Name: Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Regulation der MALT1-Paracaspase-Aktivität in myeloischen Zellen durch angeborene Signalwege. Diese Methode nutzt humane PBMCs und Mauszellpräparate zur Analyse zytokinbasierter Immunantworten.

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Wir danken für ihre Berechtigung (Lizenz-Nummer 4334770630127), hier zu reproduzieren Figur 2A von Unterreiner Et Al. Elsevier (2017).

Gemäß den Richtlinien und Normen der menschlichen Ethik-Forschungskommission Novartis wurden Experimente durchgeführt.
1. Vorbereitung des peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von menschlichen Buffy Coats
Hinweis: Wir erhielten buffy Coats von gesunden Probanden einen Tag nach der Entnahme in 50 mL Beuteln. Sie waren Einverständniserklärung zur Verfügung gestellt und durch das Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuzgesammelt. Wir behandelt sie mit dem Verfahren unter, bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben.
<ol><li>Bereiten Sie ein steril und sauber Paar Scheren und 1 L Becher mit einer Plastiktüte (unter einer Lamina-Flow).</li>
	<li>Transfer der buffy Coat in das Becherglas und öffnen Sie es vorsichtig mit der Schere.</li>
	<li>Mit einem 25-mL-Pipette, 100 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Puffer/Ethylenediaminetetraacetic Säure hinzufügen (PBS/EDTA: PBS 1 X pH 7.4 enthält keine CaCl2 und kein MgCl2, ergänzt mit 2 mM EDTA pH 8,0). Hinweis: Mit dem gleichen pipette und nach dem Pipettieren der Lösung langsam rauf und runter, Spenden 25 mL der verdünnten buffy Mantel in 6 konische Zentrifuge Rohre von 50 mL vorausgefüllt mit 15 mL Polysaccharid-basierte Dichtegradient.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 20 min. bei 800 X g mit mäßiger Beschleunigung (auf 4 von 9 gesetzt) und ohne Bremse, um Trennung von Zellen anhand ihrer Dichte zu ermöglichen. Hinweis: Nach Zentrifugation werden drei Schichten sichtbar sein; ein Pellet, Erythrozyten und Granulozyten, eine obere Schicht besteht aus Plasma, und dazwischen einen weißen Ring mit peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) enthalten.</li>
	<li>Ernten Sie die PBMC-Ring mit einem 10 mL-Pipette und Übertragung auf neue 50 mL-Tuben. Hinweis: Zwei bis drei 50 mL Röhrchen sind normalerweise pro buffy Mantel benötigt. In diesem Stadium verschmutzt einige Plasma wahrscheinlich die gesammelten PBMCs, die keine Auswirkungen auf die anschließende Anreicherung Schritte haben sollte.</li>
	<li>Top-bis zu 50 mL jedes Rohr mit PBS/EDTA und fahren Sie mit drei aufeinander folgenden Waschungen mit abnehmender Zentrifugation Zeit und Geschwindigkeit (15 min bei 520 x g, 10 min bei 330 X g, 8 min. bei 150 X g). Hinweis: Bei jedem Schritt wird der Überstand in einem flüssigen Abfallbehälter abgegossen und die Zelle Pellet wird in 50 mL PBS/EDTA Nukleinsäuretablette (Pellets können nach der ersten Wäsche gepoolt).</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Pellets in 25 mL einen eiskalten Lyse-Puffer (siehe Tabelle der Materialien), die roten Blutkörperchen durch osmotischen Druck zu lösen.</li>
	<li>Inkubieren, bis die Lösung klar wird (≤5 min bei Raumtemperatur).</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 25 mL Trennung Puffer (PBS 1 x pH 7.4 enthält keine CaCl2 und kein MgCl2, ergänzt um 2 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA pH 8,0).</li>
	<li>Waschen Sie ein weiteres Mal bei 150 X g für 8 min. Hinweis: In diesem Stadium PBMCs einsetzbar als größte Population (siehe Schritt 3: PBMCs und Monozyten Behandlungen und stimulierende Bedingungen) oder für Monocyte Bereicherung verarbeitet (siehe Schritt 2: Vorbereitung der Monozyten von PBMCs), oder gefroren nach unten für eine spätere Verwendung (siehe Schritt 5: Monozyten und PBMCs Einfrieren/Auftauen-Verfahren).</li>
</ol>2. Vorbereitung von Monozyten aus PBMCs
<ol><li>Aufschwemmen Sie der PBMCs am Schritt 1.10 Trennung Puffer erhalten und zählen sie 5 x 107Zellen/mL erreichen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in einer 14 mL konische Zentrifugenröhrchen mit Kappe.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Monocyte Bereicherung Antikörper cocktail pro mL Zellsuspension, Wirbel, und 10 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Monocyte Bereicherung Perlen pro mL von Zellen. Hinweis: Die Perlen müssen gründlich verwirbelt, Homogenität der Suspension zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach dem Hinzufügen von Perlen, kurz die Zellsuspension Wirbel und 5 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Spülen Sie den oberen Teil des Rohres mit Trennung Puffer, bis das Rohr bis zu 10 mL gefüllt ist.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösung langsam durch Pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr ohne Kappe in eine Trennung-Magnet.</li>
