Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben

Diese Methode kann schnell feststellen, ob Proben das Zika-Virus enthalten. Dies ist nützlich für Schwangere, Paare, die versuchen, schwanger zu werden, oder Überwachung der lokalen Mückenpopulationen, die für eine Zika-Infektion gefährdet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell, einfach ist, keine teure Ausrüstung benötigt und ohne einen RNA-Isolationsschritt durchgeführt werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Diagnose einer Zika-Infektion, da eine Infektion während der Schwangerschaft mit Fehlgeburten, Totgeburten und anderen schweren angeborenen, neurologischen Geburtsfehlern verbunden ist. Obwohl diese Methode Einblicke in Zika geben kann, kann sie auch auf andere Infektionskrankheiten wie Dengue, Chikungunya oder West-Nil-Virus angewendet werden, indem virusspezifische Primer verwendet werden. Um zu beginnen, rekonstituieren Sie jeden RT-LAMP Primer in molekularem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolaren.

Kurz wirbeln Sie die Primer-Lösung, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist. Zentrifuge für etwa fünf Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit, um die Primer-Lösung zu sammeln. Bereiten Sie dann einen 10x RT-LAMP Primer Mix vor, wie in Tabelle 2 des Tech-Protokolls beschrieben.

Wirbel kurz, um Homogenität zu gewährleisten. Und Zentrifugieren Sie kurz mit maximaler Geschwindigkeit, um Verluste zu vermeiden. Bewahren Sie die Primer bei minus 20 Grad Celsius zwischen den Anwendungen auf, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.

Für menschliche Urinproben verwenden Sie entweder frischen Urin, gefrorenen Urin oder Urin in Konservierungsmittel. Vor Gebrauch alle gefrorenen Proben auf Eis auftauen. Menschliche Serumproben sollten entweder frisch oder gefroren sein, während ZIKV-infizierte Zelllinien entweder konditionierte Medien oder Zelllysate enthalten sollten.

Schließlich, für Aedes aegypti Mücken, verwenden Ganze Kadaver, entweder frisch oder gefroren. Alle gefrorenen Mückenkadaver auf Eis auftauen. Legen Sie eine einzelne Mücke in 100 Mikroliter PBS.

Mit einer P10 Pipettenspitze die Mücke zehnmal zerkleinern und zu einem groben Mückenlysat homogenisieren. Zentrieren Sie kurz das rohe Lysat, um Schmutz zu pellet und verwenden Sie den Überstand für die nachgeschaltete RT-LAMP-Analyse. Bereiten Sie zunächst eine RT-LAMP-Master-Mix-Reaktion auf Eis für jeden zu verwendenden Primersatz vor, wie in Tabelle drei im Protokoll der Technologie beschrieben.

Wirbel jede Probe, um sicherzustellen, dass es gut gemischt ist. Drehen Sie sie dann kurz nach unten, um Volumenverlust zu verhindern. Für jede Reaktion mischen Pipette 23,0 Mikroliter des RT-LAMP-Master-Mix in ein 200-Mikroliter-PCR-Rohr.

Fügen Sie dann zwei Mikroliter Probe hinzu, um das Gesamtvolumen auf 25,0 Mikroliter zu bringen. Verwenden Sie molekulares Wasser für die Negative Kontrolle, und stellen Sie sicher, dass eine positive Kontrolle enthalten. Optional, enthalten Eine Spezifitätskontrollreaktion eines verwandten Arbovirus wie Dengue-Virus, wie im Tech-Protokoll beschrieben.

Mit einem Wärmeblock, einem Wasserbad oder einem Thermocycler die Proben 30 Minuten lang bei 61 Grad Celsius erhitzen. Danach erhöhen Sie die Hitze auf 80 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Polymerase zu deaktivieren. Führen Sie die RT-LAMP-Analyse in einem separaten geschlossenen Raum durch.

Verdünnen Sie den fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff eins bis zehn im TAE-Puffer. Fügen Sie zwei Micorliter der fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstofflösung zu 12 Micorliter der RT-LAMP-Reaktion hinzu. Bewerten Sie die RT-LAMP-Reaktionen visuell, indem Sie nach einem Farbwechsel suchen.

