Generation von menschlichen 3D Lungengewebe Kulturen (3D-LTCs) für Krankheit Modellierung
12. Februar 2019
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Vorbereitung der Agarose-gefüllte menschlichen präzise geschliffenen Lunge Scheiben aus resezierten Patienten Gewebe, die für die Erzeugung von 3D Lunge Gewebekulturen, Modell menschlichen Lungenerkrankungen in biologischen und biomedizinischen Studien eignen.
Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von lebendem menschlichem Gewebe in seiner natürlichen 3D-Struktur und Zusammensetzung für die Übersetzung wichtiger Laborbefunde in potenzielle Therapien. Diese Technik ermöglicht speziell die Erzeugung von Gewebekulturen aus chirurgisch resektiertem oder explantiertem menschlichen Lungengewebe zur Visualisierung einzelner verstorbener Patienten-Lungengewebeproben. Krankheitsfreies Lungengewebe kann als 3D-Gewebekulturen verwendet werden, um Lungenerkrankungen ex vivo zu modellieren, was die Analyse früher Pathomechanismen in einer hohen raumzeitlichen Auflösung ermöglicht.
Beginnen Sie damit, die resektierte Lungenprobe in 15 Milliliter Anbaumedium in einer sterilen 15-Zentimeter-Kulturschale und einem sterilen Metalltablett mit Tissuepapier zu platzieren, und füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 42 Grad Celsius niedriger Schmelzpunkt-Agarose. Entfernen Sie den Obturator aus einem peripheren Venenkatheter und befestigen Sie den Katheter an der 30-Milliliter-Spritze. Identifizieren Sie einen Bronchus mit einem Durchmesser von 0,5 bis 3 Millimetern im Beatmungsgewebe in einem intakten Abschnitt des Gewebes, und legen Sie die Kanüle so weit wie möglich vorsichtig in den Bronchus ein.
Verwenden Sie Zangen, um die Bronchiolenwand um die Kanüle zu komprimieren, idealerweise jede benachbarte Lungenarterie gleichzeitig zu spannen, um die Bronchus um die Kanüle zu versiegeln und eine chirurgische Klemme zu verwenden, um weitere zusätzliche Atemwege zu verschließen, um Agarose-Leckage zu verhindern. Als nächstes verwenden Sie die Zange, um das Lungengewebe aus der Kulturschale zu heben, und verwenden Sie die Spritze, um die Agarose manuell durch die Kanüle zu liefern, nicht schneller als 0,3 Milliliter pro Sekunde. Wenn das Lungengewebe vollständig gefüllt wird, ohne das Gewebe zu überblasen, entfernen Sie sofort die Kanüle und klemmen Sie den Bronchus.
Tauchen Sie das Gewebe in Kulturmedium bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, um die Agarose-Erstarrung zu erleichtern, und wiederholen Sie das Agarose-Füllverfahren für zusätzliche Bronchiolöffnungen. Dann lagern Sie die agarosegefüllten Lungengewebeabschnitte in vier Grad Celsius Medium bis zum Schneiden. Für präzise geschnittenes Lungenschneiden, identifizieren Sie die fest agarosegefüllten Bereiche im Lungengewebe, die nicht kollabieren, wenn sie sanft mit einer Pinzette gegen den Boden der Zellkulturschale gedrückt werden.
Verbrauchen Sie einen 1 bis 1,5 Kubikzentimeter Block fest gefüllten Bereich mit einer Seite noch mit Pleura bedeckt, und verwenden Sie Cyanoacrylat Kleber, um die Pluralseite jedes Gewebeblocks an den Vibramhalter zu befestigen. Schneiden Sie den ganzen Weg durch den langen Gewebeblock, bis nur noch zwei bis drei Milometer Gewebe ungeschnitten bleiben. Mit Zangen, um jeden 500-Mikrometer-Abschnitt in einen Brunnen einer Zwölf-Brunnen-Platte mit Anbaumittel zu übertragen, wie sie erhalten werden.