	<li>2,5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Gießen Sie langsam in eine konische Zentrifugenröhrchen 15 mL.</li>
	<li>In diesem Stadium Monozyten direkt verwenden (siehe Schritt 3: PBMCs und Monozyten Behandlungen und stimulierende Bedingungen) oder in ichMmature MoNocyte abgeleitet Dendritic CElls (iMoDCs) zu unterscheiden (siehe Schritt 4), oder frieren sie Sie zur späteren Verwendung (siehe Schritt 5).</li>
</ol>(3) PBMCs und Monozyten Behandlungen und stimulierende Bedingungen
<ol><li>Zellen zu zählen und in Kulturmedium zu verdünnen (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 10 % FBS + 1 mM Natrium Pyruvat + 100 U/mL Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) + 5 µM β-Mercaptoethanol), bis zu 1,25 x 104 Zellen/gut.</li>
	<li>Verteilen Sie 30 µL Zellsuspension pro Bohrloch von 384-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 15 µL 4 x konzentrierten zusammengesetzte Lösungen und Pre-Inkubation für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Hinzufügen von Lipopolysaccharid (LPS), eine Endkonzentration von 10 ng/mL, erschöpft Zymosan (DZ), eine Endkonzentration von 100 µg/mL oder in plain Medium halten.</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 µL des Überstands sekretierten TNF-a-Niveau messen (siehe Schritt 7: Zytokine und Lebensfähigkeit Messungen).</li>
</ol>(4) Monozyten Unterscheidung in iMoDCs und stimulierende Bedingungen
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 520 X g für 5 min und zählen Sie Monozyten (angereichert mit Schritt 2).</li>
	<li>Pipette aus der Überstand und fügen Kulturmedium (RPMI + 10 % FBS, eine endgültige Zellsuspension von 0,4 x 106 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 80 ng/mL rekombinanten menschlichen IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>5 mL Zellsuspension pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte zu verzichten.</li>
	<li>7 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Am 7.Tag ernten Sie Zellen durch Pipettieren sanft um die Aktivierung zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifuge bei 520 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Vakuum-Aspirat und in 50 mL Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren aufzuwirbeln.</li>
	<li>520 X g für 5 min Zentrifugieren und 1 x 106 Zellen/ml in Kulturmedium aufzuwirbeln.</li>
	<li>100 µL Zellsuspension (105 Zellen) pro Bohrloch einer 96-Well Flachboden-Platte zu verzichten.</li>
	<li>Pre-incubate für 1 h bei 37 ° C nach Zugabe von 50 µL 4 X konzentriert zusammengesetzte Lösungen, wie in Schritt 8 beschrieben: Vorbereitung Verbindungen.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Reize (4 X konzentriert), wie in Schritt 9 beschrieben.</li>
	<li>24 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Mischen Sie jeden Brunnen und Transfer Zellen und überstand (SN) in eine 96-Well-V-Boden-Platte.</li>
	<li>Spin-down bei 475 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Überstand in eine neue Flachboden 96-Well-Platte zu übertragen, zu versiegeln und Einfrieren bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>(5) Monozyten und PBMCs Einfrieren/Auftauen Verfahren
<ol><li>
Einfrieren
	<ol>
<li>Spin-down PBMC oder Monocyte Zelle Vorbereitungen bei 520 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Vakuum anzusaugen überstand und Aufschwemmen Zellen im eiskalten Medium 1 x 107 Zellen/ml.</li>
		<li>1 mL Zellsuspension in Cryoröhrchen zu verzichten, die Röhren auf eine spezifische Kühlvorrichtung übertragen (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auftauen
	<ol>
<li>Die Cryotube Auftauen und schnell seine Inhalte in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 9 mL Kulturmedium übertragen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 520 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Vakuum-Aspirat überstand und Zelle Pellet in 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln. Zellen sind nun bereit für weitere experimentelle Verarbeitung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Maus Milz Zellen Vorbereitung und Behandlung
Hinweis: Wir führten Tieropfer gemäß den Richtlinien und Normen von Novartis Animal Welfare Organization. Studien wurden von der Ethikkommission der regionalen staatlichen Behörde genehmigt (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Bei allen Anstrengungen unternommen, um Leiden zu minimieren haben wir Tiere von Isofluran Überbelichtung, geopfert.
