Name: Sub-akute zerebrale Punktblutungen induziert durch Lipopolysaccharid-Injektion bei Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Lernen Sie die Induktion sub-akuter zerebraler Punktblutungen bei Sprague-Dawley-Ratten durch LPS-Injektion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung inflammatorischer Prozesse und der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.

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Wir danken Lehrer Jian Feng Lei und Kollegen aus Capital Medical University zur Orientierung während der MRT. Wir danken auch Jing Zeng von der Abteilung für Neurologie, das zweite Volk Krankenhaus von Yichang für technische Unterstützung.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) des PLA Armee General Hospital genehmigt.
(1) Materialien
<ol><li>Vorbereitung der LPS-Injektion<ol>
<li>25 mg LPS Pulver abgeleitet von S. Typhimurium , eine Endkonzentration von 1 mg/mL fügen Sie 25 mL destilliertem Wasser hinzu. Speichern Sie die Injektion in ein steriles Röhrchen bei 4 ° c Achtung: LPS ist giftig.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2 %-EB-Lösung in normalen 0,9 % Kochsalzlösung, EB-Injektion bei Arbeiten Konzentration zu halten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Tiere
<ol><li>LPS an männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten, im Alter von 10 Wochen verabreichen (durchschnittliches Gewicht: 280 ± 20 g) durch intraperitoneale Injektion. Achtung: Wenn Ratten von einem anderen Unternehmen gekauft werden, sollte dann die adaptive Phase nicht weniger als 7 Tage sein.</li>
</ol>(3) LPS-Injektionen
<ol><li>Injizieren Sie LPS intraperitoneal in jede Ratte in einer Dosis von 1 mg/kg, und zurückkehren Sie die Ratten zu ihrem Hause Käfig. Hinweis: Narkose ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Injizieren Sie sechs Stunden später, die gleiche Dosis von LPS-Injektion in den Ratten.</li>
	<li>16 Stunden später injizieren die gleiche Dosis von LPS in den Ratten. Achtung: Injektion von SD-Ratten mit LPS bei einer Dosis von 1 mg/kg eine 5 % Sterblichkeit führen. Die Sterblichkeit kann in jüngeren oder älteren Ratten oder schwangeren weiblichen Ratten weiter erhöhen.</li>
	<li>Kehren Sie die Ratten in ihren Käfigen nach LPS-Injektion und Ad Libitum Zugang zu essen und trinken. Hinweis: Ratten zeigen eine ausgeprägte systemische Entzündungsreaktion, und daher ist es wichtig, dass die Käfige während des Experiments sauber bleiben. Ratten sollten häufig (2 X Tag) Gewicht, Allgemeines Erscheinungsbild und Verhalten nach der ersten Injektion LPS überwachen. Wenn die Ratten beginnen, zeigen ein Buckliger Haltung, mangelnde Bereitschaft zu bewegen, erheblichen Gewichtsverlust (> 20 %), vor der 7-tägigen EB Studie Endpunkt eingeschläfert Porphyrin Färbung, die sie menschlich zu sein.</li>
</ol>(4) die Probenahme
<ol><li>EB-Injektion<ol>
<li>Betäuben Sie sieben Tage nach der ersten Injektion, die Ratte durch intraperitoneale nach Ihren genehmigten IACUC Protokoll.</li>
		<li>Warten Sie 1 – 2 min., bis die Ratten nicht Hornhaut Reflexe Reaktionen zeigen. Führen Sie eine 5 – 8 mm-Tiefe Herzpunktion auf jede Ratte; die Punktion sollte 5 mm am linken Rand des Brustbeins am 3. und 4. Intercostales Raum sein.</li>
