Name: Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Lernen Sie die Reinigung afrikanischer Trypanosomen aus Blut mittels Anionenaustauscher-Säulen für Diagnostik und Forschung. Diese Methode liefert gereinigte Parasiten für immunologische und biochemische Untersuchungen.

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Wir danken allen Mitgliedern der UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Diese Forschung wurde unterstützt durch die interne Finanzierung von Universität von Bordeaux und Unterstützung durch die ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, und von der Association pour le Développement De La recherche de Parasitologie et Médecine Tropicale und der Service de Coopération et d ' Action Culturelle de l'Ambassade de France À Bangui (Centrafrique).

Untersuchungen gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikation Nr. 85±23, revidiert 1996). Protokolle wurden von unseren lokalen Ethikkommission genehmigt.
(1) Tiere
<ol><li>Halten Sie weibliche Schweizer (von 1) Mäuse im Alter von acht bis zehn Wochen alt, 20-25 g, bei einem Tier Gehäuse Anlage 15 Tage vor jedem Experiment. Beherbergen sie in belüfteten Boxen, die in einem geschützten, Temperatur (22 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %) gehalten werden Zimmer mit 12 Stunden ein-/Licht-Zyklus gesteuert.</li>
	<li>Den Tieren freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser. Minimieren Sie Schmerzen, leiden und Ängsten und bieten Sie Bereicherung der Umgebung.</li>
	<li>Verwenden Sie für den Wohnungsbau, klar einwandig Käfige, Anreicherung mit Holzstäbchen und Karton Tunnel. Zeichnen Sie ein Tier sanft in einen Tunnel auf der Handfläche der Hand aus dem Käfig zu übertragen.</li>
	<li>Überwachen Sie täglich um Anzeichen von Erschöpfung, soziale Isolation, Körper Verletzung, zerzauste Haare, oder Mangel an Pflege zu beurteilen.</li>
	<li>Wiegen Sie jedes Tier einmal pro Woche. Führen Sie regelmäßige Inspektionen durch einen Tierarzt.</li>
	<li>Für natürliche Parasiten sammeln Sie Blut auf dem Höhepunkt des Parasitemia und für Parasiten verursacht tierischen Tod, sammeln Sie Blut am Vortag vermuteten Tod. Hinweis: Alle Experimente mit Infektionserregern sind in speziellen Räumen nach Universität genehmigten Richtlinien durchgeführt.</li>
</ol>2. Puffer, Medien-Vorbereitungen
<ol><li>Wiegen Sie jedes Stoffes und fügen Sie destilliertes Wasser für die folgenden Puffer:<ol>
<li>Konzentrierte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung vorbereiten (2 X): Na2HPO4 (wasserfrei) (MW 141,96 g) 10,14 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g H2O, 1 L destilliertem</li>
		<li>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Glukose vorbereiten: Na2HPO4 (wasserfrei) (MW 141,96 g) 5,39 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g Glukose (MW 180 g) 10 g H2O, 1 L destilliertem</li>
		<li>1 M KH2PO4vorbereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie Elution Buffer: Ergänzen Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Glucose mit Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Phenol-rot (5 µg/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der DEAE-cellulose
<ol><li>Planen Sie ca. 5 Stunden für die DEAE-Zellulose-Vorbereitung.</li>
	<li>100 g DEAE-Zellulose mit destilliertem Wasser in eine Flasche mit einem schmalen Hals waschen und lassen zu begleichen, dann Feinstaub zu verwerfen. Wiederholen Sie wäscht, bis der Überstand klar ist.</li>
	<li>3 L konzentrierter 2 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung und rühren hinzufügen.</li>
	<li>PH bis 8.0 mit 1 M KH2PO4 anpassen und überstand verwerfen.</li>
	<li>Zweimal mit destilliertem Wasser zu waschen und um zu begleichen lassen.</li>
	<li>Waschen und zweimal mit 3 Liter Phosphate-Buffered Kochsalzlösung-Glukose zu begleichen und verwerfen die Überstände lassen.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der Cellulose und fügen Sie ein gleiches Volumen des Phosphate-Buffered Kochsalzlösung-Glucose, in Kunststoff-Flaschen verteilen und Lagerung bei-20 ° C.</li>