Wenn das gesamte Gewebe geschnitten ist, übertragen Sie die Proben von jedem Brunnen in einzelne Zehn-Zentimeter-Kulturgerichte und positionieren Sie einen vier Millimeter großen Biopsie-Stanzer orthogonal auf die Oberseite der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe. Dann bewegen Sie den Boxer im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn Rotationen, erhalten Gewebe Schläge der Lungenprobe. Platzieren Sie jeden Stempel in frischzelligen Kulturmedium in einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte, wie sie erhalten werden.
Wenn alle Gewebeschläge erhalten sind, legen Sie die Platte bis zu fünf Tage in den Zellkultur-Inkubator. Die Immunolabelierung von Fibronectin in Zellkernen mit Immunfluoreszenz in menschlichen 3-D-Lungengewebekulturen ermöglicht die Abbildung der konservierten Alveolarstruktur ex vivo. Die Behandlung der humanen Präzision geschnitten Enlung Scheiben Schläge mit einem profibrotic Zytokin-Cocktail für 48 Stunden führt zu Fibrose-ähnlichen Veränderungen in der menschlichen Lunge 3-D-Gewebekulturen, einschließlich der signifikanten Induktion der Fibrose relevanten extrazellulären Matrixkomponenten, Kollagen Typ One, und Fibronectin Gene.
Zusätzlich sind die Proteinspiegel des mesenchymalen Markers Vimentin bei drei von vier Patienten nach Behandlung von 3-D-Lungengewebekultur-Punches reguliert. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Analyse durch quantitative Echtzeit-PCR oder die Proteinanalyse durch Western Blotting durchgeführt werden, um die Gen- und Proteinexpression bzw. die im Gewebe zu bewerten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der experimentellen Pulmonologie, zur Explantation der Lungenbiologie sowie zur Durchführung toxikologischer und pharmakologischer Studien an menschlichen Gewebeproben.
Denken Sie daran, dass lebendes menschliches Gewebe potenziell infektiös ist und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und der richtigen Gewebelagerung, des Transports und der Abfallbehandlung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Herstellung von mit Agarose gefüllten humanen präzisionsgeschnittenen Lungenproben aus reseziertem Patientengewebe vorgestellt. Diese Schnitte eignen sich zur Erzeugung von 3D-Lungengewebekulturen, um menschliche Lungenerkrankungen in biologischen und biomedizinischen Studien zu modellieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomedizinische Forschung
- Modellierung von Lungenerkrankungen
- 3D-Gewebekultivierungstechniken
Hintergrund
- Menschliches Lungengewebe kann verwendet werden, um Krankheiten in einer natürlichen dreidimensionalen Struktur zu untersuchen.
- Diese Methode ermöglicht die Visualisierung individueller Lungeproben von Patienten.
- Sie erlaubt die Analyse früher pathomechanistischer Vorgänge mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.
- Aufgrund der infektiösen Natur von lebendem menschlichem Gewebe sind vorbeugende Maßnahmen erforderlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Herstellung von 3D-Lungengewebekulturen.
- Ermöglichung der Untersuchung pulmonaler Erkrankungen ex vivo.
- Möglichkeit zur Analyse der Gen- und Proteinexpression in menschlichem Lungengewebe.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Lungenprobenschnitten mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt.
- Präzises Schneiden von Lungenabschnitten, die mit Agarose gefüllt sind.
- Immunmarkierungstechniken zur Visualisierung der Gewebestruktur.
- Analyse der Gen- und Proteinexpression mittels PCR und Western Blotting.
Hauptergebnisse
- Induktion fibrotischer Veränderungen in Lungengewebekulturen nach Zytokinbehandlung.
- Upregulation der Gene für Kollagen Typ Eins und Fibronectin.
- Erhöhte Proteinspiegel des mesenchymalen Markers Vimentin in behandelten Proben.
- Potenzial für weitere Forschung in der experimentellen Pneumologie und Pharmakologie.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik vertieft das Verständnis der Lungensbiologie.
- Sie bietet eine Plattform für toxikologische und pharmakologische Studien.