		<li>Warten Sie, bis Blut Genesung beobachtet wird, und Spritzen Sie EB in einer Dosierung von 0,2 mL/100 g Körpergewicht in die linke Herzkammer. Achtung: Cardiac Punktion und EB Injektion sollte sorgfältig durchgeführt werden. EB könnte in der Brusthöhle oder Herzbeutel anstelle der linken Herzkammer injiziert werden.<ol>
<li>Zurück mit einem Leerrohr saugen und Ersetzen dieser Band mit einem EB-Schlauch vor der Injektion, um die Fehlerrate zu verringern (z. B.., Injektion, Brustkorb durch Fehler).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Halten Sie die Ratte in Rückenlage für 10 Minuten. Hinweis: Wenn Probe nicht verwendet wird, um EB Leckage in der Immunfluoreszenz-Bildgebung zu erkennen, kann dieser Schritt übersprungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grobe Beobachtung<ol>
<li>Durchführen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) zerebrale Gefäßsystem und die Gehirne löschen.<ol>
<li>Mit einem Skalpell, machen Sie ein Bauchschnitt über die gesamte Länge des Zwerchfells.</li>
			<li>Schnitt durch Rippen nur Links von der Mittellinie des Brustkorbs.</li>
			<li>Öffnen Sie die Brusthöhle. Verwenden Sie Klammern, das Herz aussetzen und Ableitung von Blut und anderen Flüssigkeiten zu erleichtern.</li>
			<li>Halten Sie stetig das Herz mit der Pinzette (das Herz soll noch schlägt), direkt Einfügen einer Nadel in den Vorsprung der linken Herzkammer bis ca. 5 mm. ausdehnen sichern die Nadel an dieser Stelle klemmend nahe dem Punkt der Einreise. Achtung: Übermäßig die Nadel erstrecken sich nicht durchbohren die Innenwand und gefährden den Verkehr von Lösungen.</li>
			<li>Lassen Sie das Ventil, um die Strömung eiskaltem PBS Lösung (200 – 300 mL) mit einer langsamen und stetigen Rate bei rund 20 mL/min mit einem Perfusion Pumpe ermöglichen. Wenn die Tiere Fixierung statt Brutto Beobachtung erfordern, verwenden Sie die gleiche Dosis von eiskalten 0,9 % Kochsalzlösung.</li>
			<li>Mit einer scharfen Schere, einen Einschnitt machen Sie im Atrium, um sicherzustellen, dass die Lösung kontinuierlich fließt. Wenn die Flüssigkeit nicht frei fließt oder aus Nase oder den Mund des Tieres kommt, positionieren Sie die Nadel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bildschirm für CMHs durch grobe Beobachtung. Hinweis: Wenn die Probe nicht verwendet wird bei der Berechnung der Anzahl der CMHs durch grobe Beobachtung, kann dieser Schritt übersprungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixierung<ol>
<li>Führen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 0,9 % Kochsalzlösung (200 – 300 mL), der zerebralen Vasculature zu löschen und Gehirn.</li>
		<li>Durchführen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 4 % Paraformaldehyd für Fixierung.</li>
		<li>Enthaupten Sie die Ratte, isolieren Sie das Gehirn zu und Tauchen Sie das Gehirn 20 % Saccharose Lösung für mindestens 6 h.</li>
		<li>Ändern Sie die Lösung in 30 % Saccharose und Fix für ein weiteres 6 h.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 10 mm dicken Gehirn Gewebe Abschnitte mit einem Kryostat vor.</li>
</ol>5. er Färbung
Hinweis: Dieses Verfahren wird mit einer er-Färbung Kit durchgeführt.
<ol><li>Waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser.</li>
	<li>In fließendem Leitungswasser für 5 min in Hämatoxylin Lösung für 8 min. Waschen färben.</li>