</ol>(4) Parasiten
<ol><li>Trypanosomen Stämme in Gebieten endemisch für Mensch und Tier Trypanosomiasis zu sammeln. Halten Sie Parasiten in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hinweis: Trypanosomen Musculi ist für den Menschen apathogen und eine extrazelluläre Trypanosomen sicher Pathogene Trypanosomen in verschiedenen Laborversuchen ersetzt.</li>
	<li>Bei Laboruntersuchungen erfordert menschliche Krankheitserreger Experimente mit Sorgfalt gewidmet entsprechende Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL) und Vorsichtsmaßnahmen zu behandeln; BSL2 für T. B. rhodesiense und BSL3 für T. B. Rhodesiense. Unter Feldbedingungen, mikrobiologische Standardpraxis etabliert: Sampling, mechanische pipettieren, häufige Dekontamination von Oberflächen und Sterilisation von Abfällen zu sichern.</li>
</ol>(5) Maus-Infektion
<ol><li>Tauen Sie schnell Parasiten in einem Wasserbad bei 37 ° C auf.</li>
	<li>Einen Tropfen von aufgetauten infiziertem Blut mit einem Mikroskop zu beobachten. Bewerten Sie Parasiten Lebensfähigkeit durch Messung der Anteil der bewegliche Formen17.</li>
	<li>Injizieren Sie Parasiten intraperitoneal in Mäusen (0,5 mL pro Maus). Jeden Tag nach der Infektion, sammeln Sie 20 µL Blut Schweif durch Punktion und unter dem Mikroskop beobachten. Parasitemia nach Herbert und Lumsden18 durch Parasiten in mehreren Mikroskop zählen oder mithilfe einer Zählkammern zu bewerten.</li>
	<li>Wenn die Parasitemia einen Schwellenwert, der für jede Belastung definiert ist überschreitet, sammeln Sie das Blut (1 mL/Maus) in der Elution Puffer (5 mL/Maus) mit Heparin (10 U/mL). Hinweis: Die originelle und neuartige Arbeit Lanham und Godfrey berichtet, dass die optimale Ionenstärke des Phosphats saline Glukose für mehrere Parasit/Arten von pH 8,0-Stammlösung gepuffert.</li>
</ol>(6) Parasit Trennung
Hinweis: Alle Versuche ab diesem Zeitpunkt müssen in einer Gewebekultur Kapuze mit Handschuhen durchgeführt werden. Die Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit in den Labors verwendet wurden 22 ° C und 45 %. Unter Feldbedingungen hat Parasiten Trennung erfolgreich bei 34 ° c durchgeführt
<ol><li>Eine 10 mL Spritze in eine vertikale Unterstützung geben Sie und eine zuvor ausgeschnittene Rundschreiben, Stück Filterpapier, Glaswolle oder Zelluloseschwamm.</li>
	<li>Gießen Sie die DEAE Cellulose in die Spritze, bis 8 mL Niveau erreicht ist, und dann waschen mit 25 mL Elution Puffer.</li>
	<li>Vorsichtig 2 mL verdünnte Blut am oberen Rand der Spalte und anschließend fügen Sie Elution Medium hinzu. Fügen Sie regelmäßig Elution Puffer entsprechend den Transit von der Trypanosomen.</li>
	<li>Sammeln Sie Abwasser Tropfen aus den Spalten in ein Zentrifugenröhrchen und prüfen Sie regelmäßig auf das Vorhandensein von Parasiten mit einem Mikroskop.</li>
	<li>Wenn Parasiten in der Spalte Abwasser nicht mehr erkannt werden, Zentrifugieren Sie das Rohr (1.800 X g, 10 Minuten, bei 4 ° C im Labor und bei Raumtemperatur unter Feldbedingungen).</li>
	<li>Entfernen des Überstands und die Parasiten in 1 mL des entsprechenden Mediums erforderlich für investigative als nächstes aussetzen.</li>
	<li>Zählen Sie Parasiten mit einer Hemocytometer zu und verdünnen sie in geeigneter Form zu, wenn nötig.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
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<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
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<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Gereinigte Trypanosomen sind ein mächtiges Mittel, Immunologie, Biochemie, zelluläre und molekulare Biologie zu studieren. Große Flächen von Daten und Ergebnissen erhielten von Trypanosomen, die hat dann dazu beigetragen, andere eukaryotische Zellen30Informationen einzuholen. Trypanosomen sind auch Gegenstand der Forschung wichtig und interessant, weil sie zahlreiche Mechanismen, die ihnen ermöglichen entwickelt haben, zu überleben und wachsen in zwei sehr unterschiedlichen Umgebungen: die Tsetse-...