- Zukünftige Forschungsvorhaben können auf dieser Methode aufbauen, um bessere Krankheitsmodelle zu entwickeln.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Menschliche 3D-Lungengewebekulturen, die aus präzisionsgeschnittenen Lungenproben gewonnen werden, stellen ein physiologisch relevantes Ex-vivo-Modell zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Arzneimittelwirkungen in der nativen menschlichen Gewebearchitektur dar. Dieser Ansatz unterstützt die Target-Validierung und die mechanistische Risikominderung, indem er die direkte Beurteilung von Substanzeffekten in erkranktem oder peritumoralen Lungenmaterial von einzelnen Patienten ermöglicht. Das Modell erhöht die Vorhersagesicherheit in der präklinischen Bewertung, da es die zelluläre Diversität, die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix sowie biomechanische Eigenschaften bewahrt, die für die translationale Relevanz entscheidend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in intaktem menschlichem Lungengewebe mit erhaltener 3D-Struktur und Zelltypenvielfalt.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch Messung arzneimittelinduzierter Veränderungen fibroserelevanter Biomarker wie Kollagen Typ I und Fibronectin.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Aufklärung von Signalwegen durch räumlich-zeitliche Analyse früher pathomechanistischer Vorgänge in krankheitsrelevantem menschlichem Gewebe.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Gewebestanzproben, die für die Wirkstoffscreening-basierte Analyse in Mehrfach-Well-Platten geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht quantitative Auswertungen mittels Immunfluoreszenz, qPCR und Western Blotting für Dosis-Wirkungs- und Zeitverlaufsanalysen.
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert den Gewebeertrag aus begrenzten Patientenproben durch Biopsiestanzung und verbessert so die Skalierbarkeit und Reproduktionsfähigkeit von Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert menschenspezifische fibrotische Prozesse auf subzellulärer Ebene unter Verwendung zytokininduzierter, fibroseähnlicher Veränderungen in präzisionsgeschnittenen Lungen-Schnitten.
- Operationaler Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung der Zielstrukturenbindung und des Wirkmechanismus in menschlichem Gewebe vor In-vivo-Studien.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die translationale Biomarker-Abstimmung, indem Korrelationen zwischen molekularen Messgrößen und funktionellen Gewebeergebnissen ermöglicht werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung ein und ermöglicht eine iterative Verbesserung basierend auf den Reaktionen menschlichen Gewebes.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Visualisierung der alveolären Struktur und zellulärer Reaktionen in intakten humanen Lungenexplantaten ermöglicht wird.
- Screening: Stellt assaysbereite Gewebeproben mit konsistenter Größe und Vitalität für das Screening von Substanzbibliotheken in 96-Loch-Formaten bereit.
- Analytik: Ermöglicht multiplexe Nachweise, einschließlich Genexpression (qPCR), Proteinspiegel (Western Blot) und strukturelle Bildgebung (Immunfluoreszenz), um Behandlungsbedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckung und präklinische Forschung, indem die Komplexität menschlichen Gewebes erhalten bleibt und eine patientenspezifische Analyse der Reaktionen ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Modellierung von Lungenerkrankungen, die in mehreren Projekten und therapeutischen Bereichen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Art-übergreifende Übersetzungslücken durch die direkte Verwendung menschlichen Lungengewebes verringert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebepräparation durch Agarose-Einbettung und präzises Schneiden und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Anwendern und Standorten.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, auf menschlichem Gewebe basierende Wirksamkeits- und Toxizitätssignale bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf mechanistischen Effekten in erkranktem oder peritumoralen menschlichen Lungengewebe.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit menschlichem Gewebe, steriler Technik und Schnittverfahren mittels Vibratom.
- Setzt den Zugang zu operativ entferntem Lungengewebe und Niedrigschmelzpunkt-Agarose zur strukturellen Konservierung voraus.
- Erfordert standardisierte Kulturbedingungen und Kontaminationskontrollen aufgrund des infektiösen Potenzials von lebendem menschlichem Gewebe.
- Beinhaltet die Optimierung der Größe der Biopsiestanzen und der Rotationsmethode, um die Probengleichmäßigkeit über alle Replikate hinweg sicherzustellen.
- Ist durch das Zeitfenster der Gewebeviabilität begrenzt und erfordert eine zeitnahe Verarbeitung und Kultivierung unmittelbar nach der Resektion.