	<li>In 1 % Säure Alkohol unter fließendem Leitungswasser für 1 min 30 S. reinigen zu unterscheiden.</li>
	<li>In 0,2 % Ammoniakwasser (Bläuen) färben oder gesättigten Lithium Carbonat Lösung für 30 s bis 1 min. Waschen unter fließendem Leitungswasser für 5 Minuten.</li>
	<li>Spülen Sie mit 95 % Alkohol (10 Dips).</li>
	<li>Gegenfärbung mit Eosin-Lösung für 30 s bis 1 Minute.</li>
	<li>Über 95 % Alkohol, zwei Änderungen des absoluten Alkohol, 5 min zu entwässern.</li>
	<li>Klar in Xylol für 30 s.</li>
	<li>Montieren Sie mit Lius Methode9.</li>
	<li>Mit einem Hellfeld-Fluoreszenz-Mikroskop zu analysieren. Hinweis: rote Blutkörperchen aus den Blutgefäßen, die die Komponenten der CMHs, veröffentlicht in rot-Orange unter er Färbung angezeigt.</li>
</ol>(6) Perl preußisch-Blau Färbung
Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt mit einem Perls Färbung-Kit.
<ol><li>Waschen Sie Objektträger mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>In der Reaktionslösung mit gleichen Teilen Mischung aus ferrocyanid und Salzsäure für 10 min. färben.</li>
	<li>Entwässern, klar, montieren und die Folien zu analysieren, wie 5,7 – 5.10 beschrieben.</li>
</ol>(7) EB Doppel-Färbung
Hinweis: Diese Prozedur folgt Schritt 4.1.3.
<ol><li>Waschen Sie Objektträger mit PBS dreimal für jeweils 5 min..</li>
	<li>Inkubieren Sie Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien mit PBS-Lösung drei Mal für 5 min, und montieren Sie Folien mit PBS-Glycerin-Lösung.</li>
	<li>Analysieren von Bildern auf einem Fluoreszenzmikroskop. EB-Abscheidung wird durch rote Fluoreszenz; Kerne sind gekennzeichnet durch blaue Fluoreszenz.</li>
</ol>(8) MRI-SWI
<ol><li>Führen Sie MRI auf einen 7-Tesla-Magneten ausgestattet mit einem aktiv abgeschirmten gradient-System (16 cm Innendurchmesser).</li>
	<li>Betäuben Sie sieben Tage nach der Behandlung, die Ratten durch Gesichtsmaske Einatmen von 1,5 – 2,0 % Isofluran mit einem Isofluran-Narkose-System.</li>
	<li>Wenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen der Ratte gegen Trockenheit während Narkose an.</li>
	<li>Halten Sie die Ratten in Bauchlage und durchführen Sie einen MRI-SWI-Scan.</li>
	<li>SWI gewichteten Scans mit einer Fast-Spin-Echo-Sequenz mit den folgenden Parametern zu erhalten: echo Zeit (TE) 8 ms Wiederholung Zeit (TR) 40 ms, flip Winkel = 12°, Sichtfeld (FOV) 35 mm × 35 mm, Erwerb Matrix 384 × 384, 1 mm dicke Scheiben zu erwerben.</li>
	<li>Identifizieren Sie CMHs in MRI-SWI nach Greenberg Et al. 11, in dem folgenden Kriterien berücksichtigt: (1) einen Durchmesser von ≤10 mm und (2) zirkuläre, isoliert und Low-Signal Intensität Flecken.</li>
	<li>Am Ende des Experiments einschläfern Sie die Ratten, die mit der Überdosis Kohlendioxid (einem Fluss von 6 L/min) oder 30 % des Behältervolumens Methode.</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Studien über CMHs haben in den letzten Jahren zugenommen. Der Mechanismus der CMHs bleibt jedoch unklar, woraufhin Wissenschaftler, Tiermodellen zu etablieren, die diese besondere Situation zu simulieren. Z. B. Hoffmann Et al. entwickelt eine Hypoxie-induzierten CMHs Maus-Modell, das zeigt, dass CMHs durch Hypoxie und Störung der zerebrovaskulären Selbstregelung12verursacht werden. Reuter Et al. 5 CMHs Modell gegründet APP23 Transgene Mäuse, die die zerebr...