Die vorgestellte Methode beschrieben hier ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), aus Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem ermöglicht dieser Parasit Reinigungsverfahren robuste serologische und Forschung Untersuchung.
Hut, verursacht durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense und T. B. Rhodesiense1. Diese Protozoen Parasiten vermehren extrazellulär in Blut, Lymphe und interstitiellen Flüssigkeiten in der ersten Phase der Erkrankung (hemolymphatic Stadium). Die zweite Stufe (meningoencephalitic Stadium) beginnt, wenn die Parasiten die Blut-Hirn-Schranke überqueren; neurologische Symptome, einschließlich einer Schlafstörung, die seinen Namen "Schlafkrankheit" dieser Krankheit gegeben hat, sind typisch für diese zweite Stufe2. Damit verbundenen Trypanosomen (T. Evansi, T. Congolense, T. Vivax, T. B. Trypanosomen) sind die Erreger der afrikanischen Trypanosomosen (AAT)3Tier.
Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zielt darauf ab, Hut als Problem der öffentlichen Gesundheit bis zum Jahr 2020 zu beseitigen und Übertragung von 20304zu stoppen. Die kürzlich erfolgten Einführung der raschen Diagnosetests hat verbesserte serologische Diagnostik1,4,5. Wurden mehrere molekulare Diagnostik entwickelt, aber ihre Rolle im Bereich Diagnostik wurde noch nicht etablierten5. Sie werden verwendet, um die Unterarten der Trypanosomen -Gruppe und atypische Trypanosomiasis verursacht durch Parasiten verantwortlich für tierische Trypanosomosen6zu identifizieren.
Die Erkennung des Parasiten ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge, da Serologie falsch positive und leider falsch-negative Ergebnisse1geben kann. Die direkte mikroskopische Beobachtung von diesen Hemoflagellate Protisten ist schwierig in Hut-Fällen, die von T. B. rhodesiense, (mehr als 95 % der Fälle) verursacht werden können, wie niedrige Parasitemias die Regel sind, während T. B. Rhodesiense, einen großen Hut durch Anzahl der Parasiten sind häufig im Blut vorhanden. Verschiedene Techniken der Konzentration verwendet worden sind, wie dicke Tropfen und Kapillarrohr Zentrifugation (CTC), aber die Trennung der Parasiten von Blut durch eine Spalte der Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) gefolgt von Zentrifugation und mikroskopische Beobachtung von der Pellet, ist die empfindlichste Methode (rund 50 Parasiten/mL Blut nachweisbar)1,7. Folglich ist die Reinigung der Trypanosomen Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) dadurch das beste und bis heute ist die Referenzmethode zur Visualisierung und Parasiten aus Blut für Hut-Diagnose zu isolieren. Unter Feldbedingungen eine Mini-Spalte der DEAE Cellulose erfolgreich eingesetzt und mehrere Verbesserungen konnten mikroskopischen Beobachtung7,8.
Die Methode der Trypanosomen Trennung von Blut, wie unten beschrieben, hängt Parasit Oberflächenladung, die weniger negativ als Blut Säugerzellen9ist. Interessanterweise ist diese Methode entwickelte sich vor 50 Jahren, im Jahr 1968 von Dr. Sheila Lanham, und bleibt der Goldstandard für Erkennung und Vorbereitung der Trypanosomen Blutbahn. Es ist schnell und reproduzierbar für Salivarian Trypanosomen aus einer Vielzahl von Säugetieren, erlaubt die Diagnose sowohl tierische und menschliche Trypanosomiasis10.