<ol><li>Die Milz zu ernten und Gewebe mit einem Schlauch mit einer mechanischen Gewebe Mahlwerk ausgestattet und mit 5 mL kaltes RPMI Medium gefüllt zu distanzieren.</li>
	<li>Verwenden Sie das Milz-Programm der Dissoziation Maschine um Organe zu mahlen.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen durch ein 100 mm Nylon Zelle Sieb.</li>
	<li>Übertragen Sie die Aufhängung in 50 mL-Tuben und Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 320 X g.</li>
	<li>Vakuum-Aspirat überstand, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL eiskaltes Lyse Puffer und inkubieren ≤2 min auf Eis.</li>
	<li>Lyse durch Zugabe von 7 mL RPMI Medium zu stoppen.</li>
	<li>Erneut durch ein 100 µm Nylon Zelle Sieb filtern.</li>
	<li>Spin-down Zellsuspension bei 330 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Vakuum-Aspirat überstand und Aufschwemmen Zellen 11 x 106 Zellen/ml in kompletten Medium (RPMI ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Pen/Schritt und 5 µM β-Mercaptoethanol).</li>
	<li>Platte 1 x 106 Zellen/Well (90 µL) in eine 96-Well-Platte (Flachboden).</li>
	<li>Hinzufügen von 20 X 5 µL konzentriert zusammengesetzte Lösung zuvor in RPMI Medium verdünnt, wie unter Punkt 8.3 beschrieben: serielle Verdünnung für murine Milzzellen.</li>
	<li>30 min bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 5 µL 20-fach konzentrierter DZ (Endkonzentration 30 µg/mL) oder 20-fach konzentrierter LPS + IFN-g (TLR-4) (Endkonzentration 1 µM LPS und 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Zentrifuge bei 330 X g für 10 Minuten.</li>
	<li>Überstände in neue Platten zu übertragen, zu versiegeln und Einfrieren bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>(7) Zytokine und Lebensfähigkeit Messungen
<ol><li>
Menschlichen TNF-a Messung von HTRF (homogene Zeit gelöst Fluoreszenz) Hinweis: Das Protokoll hielt sich der Lieferant Empfehlungen, im folgenden kurz zusammengefasst.<ol>
<li>Mix 1-Volume wiederhergestellten Reagenzes (anti-TNF-a-Cryptate und Anti-TNF-a-XL665) mit 19 Bände der Rekonstitution Puffer (50 mM Phosphat-Puffer pH 7,0, 0.8 M Kalium Fluorid (KF), 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA)).</li>
		<li>Mischen Sie die beiden Lösungen der Ready-to-Use Antikörper 1:1 kurz vor Abgabe der Reagenzien.</li>
		<li>10 µL Überstände von 3.6 betreten weiß 384-Well-Platten zu verzichten.</li>
		<li>10 µL des Antikörper-Mix zu verzichten.</li>
		<li>Die Platte mit einer Versiegelung abdecken und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.</li>
		<li>Platte auf einer Mikrotestplatte Reader (50 – 200 Flash) zu lesen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschlichen IL-23-Messung von HTRF (homogene Zeit gelöst Fluoreszenz) Hinweis: Das Protokoll hielt sich der Lieferant Empfehlungen, im folgenden kurz zusammengefasst.<ol>
<li>Mischen Sie 1 Volumenteil wiederhergestellten Reagenz (anti-IL-23-Cryptate-Antikörper und Anti-IL-23 D2-Antikörper) mit 19 Bände der Detektionspuffer #3.</li>
		<li>Mischen Sie die beiden Lösungen der Ready-to-Use Antikörper 1:1 kurz vor Abgabe der Reagenzien.</li>
		<li>10 µL Überstände von 3.6 betreten weiß 384-Well-Platten zu verzichten.</li>
		<li>10 µL des Antikörper-Mix zu verzichten.</li>
		<li>Die Platte mit einer Versiegelung abdecken und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.</li>
		<li>Lesen Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Reader (50 – 200 nm Flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Menschlichen IL-6, IL-1β, IL-8 und TNF-α-Messungen von electrochemiluminescence Hinweis: Alle Proben wurden bei 1/150 diluent 2 verdünnt (ersten Verdünnung: 10 µL in 150 µL, dann 20 µL in 180 µL). Das Protokoll des Lieferers Empfehlungen gefolgt:<ol>