Klassische zerebrale Scherbewegungen (CMHs) beziehen sich auf winzige perivaskuläre Ablagerungen von Blut Abbauprodukte wie Hämosiderin aus roten Blutkörperchen in der Gehirn-1. Demnach Rotterdam Scan werden CMHs in fast 17,8 % der Personen im Alter von 60-69 Jahre und 38,3 % bei den über 80-jährigen2gefunden. Die Prävalenz der CMHs bei älteren Menschen ist relativ hoch, und eine Korrelation zwischen der Akkumulation von CMHs und neuropsychiatrische und Kognitive Dysfunktion wurde etablierten3,4. Verschiedenen Tiermodellen der CMHs haben vor kurzem berichtet wurde, einschließlich der Nager-Modelle von Typ IV Kollagenase stereotaktischen Injektion5, APP transgenen6, β-N-Methylamino-L-Alanin Exposition7und Hypertonie8induziert, mit CMHs, induziert durch eine systemische Entzündung als eines der am meisten anerkannten Entscheidungen. Fischer Et al. zuerst verwendet 9 LPS von Salmonella Typhimurium abgeleitet, um einem akuten CMHs Mausmodell zu entwickeln. Anschließend berichtete die gleiche Gruppe die Entwicklung von einem subakuten CMHs-Maus-Modell mit dem gleichen Ansatz2.
LPS gilt als eine standardisierte entzündungsreiz über intraperitoneale Injektion. Frühere Studien haben bestätigt, dass LPS Injektion Neuroinflammation verursachen könnte, wie Sie sich durch große Mengen von Mikroglia und Astrozyten Aktivierung in der Tier-2,10 Modelle. Darüber hinaus wurde eine positive Korrelation zwischen der Aktivierung des Neuroinflammation Aktivierung und die Anzahl der CMHs etablierten2,10. Basierend auf diesen früheren Studien, wurden wir aufgefordert, einem Rattenmodell CMHs entwickeln durch intraperitoneale Injektion von LPS.
Fortschritte in der Erkennung, Technologien zu einer Zunahme der Anzahl der Forschung Untersuchungen über CMHs geführt haben. Am meisten anerkannten Methoden zur Erkennung von CMHs gehören den Nachweis von roten Blutkörperchen von Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung, dreiwertigem Eisen Erkennung durch preußisch-blau färben9, Erkennung von Evans blau (EB) Ablagerung durch Immunfluoreszenz Bildgebung und 7,0 Tesla Magnet-Resonanz-Tomographie-Anfälligkeit gewichtete Bildgebung (MRT-SWI)10. Die vorliegende Studie soll eine Methode zur Früherkennung von CMHs zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>zur Entzündungsinduktion</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>zur EB-Leckageerkennung</td></tr><tr><td>DAPI Sterbelösung</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>Zählmedium für IF</td></tr><tr><td>Perl' s Preußische Färbung</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Kit für die preußische Färbung</td></tr><tr><td>HE Färbung</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>Kit für die Färbung von</td></tr><tr><td>Chloralhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>eine Art Pufferlösung, die häufig im Experiment verwendet</td></tr><tr><td>wird 0,9% ige Kochsalzlösung</td><td>Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China</td><td></td><td>Lösung für Perfusion</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>eine Lösung, die üblicherweise für die Fixierung verwendet</td></tr> wird <tr><td>20%ige Saccharoselösung</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>eine Art Lösung, die üblicherweise für die Fixierung verwendet</td></tr> wird <tr><td>30%ige Saccharoselösung</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>eine Art Lösung, die üblicherweise zur Fixierung</td></tr> <tr>verwendet wird<td>Tierarztsalbe</td><td>Solcoseryl Augengel, Bacel, Schweiz</td><td></td><td>zum Schutz der Rattenaugen</td></tr></tbody></table>