Um lebendige, gereinigten Parasiten zu erhalten, wird infiziertes Blut auf ein Anion-Exchanger-Spalte hinzugefügt. Chromatographie-Bedingungen (vor allem pH-Wert, Ionenstärke der Puffer/Medien) müssen für die einzelnen Trypanosomen-Arten, und ganz allgemein für jede Mischung von Säugerzellen Blut und Trypanosomen10angepasst werden. Elution Buffer ist genau auf pH 8 für die meisten afrikanischen Trypanosomen10eingestellt. Diese Methode begünstigt die Konzentration der Parasiten im Blut von Patienten gefunden, weil Parasitemias zu niedrig, um durch mikroskopische Beobachtung allein erkannt werden können, und es ermöglicht auch Laboruntersuchungen. Arbeiten mit frisch isolierte Trypanosomen und auf das Blut von infizierten Tieren, die mit dieser Technik ist mehr relevant für die verschiedenen Untersuchungen als Studien mit Parasiten, die in axenic Bedingungen im Labor auf unbestimmte Zeit kultiviert wurde.
Wirt-Parasit-Beziehungen sind am besten untersucht mit einem Parasiten infiziert seinen natürlichen Wirt, daher T. Musculi, einen natürlichen murinen Parasiten, die Vertreter der extrazellulären Trypanosomen, hat viele Vorteile, wie in murinen Infektion beinhaltet eine kleinen Versuchstier und erfordert keine Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL). T. Musculi tötet nicht immunkompetenten Mäusen, im Gegensatz zu vielen anderen Trypanosomen -Arten, einschließlich menschliche Krankheitserreger. T. Musculi entfallen nicht in T-Zell-beraubt Mäuse und Parasitemias kann bei infizierten Mäusen erhöht werden, indem Sie Nahrung und Nährstoff-Aufnahme11ändern. Dieser Parasit moduliert die Immunantwort bei Co-Infektionen mit anderen Krankheitserregern12. T. Musculi von infizierten Mäusen Ausstellung Unterschiede von kultivierten T. Musculi, z. B. der Ausdruck von Membranrezeptoren Fc T. Musculi axenic Kulturen, im Vergleich zu Parasiten gereinigt von infizierten Mäusen13 verliert , 14. Excreted abgesondert Faktoren (ESF) sind auch qualitativ und quantitativ weniger in axenic Trypanosomen Kulturen zum Ausdruck gebracht und unterscheiden sich zwischen den Stämmen in endemischen Gebieten15isoliert. ESF sind die ersten Antigene auf das Immunsystem des Wirts angezeigt werden und so eine wichtige Rolle in der ursprünglichen Host Immunantwort16.
Bei experimentell infizierten Tieren für Laboruntersuchungen erleichtert dieses Protokolls Experimente an einer größeren Anzahl von Parasiten, die Minimierung von Mäusen erforderlich, insbesondere bei Verwendung von immunsupprimierten Tieren. Die Variante Oberfläche Glykoproteine (VSGs), die in der Karte Agglutination Test für Trypanosomiasis (CATT) in Massen-Screening verwendet werden sind noch gereinigt von Trypanosomen, die bei Ratten übertragen werden. Die zwei diagnostische Schnelltests (einzeln verpackte Kassetten), die jetzt verfügbar sind für den Einsatz im Feld, sind immer noch mit einer infektiösen Modell Quelle der native VSGs und nicht in Vitro kultiviert Trypanosomen1,4, 5. der Fortschritt in der Studie der Trypanosomen Immunologie und Biologie wurde erleichtert, da diese DEAE Zellulose gereinigt Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Hosts und in bestimmten, Nagetiere erzielt werden können.

<table><tbody><tr><td>10 mL Pipetten&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>357,551</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipetten&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugationsröhrchen 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE Zellulose</td><td>Santa Cruz s</td><td>/c- 211213</td><td>100 G</td></tr><tr><td>Filterpapier&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>Flachkolben mit engem Hals</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 mL</td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopdeckgläser</td><td>Thermofisher wissenschaftliche</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermofisher wissenschaftliche</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Nalgene Kunststoff Medien Flaschen Größe 125 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Kunststoff Medien Flaschen Größe 500 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin 10.000 UI/Streptomycin 10.000 &micro; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Spritze&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Institut für Tropenmedizin (Antwerpen, Belgien).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Institut für Tropenmedizin (Antwerpen, Belgien).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

reinigung der extrazellulären trypanosomen, einschließlich afrika, aus blut von anionen-austauscher (diethylaminoethyl-zellulose spalten)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Diese Methode ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), von infiziertem Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem dieser Parasit Reinigungsverfahren ermöglicht serologische und Forschung Untersuchungen.