<li>Verdünnte Proben und Standard im Verdünnungsmittel 2.</li>
		<li>Fahren Sie mit Verdünnung des Standards in diluent 2 mit einer 1/4 serielle Falte Verdünnung.</li>
		<li>Waschen Sie Platten drei Mal mit Waschpuffer.</li>
		<li>50 µL von Proben oder Standard pro Bohrloch zu verzichten.</li>
		<li>2 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte viermal mit PBS + 0,05 % Polysorbat 20.</li>
		<li>25 µL Detektionsantikörper (60 µL jeder Antikörper für die letzten 3 mL) in Verdünnungsmittel 3 hinzufügen.</li>
		<li>2 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte viermal mit PBS + 0,05 % Polysorbat 20.</li>
		<li>Vermeidung von Luftblasen, 150 µL pro Bohrloch lesen Sie Puffer hinzufügen (Tris-Puffer mit Tripropylamine, verdünnt 2 X im DdH20) als Co Reaktionspartner für die Lichterzeugung in Electrochemiluminescence Immunoassays.</li>
		<li>Lesen Sie die Platte (ohne Verzögerung) auf ein Lesegerät, Multiplex-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus TNF-a Messung mittels ELISA nach dem Lieferanten-Protokolls
	<ol>
<li>Verdünnen Sie überstand 1:1 im Assay Verdünnungsmittel (gebrauchsfertig Protein-haltigen Puffer).<ol>
<li>Bereiten Sie standard Verdünnungen, Reagenzien und Proben, wie im Lieferumfang beschrieben. Jede Vertiefung 50 μl Assays Verdünnungsmittel hinzufügen.</li>
			<li>Fügen Sie 50 μL Standard, Kontrolle oder Probe pro Bohrloch.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Durch leichtes Klopfen Kennzeichenrahmen für 1 min mischen.</li>
		<li>Mit den mitgelieferten Klebestreifen abdecken und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie jeweils gut und waschen mit 400 μl/Well (wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal insgesamt).</li>
		<li>Entfernen Sie nach dem letzten Waschen alle verbleibenden Waschpuffer durch Absaugen.</li>
		<li>Invertieren der Plattenrandes und tupfen Sie gegen saubere Papiertücher.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL der Maus TNF-α-Konjugat in jede Vertiefung. Mit einem neuen Klebestreifen abdecken.</li>
		<li>2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Aspiration/Waschgang wie in Schritt 7.4.4.</li>
		<li>Jedes gut fügen Sie 100 μl Substratlösung hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Jedes gut 100 μl verdünnter Salzsäure-Lösung (Hand) hinzufügen. Klopfen Sie leicht die Platte, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten.</li>
		<li>Messung der Extinktion bei 450 nm (mit der Korrektur-Wellenlänge eingestellt auf 560 nm) mit einer Mikrotestplatte Leser (innerhalb von 30 Minuten erfolgen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellviabilität
	<ol>
<li>Nach dem Entfernen Überstände von PBMC oder Monocyte Zubereitungen, bewerten Sie Zellviabilität mit ein fertiges Resazurin Lösung (Oxidations-Reduktions-Indikator) direkt an die Zellsuspension auf 10 % Endkonzentration hinzugefügt.</li>
		<li>1 bis 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Lesen Fluoreszenz bei 590 nm (Anregung 540 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. zusammengesetzte Vorbereitung
<ol><li>
Serielle Verdünnung für iMoDCs
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die MLT-827-Stammlösung (10 mM in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in Medium, 8 µM in einem Rutsch (4 X konzentriert) zu erreichen.</li>