sub-akute zerebrale punktblutungen induziert durch lipopolysaccharid-injektion bei ratten

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Zerebrale Scherbewegungen (CMHs) sind häufig bei Patienten im Alter von und in Korrelation zu verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen. Die Ätiologie der CMHs ist komplex, und Neuroinflammation wird oft als eine gleichzeitige Auftreten beobachtet. Hier beschreiben wir eine Sub-akute CMHs Rattenmodell induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion, sowie eine Methode zur Erkennung von CMHs. systemische LPS Injektion ist relativ einfach, wirtschaftlich und kostengünstig. Ein großer Vorteil von LPS Injektion ist seine Stabilität, Entzündung zu induzieren. CMHs verursacht durch LPS Injektion konnte durch grobe Beobachtung, Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung, Perl preußischen Färbung, Evans blau (EB) Doppel-labeling und Magnet-Resonanz-Tomographie-Anfälligkeit gewichtet imaging (MRI-SWI)-Technologie nachgewiesen werden. Abschließend werden andere Methoden der Entwicklung von Tiermodellen CMHs, einschließlich ihre Vorteile bzw. Nachteile, auch in diesem Bericht diskutiert.

CMHs können mit verschiedenen Ansätzen erkannt werden. Die meisten anerkannten Methoden gehören die folgenden: (1) grobe Beobachtung und Beurteilung der Oberfläche CMHs (siehe Abbildung 1, oben); (2) er Färbung zum Nachweis von roten Blutkörperchen (siehe Abbildung 2A, obere Leiste) oder preußischen Färbung erkennen von dreiwertigem Eisen abgeleitet Lyse der Erythrozyten (Abb. 2A, untere Leiste); (3)...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zu induzieren und erkennen, dass CMHs verursacht durch LPS Injektion in Sprague-Dawley Ratten, die möglicherweise in Zukunft Forschung Untersuchungen über die Pathogenese der CMHs genutzt.

Sub-akute zerebrale Punktblutungen induziert durch Lipopolysaccharid-Injektion bei Ratten