Hut wird durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense verursacht und T. B. Rhodesiense. Damit verbundenen Trypanosomen sind die Erreger der Tier Trypanosomiasis. Trypanosomen-Erkennung ist essentiell für Hut-Diagnose, Behandlung und Nachsorge. Die hier beschriebene Technik ist die empfindlichste Parasit Erkennung Technik, angepasst auf Freilandbedingungen für die Diagnose von T. B. rhodesiense Hut und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Blut wird auf ein Anion-Exchanger Säule (DEAE Zellulose) vorher eingestellten pH-Wert 8 geschichtet und Elution Puffer hinzugefügt. Stark negativ geladenen Blutzellen werden auf die Säule adsorbiert, während die weniger negativ geladenen Trypanosomen durchlaufen. Gesammelten Trypanosomen sind pelleted durch Zentrifugation und beobachtet von Mikroskopie. Darüber hinaus sind Parasiten ohne Zellschädigung bereit, unter Beibehaltung ihrer Infektiosität.
Gereinigte Trypanosomen sind erforderlich für immunologische Tests; Sie sind in der Trypanolysis-Assay, der Goldstandard in der Hut Serologie eingesetzt. Gefärbte Parasiten sind in der Karte Agglutination Test (CATT) für Feld Serologie genutzt. Antigene von gereinigten Trypanosomen wie Variante Oberfläche Glykoprotein, Exoantigens, sind auch in verschiedenen Immunassays verwendet. Die hier beschriebene Vorgehensweise richtet sich an afrikanischen Trypanosomen; Infolgedessen haben Chromatographie Bedingungen zu jeder Trypanosomen-Stamm, und ganz allgemein an das Blut der einzelnen Arten der Host Säugetier angepasst werden.
Diese faszinierenden Krankheitserreger sind leicht gereinigt und zur Verfügung in biochemische, molekulare und Zelle Biologie Studien einschließlich Kokultur mit Wirtszellen zu untersuchen, Wirt-Parasit-Beziehungen auf der Ebene der Membranrezeptoren, Signal- und gen Ausdruck; Drogen Sie-Tests in Vitro; Untersuchung von gen-Löschung, Mutation oder Überexpression auf metabolische Prozesse, Zellskelett Biogenese und Parasiten überleben.

Gereinigte Trypanosomen wurden in Arzneimitteltests verwendet. Parasiten sind in Kultur Brunnen mit Verdünnungsreihen von bestimmten Medikamenten, entweder allein oder gemischt19übertragen. Mikroskopische Beobachtungen auswerten Motilität ist ein Marker der Lebensfähigkeit, kann durchgeführt werden, wenn nur ein paar Enten getestet werden, während AlamarBlue Zelle Lebensfähigkeit Assay ist eine hervorragende Methode für große Beweglichkeit Assays während Drogen-scr...

Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikanische Trypanosomen sind verantwortlich für menschliche afrikanische Trypanosomiasis, oder Schlafkrankheit und tierische afrikanische Trypanosomiasis. Die Trypanosomen, die Schlafkrankheit verursachen, sind tsetse fliegen übertragene protistische Parasiten, die in vielen geographischen Brennpunkten in Subsahara-Afrika vorhanden sind. Der Nachweis des Parasiten ist für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge unerlässlich.Eine Serologie kann falsche positive und leider falsche negative Ergebnisse liefern. Um die Erkennung im Blut zu unterstützen, müssen Trypanosomen konzentriert werden. Es wurden verschiedene Techniken zur Parasitenkonzentration eingesetzt.Die empfindlichste Methode ist die Trennung von Parasiten vom Blut durch eine Säule von Anionenaustauscher, DEAE-Zellulose gefolgt von Zentrifugation und mikroskopischer Beobachtung. Folglich ist die DEAE-Zellulose-Methode die beste und bleibt bis heute, die Referenzmethode zur Visualisierung und Isolierung von Parasiten aus dem Blut für die menschliche afrikanische Trypanosomiasis-Diagnose, insbesondere unter Felderkrankungen. Diese Methode, die am besten geeignete Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis bietet auch gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.Alle Untersuchungen, die dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren entsprechen, und die Zustimmung wurde von den französischen Behörden eingeholt, und alle verwendeten Protokolle wurden von unserer lokalen Ethikkommission genehmigt. Wägen Sie jede Substanz nach dem schriftlichen Protokoll ab. Destilliertes Wasser hinzufügen und sich mit Kaliumdihydrogenphosphat präzise an pH8 anpassen, um die folgenden gepufferten Lösungen, konzentrierte Phosphatpuffersalze 2X, herzustellen.Destilliertes Wasser und Glukose für phosphatgepufferte Salzglukose hinzufügen. Für 100 Milliliter Elutionspuffer 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin und fünf Mikrogramm Milliliter Phenolrot zu Phosphat gepufferter Kochstoffglukose hinzufügen. 100 Gramm DEAE-Zellulose werden zunächst mit drei Litern destilliertem Wasser gewaschen und dann abgelassen.Feine Partikel werden entsorgt. Die Wasswerden werden wiederholt, bis der Überstand klar ist. Konzentrierte Phosphatgepufferte Saline 2X wird zugegeben und die DEAE-Zellulose gerührt.Der pH-Wert wird mit einem Molkaliumphosphat auf acht eingestellt. Die Zellulose wird dann zweimal mit destilliertem Wasser und zweimal mit Phosphat gepufferter Salzglukose gewaschen. Die DEAE-Zellulose und Phosphat gepufferte Saline-Glukose werden in gleichen Mengen gemischt.Legierung geviertelt und gelagert bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius oder bei minus 20 Grad Celsius für längere Lagerung. Trypanosome infiziertes Blut wird in flüssigem Stickstoff gespeichert. Ein Legierungsquart von einem Milliliter wird bei Raumtemperatur aufgetaut.Parasiten werden sorgfältig aus dem Kryotube mit einer Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze gesammelt. Die Lebensfähigkeit aufgetauter Parasiten wird durch die Beweglichkeit beurteilt, die durch Lichtmikroskopie-Beobachtung vor der Infektion visualisiert wird. Parasiten werden in die Peritonealhöhlen von zwei Mäusen injiziert, 500 Mikroliter pro Maus.Jeden Tag nach der Infektion wird die Parasitenämie durch Das Sammeln eines Tropfens Blut aus dem Schwanz mit einer Nadel bewertet und durch Mikroskopie überprüft. Wenn die Parasitenaufe auf einem geeigneten Niveau ist, wird infiziertes Blut gesammelt. Eine 10-Milliliter-Spritze wird in einer Klemme oder einem Halter unterstützt und ein vorgeschnittenes Stück Filterpapier hinzugefügt.Zubereitete DEAE-Zellulose wird bis zu acht oder neun Millilitern in die Spritze gegossen. Die Säule wird mit dem Elutionspuffer gewaschen. Zwei Milliliter infiziertes Blut werden sorgfältig auf die Säule gelegt und Trypanosomen werden in der Kolonne in einem 50 Milliliter Zentrifugationsrohr gesammelt.Der Elutionspuffer wird regelmäßig entsprechend dem Transit von Trypanosomen hinzugefügt. Der Transit der Trypanosomen durch die Säule wird überprüft, indem man in regelmäßigen Abständen einen Tropfen der Säuleneluate nimmt und Trypanosomen mittels Lichtmikroskopie beobachtet. Wenn Trypanosomen im Eluat nicht mehr beobachtet werden, wird das konische Rohr bei 1,800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Der