Verwenden Sie optional eine Kamera, um RT-LAMP-Reaktionen auf weißem Hintergrund zu fotografieren. Als nächstes stellen Sie die Proben unter ein 302 Nanometer UV-Licht, um das Vorhandensein von RT-LAMP-Produkten durch Fluoreszenz zu bestätigen. Verwenden Sie eine Kamera, um ein Bild des Ergebnisses zu machen.

Um mit der Durchführung der Elektrophorese zu beginnen, gießen Sie 2%Agarose-Gel in 1x TAE-Puffer mit einem Nukleinsäurefleck zur Visualisierung. Fügen Sie fünf Mikroliter einer DNA-Leiter in der ersten Spur hinzu, um die Molekulargewichte zu vergleichen. Mischen Sie für jede RT-LAMP-Reaktion 13 Mikroliter RT-LAMP-Reaktionsmischung mit zwei Mikrolitern DNA-Ladefarbstoff.

Laden Sie diese 15-Mikroliter-Mischung. Führen Sie das Gel bei 90 Volt für 90 Minuten oder bis die Bänder getrennt sind. Ein Bild mit 302 Nanometer UV-Licht.

Nach Fertigstellung die RT-LAMP-Reaktionen in doppelt versiegelten Säcken entsorgen. In dieser Studie werden drei verschiedene Methoden verwendet, um RT-LAMP-Reaktionen zu analysieren. Bei verwendung von fluoreszierendem Nukleinsäurefarbstoff werden positive Reaktionen gelb-grün in der Farbe, während negative Reaktionen orange erscheinen.

Dieser Farbstoff führt auch zu einem fluoreszierenden Signal, wenn Proben durch UV-Licht angeregt werden. Schließlich können RT-LAMP-Reaktionen auf einem Agarose-Gel auslaufen. Positive RT-LAMP-Reaktionen haben ein Banding-Muster, während negative Reaktionen keine DNA-Bänder haben.

Diese Methoden werden verwendet, um die Spezifität der ZIKV RT-LAMP-Reaktion zu demonstrieren. Nur die MOLEKULARe ZikV-Steuerung hat eine positive RT-LAMP-Reaktion. Während ZIKV sowohl im Urin als auch im Serum eines Patienten mit bekannter ZIKV-Infektion nachgewiesen wird, wird es beim asymptomatischen Kontrollpatienten ohne ZIKV-Infektion nicht gesehen.

Die Proben werden dann auf menschliche 18S rRNA getestet. Nur die von Patienten entnommenen Proben sind für 18S rRNA positiv. Mückenproben können in ähnlicher Weise auf ZIKV oder die RT-LAMP Qualitätskontrolle AEDAE getestet werden.

Nur die positive molekulare Kontrolle für ZIKV und die mit ZIKV infizierte Mücke wird für ZIKV als positiv angesehen. Allerdings sind alle Mücken positiv für AEDAE von RT-LAMP. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass RT-LAMP Reaktionen anfällig für falsche positive Reaktionen sind. Zu den Präventionsschritten gehören die Verwendung einer thermolabilen Uracil-DNA-Glykoselase in Reaktionen, die Verwendung eines lateralen Workflows, die Durchführung von Analysen in einem separaten Raum und die Verkürzung der Zeit nach der Amplifikation sind offen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie QPCR ausgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie viele Kopien das Virus oder andere Ziele in der Stichprobe vorhanden sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie RT-LAMP verwenden können, um das Zika-Virus zu erkennen und Kontrollen im menschlichen Urin und Serum sowie mückenzusteuern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Zika-Virus und Nukleinsäure-Färbung extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden. Angesichts des Zusammenhangs der Zika-Virusinfektion mit angeborenen Anomalien sollten schwangere Frauen oder Partner dieser Frauen ihre Laborexposition gegenüber dem Zika-Virus deutlich minimieren.