		<li>Führen Sie eine sechs-Schritt 1:5 serielle Verdünnung, mit Medium + 0,08 % DMSO. Verwenden Sie das gleiche Medium + 0,08 % DMSO-Lösung für den Zustand des Fahrzeugs (keine Verbindung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einzeldosis Tests für iMoDCs
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die MLT-827, AFN700 und Cpd11 auf Lagerlösungen in Mittel-bis 4 µM in einem Rutsch (4 X konzentriert) zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serielle Verdünnung für murine Milzzellen
	<ol>
<li>Verdünnen Sie eine 10 µM MLT-827-Lösung (gewonnen aus einer 10 mM Vorratslösung nach einer ein gehen Verdünnung im Medium) bis 0,01 µM mit einer DMSO-Ende-Konzentration von 0,1 %.</li>
		<li>Nehmen Sie für die Verdünnung Schritte 2 µL jeder Verdünnung, 38 µL RPMI, und Pipettieren 5 µL in den Brunnen. Hinweis: Alle Behandlungen sind in dreifacher Ausfertigung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Reize Vorbereitung
<ol><li>
Abgereichertem Zymosan (DZ)
	<ol>
<li>10 mg DZ. 2 mL sterilem Endotoxin-freies Wasser hinzufügen</li>
		<li>Wirbel um Vorratslösung Wirbel auch vor jedem Gebrauch homogenisieren.</li>
		<li>Aliquoten Lösung und Store Aliquote bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trehalose-6,6-Dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>1 mg TDB, Hitze bei 60 ° C in einem Wasserbad für 15-30 s 100 µL von DMSO hinzufügen.</li>
		<li>Wirbel und 900 µL steriler PBS, Wirbel wieder sofort hinzufügen.</li>
		<li>10 – 15 min. bei 60 ° C erhitzen und Homogenisieren von vortexen vor jedem Gebrauch.</li>
		<li>Halten Sie die Lösung bei 4 ° C.</li>
		<li>Durchführen Sie Verdünnungsreihen und Einzeldosis Vorbereitung für die MLT-827-Verbindung. Hinweis: Weil TDB in DMSO vorbereitet werden muss, ist eine 1 % DMSO Endkonzentration Zellstimulation anwesend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Arbeit verwendeten wir einfache experimentelle Einstellungen um Signalwege in der Human- und angeborene Mauszellen zu studieren und ihre Abhängigkeit von MALT1 proteolytischen Funktion zu verhören. Aufbauend auf früheren Arbeiten11, zeigte unsere Studie, dass MALT1 Paracaspase Aktivität C-Type Lektin-ähnlichen Rezeptoren induzierte Produktion von Zytokinen, einschließlich TNF-α steuert. Im Gegensatz dazu war TLR-4-induzierte TNF-α unabhängig von MALT1 in beiden Arten. Kollektiv, bestätig...

Die Paracaspase Aktivität von MALT1 (Mucosa-assoziierte Lymphgewebe Lymphom Translokation Protein 1) zeigte sich in 20081,2. Seit dieser Zeit haben eine Reihe von Studien ihren kritischen Beitrag zur Antigen-Rezeptor-Antworten in Lymphozyten berichtet. Genetische Modelle in der Maus sowie Pharmakologie Daten eine wichtige Rolle in T-Zellen, T-Zell-abhängigen Autoimmunität und B-Zell-Lymphom Einstellungen3,4unterstützen. In Lymphozyten, MALT1 Paracaspase Ansteuerung erfolgt bei der Montage eines CARD11-BCL10-MALT1 Komplex5, ausgelöst durch Antigen-Rezeptor proximalen signalisieren stromabwärts des T - oder B-Zell-Rezeptors. Es gibt auch genügend Beweise, dass ein ähnlicher CARD9-BCL10-MALT1-Komplex wichtig ist für die Vermehrung Signale unterhalb der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren (CLLR), z. B., Dectin-1, Dectin-2 und MINCLE in myeloische Zellen6,7. Dectin-1 ist besonders gut untersucht worden, weil dieser Weg für Host Verteidigung gegen Pilzinfektionen8,9entscheidend. Auswirkung von MALT1 in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Wege, ist jedoch umstritten10geblieben. Den letzten Beweis in menschlichen myeloische Zellen ausgeschlossen, eine direkte Rolle für MALT1 Paracaspase Aktivität in die Regulierung der TNF-Produktion flussabwärts von TLR-4-11.