Überstand wird entsorgt und Trypanosomen in der Palette werden mit einem Hämozytometer gezählt. Gesammelte Trypanosomen werden anschließend in dem Medium verdünnt, das für die geplante Untersuchung erforderlich ist. Diese Methode, die passendste Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis, liefert gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.Diese Studien wurden entwickelt, weil DEAE-Zellulose-gereinigte Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Wirten und insbesondere Nagetieren gewonnen werden können. Die Trypanosome-Lebensfähigkeit in Gegenwart pharmazeutischer Wirkstoffe wird durch mikroskopische Beobachtung beurteilt. Die Lebensfähigkeit von Parasiten ist mit der Beweglichkeit verbunden und kann daher mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher oder höherer Vergrößerung per Auge überprüft werden.Die Lebensfähigkeit von Parasiten wird durch Messung des Prozentsatzes der motilen Formen bewertet. Verdünnungen von Testverbindungen werden in jeden Brunnen einer 96 Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt, während Kontrollbrunnen mock behandelt werden. Jede Konzentration wird in Dreifachausführung beurteilt.Die Anzahl der lebensfähigen Parasiten für jede Verdünnung wird mit der Anzahl der Parasiten in Kontrollbrunnen verglichen. Die Wirkung von Pentamidin, einem Referenzmedikament, das in der humanafrikanischen Trypanosomiasis-Therapie verwendet wird, wird in dieser Abbildung dargestellt. Trypanosome Makrophagen-Kokulturen ermöglichen die Untersuchung der Wirtparasiten-Interaktion auf zellulärer Ebene.In Makrophagenparasiten-Kokulturen induzieren extrazelluläre Trypanosomen die Produktion von Makrophagenarginase, die Arginin zu Ornithin hydrolysieren. Ornithin ist der Vorläufer von Polyamen und Trypanothion, essentiell für das Überleben und Wachstum von Parasiten. Darüber hinaus verringert Arginin-Erschöpfung die Produktion von Trypanocidal-Stickstoffmonoxid.In der Folge reduziert die Zugabe eines Arginase-Inhibitors, S-L-Cystein zu Kokulturen dramatisch das Makrophagen-induzierte Parasitenwachstum. Arginase Induktion wird durch Trypanosome ausgeschieden und oder sezerniert Faktoren vermittelt. Dieser Arginase-induzierende Faktor wurde als Orthin-Kinesin identifiziert.Die Kinesin bindet an C-Typ Lektin-Mannose-Bindungsrezeptoren. Arginase wird induziert und produziert Ornithin, das Das Parasitenwachstum begünstigt. Arginase wird nicht durch Kinesin in Makrophagen mit 12,5 Millimolar Mannose oder in Makrophagen von Mäusen, wo die Makrophagen-Mannose-Rezeptoren gelöscht wurden, induziert.Weitere Beispiele für Zellbiologie und biochemische Experimente mit DAEA-Zellulose gereinigten Trypanosomen werden in Studien gezeigt, in denen neuartige Zytoskelettproteine wie BILBO1 identifiziert wurden. FÜR die Biogenese wichtiger Zytoskelettstrukturen und das Überleben von Parasiten ist BILBO1 erforderlich. Damit ist BILBO1 ein wichtiges Ziel für interventionelle Interventionen bei pathogenen Trypanosomen.In dieser Abbildung ist ein Bild zu sehen, das die Immunofloureszenz-Kennzeichnung einer Blutkreislaufkulturform zeigt, trypanosoma brucei cell sondiert mit einem Anti-BILBO1-Antikörper. Zusätzlich wurden Glukose- und Threoninstoffwechsel mit DEAE-Zellulose-gereinigten Trypanosomen beschrieben und die an diesen Prozessen beteiligten Enzyme experimentell validiert. Eine schematische Darstellung des Glukose- und Threoninstoffwechsels in den blutdurchströmten Trypanosomen ist in dieser Abbildung dargestellt.Die Reinigung afrikanischer Trypanosomen aus Blut durch Anionenaustauschen von DEAE-Zellulosesäulen mit jüngsten Verbesserungen bleibt der Goldstandard für den Trypanosomennachweis, nicht nur bei natürlichen Wirten mit geringen Parasitemien in endemischen Gebieten, sondern auch für den Bedarf an Parasiten in großer Zahl für experimentelle Untersuchungen. Untersuchungen haben die Identifizierung von Trypanosome-Molekülen ermöglicht, die eine wesentliche Rolle beim Überleben und Wachstum von Parasiten spielen. Identifizierte Ziele könnten die Grundlage für einen zukünftigen Impfstoff mit potenziellen Antigenen für Mensch und Tier in einem einen Gesundheitsansatz darstellen.

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Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten) (Video) | JoVE Journal

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

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