Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

Mein Labor hat die Rolle des Hippo-Signalwegs bei Brust- und Lungenkrebs untersucht, und vor kurzem haben wir einen neuartigen Biosensor entwickelt, um die Hippo-Signalaktivität zu überwachen. Diese Methode kann verwendet werden, um wichtige Fragen über zelluläre Signalnetze zu beantworten, wie der Hippo-Signalweg auf Faktoren reagiert und wie er mit anderen Signalwegen interagiert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist ihre große Empfindlichkeit und auch die große Anzahl der Proben kann schnell und gleichzeitig verarbeitet werden.

Diese Technik hat vielfältige Anwendungen in der Grundlagen- und Translationsforschung, um Regulatoren des Hippo-Signalwegs sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen. Zu Beginn, Mini-Prep LATS-BS Plasmide frisch aus DH5-Alpha Bakterien flüssige Kultur. Eine Stunde vor der Transfektion, aspirieren Sie das Medium von der Platte, und fügen Sie 500 Mikroliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen.

Ein wichtiger Punkt ist, dass der LATS-Biosensor frisch zubereitet werden muss, um maximale Expression und Aktivität zu erhalten. Auch, Es wird empfohlen, immer einen vorgelagerten Regler des Hippo-Signalweg, wie MSD, als positive Kontrolle bei der Durchführung von Luziferase-Assay verwenden. Danach kehren Sie die Zellen in den Inkubator zurück.

Als Nächstes bereiten Sie Lösung A, eine DNA-Lösung, und Lösung B, ein verdünntes polymerbasiertes Transfektionsreagenz, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie danach sofort Lösung B zu Lösung A hinzu und pipette nach oben und unten sanft nach oben und unten, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 Minuten, damit sich die Transfektionskomplexe bilden können.

Dann fügen Sie das Gesamtvolumen der Transfektionskomplexe tropfenweise zu jedem Brunnen der Platte mit sanftem Wirbeln hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die komplexhaltigen Transfektionsmedien und ersetzen Sie sie durch frische serfüllende Medien.

Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für einen weiteren Tag. Eine entsprechende Menge von 5x Passivlysepuffer mit destilliertem Wasser verdünnen. Dann, vollständig aspirieren die Medien von der Platte.

Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter PBS hinzu und wirbeln Sie die Platte sanft, um abgetrennte Zellen und Restwachstumsmedien zu entfernen. Dann aspirieren Sie die PBS vollständig. Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter 1xPLB zu jedem Brunnen hinzu.

Stellen Sie die Kulturplatte für 15 Minuten auf eine Schaukelplattform, um eine gleichmäßige Abdeckung der Zellmonolayer mit PLB zu gewährleisten. Danach das Lysat in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Entfernen Sie den LAR-2 aus 80 Grad Celsius Lagerung, und gleicht es auf Raumtemperatur aus.

Bereiten Sie dann Dasrenilla-Detektionsreagenz für eine angemessene Menge an Assays vor. Fügen Sie das Renilla-Detektionsreagenz auf 50x Substrat und seinen Puffer ein. Als nächstes 10 Mikroliter jeder Zelle lysieren in 1,5 Milliliter-Röhren.

Programmieren Sie dann ein Luminometer, um eine zwei Sekunden vordermessene Verzögerung durchzuführen, gefolgt von einem 10-Sekunden-Messzeitraum. Sorgfältig 20 Mikroliter LAR-2-Reagenz in ein Rohr geben und schnell nach oben und unten pipette nach oben und unten geben, um sie zu mischen. Dann legen Sie das Rohr sofort in das Luminometer und initiieren Sie die Messung.

Nach dem Lesen das Probenröhrchen aus dem Luminometer entfernen, 20 Mikroliter Renilla-Reagenz hinzufügen und Pipette nach oben und unten geben, um es zu mischen. Legen Sie dann die Probe in das Luminometer und starten Sie die nächste Lesung. Zuerst Kultur, Trennen, Zählen und Plattieren von HEK293-Anzeigenzellen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Dann, eine Stunde vor der Transfektion, saugen Sie die Medien von der Platte und ersetzen Sie sie durch fünf Milliliter frische komplette Wachstumsmedien. Fügen Sie schließlich die verdünnte Lösung B zu Lösung A und die Pipette nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen. Dann inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 Minuten, bevor Sie das Gesamtvolumen der Transfektionskomplexe auf die Platte legen, während sie sanft wirbeln.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Versuchen Sie am nächsten Tag, die Zellen zu testen und zu zählen. Platte 10 000 bis 20 000 Zellen in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte in einem Gesamtvolumen von 100 Mikroliter Medien pro Brunnen.

Danach die Zellen für einen weiteren Tag inkubieren. Ein bis vier Stunden vor der Durchführung der Luziferase Assay, fügen Sie Agenten potenziell regulierung der Hippo-Signalweg, bei einer endgültigen Konzentration von 10 Mikromolar pro Brunnen. Als nächstes aspirieren Sie die Medien vollständig aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in jedem Brunnen mit 100 Mikroliter PBS.

Dann fügen Sie 20 Mikroliter PLB zu jedem Brunnen hinzu. Stellen Sie die Kulturplatte für 15 Minuten auf eine Schaukelplattform. Dann 20 Mikroliter LAR-2 Reagenz auf jeden Brunnen der Platte übertragen, und Pipette nach oben und unten zu mischen.

Unmittelbar danach die Platte in ein Plattenlese-Leuchtkraftmesser geben und die Lesung einleiten. Im ersten Teil dieses Protokolls wurde das LATS-BS mit verschiedenen Genen kotransfiziert, um ihre Wirkung auf die LATS-Kinase-Aktivität zu bewerten. Im zweiten Protokoll wurde LATS-BS in HEK293-Ad transfiziert und die Zellen in 96-Well-Platten übergeben.

40 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit verschiedenen bekannten kleinen Molekülregulatoren der Hippo-Signalisierung behandelt, gefolgt von einem Luziferase-Assay. Bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Assays sollte beachtet werden, dass Proteine und medikamentöse Behandlungen Rückkopplungswege aktivieren können, die die Biosensoraktivität beeinflussen. Weitere Experimente werden notwendig sein, um eine Beziehung zwischen dem Kandidaten und dem Hippo-Signalweg zu bestätigen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie quantitative Real-Time PCR oder Western Blot verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur LATS-Kinase-Aktivität zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, um die Dynamik und Aktivität von LATS-Kinase und Hippo-Signalweg in vielen biologischen und biochemischen Prozessen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass Medikamente zum Screening extrem gefährlich sein können, und angemessene Vorsichtsmaßnahmen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.