In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir verschiedene experimentelle Einstellungen und stimulierende Bedingungen in Mensch und Maus myeloische Zellen um angeborene Signalwege Sonde unter Berufung auf spezifische pharmakologische Werkzeug-Inhibitoren und Messung der Produktion von Zytokinen.

<table><tbody><tr><td>100 &Mikro; m Nylon-Zellsieb</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Falcon Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 Well-Platten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 Well-Platte mit flachem Boden, mit Deckel mit geringer Verdampfung</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 Well V-Bodenplatte</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Assay Verdünnungsmittel RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>Assay Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>Zellkultur-Mikrotiterplatte, 384 Well, schwarz</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>Depleted Zymosan</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>jetzt: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alpha;</td><td>Forschung & Forschung D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Röhrchen</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Hitzeinaktiviertes</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF Rekonstitutionspuffer</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-& gamma;</td><td>Forschung & Forschung D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isofluran</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS zur Verwendung in menschlichen</td></tr><tr><td>Proben Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS zur Verwendung in murinen Proben</td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td>Selbstgemacht-155</td><td></td> <td>mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte, 384 Well, weiß</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Monozyten Anreicherungskit</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg; C Gefrierbehälter</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Kühlgerät (enthält Propanol-2)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Kaliumbicarbonat - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Resazurin-Lösung zur Viabilitätsbewertung</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Lesepuffer</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tris-basierter Puffer mit Tripropylamin</td></tr><tr><td>Rückgewinnung Zellkultur-Einfriermedium</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>Einfriermedium</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS für iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Natriumpyruvat + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-Mercaptoethanol für humane PBMC und Monozyten + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-Mercaptoethanol für murine Splenozyten</td></tr><tr><td>Trennpuffer</td><td>Self-made-PBS</td><td></td> <td>pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose-6,6-dibehenat</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polysorbat 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td></tr><tr><td>Viewseal Versiegelung</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Proinflammatorisches Panel 1 Human Kit</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>Elektrochemilumineszenz-Multiplex-Assay (IL-1&beta;, TNF-&alpha;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

myeloische angeborene signalisierung pathway verordnung von malt1 paracaspase tätigkeit

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Neben seiner Funktion in lymphoiden Zellen, die durch zahlreiche Studien behandelt wurden, Rolle die Paracaspase MALT1 auch eine wichtige in angeborene Zellen unterhalb der Muster-Erkennung-Rezeptoren. Am besten untersucht sind die Dectin-1 und Dectin-2 Mitglieder der C-Typ-Lektin-Like-Rezeptor-Familie, die eine SYK - und CARD9-abhängige Signalkaskade zu NF-κB Aktivierung in einem MALT1-abhängigen Weise zu induzieren. Propagieren Sie durch Kontrast, Toll-Like-Rezeptoren (TLR), z. B. TLR-4 NF-κB Aktivierung aber Signal über eine Kaskade von MYD88/IRAK-abhängige. Dennoch, ob MALT1 TLR-4 Signalisierung beitragen kann ist unklar geblieben. Den letzten deutet mit MLT-827, ein potenter und selektiver Inhibitor von MALT1 Paracaspase Aktivität, darauf hin, dass TNF-Produktion flussabwärts von TLR-4 in menschlichen myeloische Zellen unabhängig von MALT1, im Gegensatz zu TNF-Produktion flussabwärts von Dectin-1, das ist MALT1 angewiesen. Hier haben wir die selektive Einbeziehung von MALT1 in Mustererkennung Fernerkundung weiter, unter Verwendung einer Vielzahl von Mensch und Maus zellulären Präparate und Stimulation der Dectin-1, MINCLE oder TLR-4 Bahnen. Wir lieferten auch zusätzliche Erkenntnisse durch die Zytokine TNF-Erforschung und durch den Vergleich von MLT-827 ein SYK-Inhibitor (Cpd11) und ein IKK-Inhibitor (AFN700). Gemeinsam zur Verfügung gestellten Daten weitere Beweise für die MALT1-Abhängigkeit der C-Art Lectin-Like Rezeptor-Signalisierung im Gegensatz zu TLR-Signalisierung.