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Bereich der Hirnblutung wie Ätiologie, Verteilung und Nachweis von hirnmikroskopischer Hirnblutung usw. zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass LPS-Injektionen eine Entzündung stabil induzieren. Darüber hinaus ist die LPS-Injektion recht einfach, wirtschaftlich und kostengünstig.Obwohl diese Methode Einblick in die Hirnblutungsinduktion geben kann, Kann es auch auf andere Erkrankungen des Gehirns wie Depression, Schizophrenie, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Prion-Krankheit angewendet werden. Verabreichen Sie LPS in einer Dosis von einem Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht an 10 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten durch intraperitoneale Injektion, dann jede Ratte in den heimischen Käfig zurück. Wiederholen Sie die LPS-Injektion nach sechs Stunden und 16 Stunden.Bitte beachten Sie, dass die Injektion von SD-Ratten mit LPS in einer Dosis von einem Milligramm pro Kilogramm zu einer Sterblichkeit von 5 % führen kann. Die Sterblichkeit könnte bei jüngeren oder älteren Ratten oder schwangeren weiblichen Ratten weiter zunehmen. Bringen Sie die Ratten nach der LPS-Injektion in ihre Käfige zurück und bieten Sie ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Getränken.Führen Sie unter Terminalanästhesie eine fünf bis acht Millimeter tiefe Herzpunktion an jeder Ratte durch. Der Punktionspunkt sollte fünf Millimeter zum linken Rand des Brustbeins im dritten und vierten interkostalen Raum sein. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle und ersetzen Sie das leere Rohr durch ein Rohr mit Evans blau.Warten Sie, bis die Bluterholung beobachtet wird, und injizieren Sie Evans blau in einer Dosis von 0,2 Milliliter pro 100 Gramm Körpergewicht in den linken Herzventrikel. Halten Sie die Ratte in einer Supine-Position für 10 Minuten, wenn Sie Evans blaue Leckage durch die Blut/Hirn-Schranke durch Immunfluoreszenz-Bildgebung beurteilen. Führen Sie Herzperfusionen mit eiskalten 200 bis 300 Millilitern 0,9% Salinelösung durch, um die zerebrale Vaskulatur und gehirn zu löschen.Wechseln Sie zur Fixierung auf eiskaltes 4%Paraformaldehyd. Dann, nach der Isolierung des Gehirns, tauchen Sie es in 20%Saccharose in PBS für mindestens sechs Stunden oder bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt. Ändern Sie die Lösung auf 30%Saccharose und fixieren Sie sie für weitere sechs Stunden.Schließlich bereiten Sie 10 Millimeter dicke Hirngewebeabschnitte mit einem Kryostat vor. Waschen Sie die Dias dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, dann inkubieren Sie Dias mit 4, 6'diamidino-2-phenylindole oder DAPI Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Dias in PBS wie zuvor, montieren Sie die Dias mit PBS-Glyzerin-Lösung.Erfassen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop. Die EB-Abscheidung wird durch rote Fluoreszenz angezeigt, Kerne sind durch blaue Fluoreszenz gekennzeichnet. Beginnen Sie mit der H&E-Färbung, indem Sie die Dias in destilliertem Wasser waschen.Dann tauchen Sie acht Minuten lang in Hämatoxylinlösung ein. Alternativ für Perl preußische blaue Färbung, Färbung in Reaktionslösung mit gleichen Teilen Mischung von Ferrocyanid und Salzsäure für 10 Minuten. Nach der Färbung fünf Minuten lang in fließendem Leitungswasser waschen.In 1%säurealkohol für 30 Sekunden differenzieren. Nach dem Waschen in fließendem Leitungswasser für eine Minute, Flecken in 0,2%Ammoniak-Wasser oder gesättigte Lithium-Carbonat-Lösung für 30 Sekunden bis eine Minute. Als nächstes fünf Minuten in fließendem Leitungswasser waschen.Gegenfleck mit Eosin-Lösung für 30 Sekunden bis eine Minute. Dehydrieren Sie durch 90%Alkohol, dann 95% Alkohol und absoluten Alkohol für jeweils 0,5 bis zwei Minuten. Nach der Austrocknung 30 Sekunden lang in Xylol löschen.Analysieren Sie nach der Montage die H&E-Färbung mit einem Hellfeldfluoreszenzmikroskop. Die roten Blutkörperchen, die aus den Blutgefäßen freigesetzt werden, die Bestandteile der CMHs sind, erscheinen in rot-orange unter H&E-Färbung. Oberflächen-CMHs können durch grobe Beobachtung erkannt werden, wie durch die roten Pfeile angezeigt.Evans blaue Färbung zeigt sichtbare rote Fluoreszenz, wo Evans blaue Moleküle aus einer verletzten Blut -Hirn-Schranke austraten. Die H&E-Färbung zeigt rote Blutkörperchen außerhalb der Kapillaren, und preußische Färbung zeigt eisenrote Ionenpunkte, die aus der Lyse roter Blutkörperchen abgeleitet sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Dosis von LPS, um zerebrale Mikroblutungen zu induzieren, größer ist als die, die bei Parkinson-Krankheit oder Schizophrenie-Modell verwendet wird.Daher sollte die Umwelt der Tiere sauber gehalten werden, um die Sterblichkeitsrate zu senken. Im Anschluss an dieses Verfahren könnten andere Methoden wie Elektronenmikroskopie, Magnetresonanztomographie und immunfluoreszierende Bildgebung durchgeführt werden, um die Schädigung der äußeren Struktur der Blut-Hirn-Schranke bei hirn-Hirn-Blutungen, die Verteilung von hirnmikroskopischen Mikroblutungen im Blutparenchym in vivo sowie die Gliazellaktivierung zu bestimmen.

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Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

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Lernen Sie die Induktion sub-akuter zerebraler Punktblutungen bei Sprague-Dawley-Ratten durch LPS-Injektion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung inflammatorischer Prozesse und der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.

Sub-akute zerebrale Punktblutungen induziert durch Lipopolysaccharid-Injektion bei Ratten

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