Elutionsprotokollen und Infektionsmodellen, um Konsistenz zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungen an verschiedene Wirtsspezies und Trypanosomen-Stämme, da die Chromatographie-Bedingungen für jedes System optimiert werden müssen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit infizierter Wirte sowie die Notwendigkeit einer zeitnahen Probenaufbereitung, um die Vitalität der Parasiten zu erhalten.