In myeloische Zellen Relais MALT1 Aktivierung Signale unterhalb der mehrere C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, wie z. B. Dectin-1, Dectin-2 und MINCLE6. Diese Wege verlassen sich auf (Saum) ITAM Motiv-haltigen Rezeptoren (z. B., Dectin-1) oder ITAM Motiv-haltigen Co-Rezeptoren (z. B., FcRγ für Dectin-2 und MINCLE), das rekrutieren und aktivieren die Kinase SYK (Abbildung 1). Dies führt zu einer Aktivierung von einem Protei...

MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Das Ziel der Methode in unserem Manuskript ist es also, eine vergleichende Analyse der Signalwege in myeloischen Zellen mit Hilfe von Menschen- und Maussystemen zu ermöglichen. Es hilft zu definieren, welcher Signalweg nach dem Vorbild ausgewählter Mustererkennungsrezeptoren beteiligt ist. Diese Methode ist also einfach zu implementieren.Es stützt sich auf primäre Zellpräparate und validierte Referenzverbindungen, die für die Aufklärung von Signalmechanismen unerlässlich sind. Demonstriert wird das Verfahren von Ratiba Touil und Adeline Unterreiner, bzw. Wissenschaftlerin und wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserer Gruppe. In einer laminaren Fließhaube wurde eine sterile Schere, ein Ein-Liter-Becher und eine Plastiktüte aufgestellt.Legen Sie den zuvor erhaltenen Buffy-Mantel in den Becher und verwenden Sie die Schere, um es vorsichtig zu öffnen. Mit einer 25-mm-Pipette 100 ml PBS hinzufügen, ergänzt mit 2 Millimolar EDTA. Mischen Sie durch langsames Pipettieren nach oben und unten.Und dann 25 ml der verdünnten Buffy-Schicht in sechs 50 ml konische Zentrifugenröhrchen geben, die jeweils mit 15 ml Polysaccharid-basiertem Dichtegradienten vorgefüllt wurden. Zentrifugieren Sie die Rohre für 20 Minuten bei 800 g mit moderater Beschleunigung ohne Bruch, um eine Trennung der Zellen auf der Grundlage ihrer Dichte zu ermöglichen. Nach der Zentrifugation werden drei Schichten sichtbar sein, ein Pellet mit roten Blutkörperchen und Granulozyten, eine obere Schicht aus Plasma und ein weißer Ring, der periphere mononukleäre Blutzellen enthält.Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die PBMC-Ringe zu ernten und in eine neue 50 ml Tube zu übertragen. Aufladen mit PBS und EDTA. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Wäbungen mit abnehmender Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit durch, wie im Textprotokoll beschrieben.Nach der letzten Wäsche das Pellet in 25 ml eiskalter Lysepuffer wieder aufsetzen, um die roten Blutkörperchen durch osmotischen Druck zu lysen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur, bis klar wird. Fügen Sie dann 25 ml Trennpuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.Zentrifuge bei 150 g für acht Minuten, um die Lösung zu waschen. Den Überstand abgießen und das Pellet mit Trennpuffer wieder aufhängen. Nach dem Zählen der Zellen, verdünnen Sie sie in Kulturmedium bis zu 12, 500 Zellen pro Brunnen.Verteilen Sie 30 ml dieser Zellsuspension in jeden Brunnen einer 384 Brunnenplatte. Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter viermal konzentrierte Zusammengesetzte Lösungen zu jedem Brunnen und preinkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Auf Wunsch entweder LPS zur Endkonzentration von 1 ng pro ml oder dezimiertes Zymosan auf eine Endkonzentration von 100 mcg pro ml.Dann inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag nehmen Sie 10 Mikroliter des Überstandes, um die abgesonderten TNF-Alpha-Spiegel zu messen. Um die serielle Verdünnung zu beginnen, verdünnen Sie die MLT-827-Stammlösung mit Medium, um eine Konzentration von 8 Mikromolaren in einem Rutsch zu erreichen.Führen Sie eine sechsstufige 1:5-Serienverdünnung mit Medium mit 0,08%DMSO durch. Zur Vorbereitung auf Einzeldosis-Tests, verdünnen Sie die MLT-827, AFN700, und zusammengesetzt 11 Stock-Lösungen mit Medium, um eine Konzentration von 4 Mikromolar in einem Rutsch zu erreichen. Fügen Sie zunächst 2 ml steriles Endotoxin-freies Wasser zu 10 mg dezimiertem Zymosan hinzu.Vortex diese Lagerlösung, um sie zu homogenisieren. Aliquot die Lösung und dann speichern Sie die Aliquots bei 20 Grad Celsius. In dieser Studie werden menschliche PBMCs und Mausmilzzellen entweder mit dezimiertem Zymosan, einem Dectin-1-Agonisten, oder Lipopolysaccharid, einem TL4-Agonisten, stimuliert.DIE NTNF-Alpha-Freisetzung im Überstand wird nach 20 Stunden gemessen. Sowohl in den Human- als auch in der Maus-Assays blockiert die MLT-827-Verbindung selektiv die TNF-Alpha-Produktion, die durch den Dectin-1-Signalweg, aber nicht durch den TLR4-Signalweg angetrieben wird. In Monozyten, die mit LPS stimuliert werden, wird die Produktion von TNF alpha fast vollständig durch AFN700 aufgehoben, aber es ist nicht empfindlich gegenüber Cpd11, was mit der Abhängigkeit des TLR4-Pfades von Der NF-kappa B-Aktivität und seiner Unabhängigkeit von SIC-Aktivität übereinstimmt.Im Gegensatz dazu zeigt die Von-Dectin-1- und MODCs angetriebene TNF-Alpha-Produktion eine Empfindlichkeit gegenüber MLT-827, AFN700 und Cpd11. Dies liefert weitere Beweise für die Beteiligung einer SIC CBM-Signalkaskade im Dectin-1-Signalweg. Die Produktion von IL-1 beta, IL-6 und IL-23 ist auch empfindlich auf die drei Inhibitoren, was auf Regulatorische Mechanismen ähnlich TNF alpha hinweist.Die begrenzte Wirkung auf die Produktion von IL-8 deutet jedoch darauf hin, dass dieses Zytokin einen eigenen Regulierungsmechanismus hat. Die Anhebung der Trehalose-Dibehenat-Konzentrationen über 50 mcg pro ml führt zur Produktion von TNF alpha, IL-6 und IL-1 beta, die auf MALT1 Paracaspase-Aktivität nach der blockierenden Wirkung von MLT-827 beruhte. Ähnliche Ergebnisse wurden gesehen, wenn die MODCs mit zunehmenden Konzentrationen von erschöpftem Zymosan herausgefordert wurden, um Dectin-1 zu stimulieren.Diese Methode ermöglichte es zu zeigen, dass die Paracaspase MALT1 selektiv die C-Typ-Lectin-ähnliche Rezeptor-Signalisierung reguliert. Es ist wichtig, gut charakterisierte Referenzverbindungen zu verwenden. Achten Sie auf das Verfahren zur Verdünnung von Lagerlösungen.Dies ist entscheidend für Verbindung mit begrenzter Löslichkeit.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Sialidase-Test ist eine einfache technische Ansatz, der neuartige molekulare Mechanismus (s) der TLR-Sensoren von mikrobiellen Infektionen und die Beteiligung an entzündlichen Erkrankungen an der Rezeptor-Ebene auf der Zelloberfläche von Live-Makrophagen aufzuklären wird.

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung...

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.

Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Erfahren Sie die Regulation der MALT1-Paracaspase-Aktivität in myeloischen Zellen durch angeborene Signalwege. Diese Methode nutzt humane PBMCs und Mauszellpräparate zur Analyse zytokinbasierter Immunantworten.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

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