Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow
18. Oktober 2018
Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z. B. wie Der Flüssigkeitsfluss das Wachstum und die Entwicklung von Pilzbiofilmen verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Flusses auf das Wachstum und die Entwicklung von Biofilmen in Echtzeit quantitativ zu bewerten. Beginnen Sie dieses Experiment mit der Montage des Strömungsgeräts, wie im Textprotokoll beschrieben.
Befestigen Sie am Tag des Experiments die Blasenfalle, die Temperatursonde und alle Einzelkomponenten. Um den Filter zu montieren, entfernen Sie den Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze, um ihn zu einem Adapter zu machen. Zwingen Sie die Schläuche aus der Filterflasche in dieses Ende und befestigen Sie einen 2 Mikron Filter an den Schläuchen, die zum Wachstumskolben führen.
Tragen Sie Silikonvakuumfett um die Widerhaken des Schiebeadapters auf, bevor Sie ihn anschließen, da dies hilft, Luftlecks in das System zu verhindern. Füllen Sie den Befestigungskolben mit 100 Milliliter YPD und füllen Sie den Wachstumskolben mit 200 Milliliter yPD. Stellen Sie sicher, dass der grüne Seitenschlauch die Medien in jedem Kolben erreicht.
Stellen Sie sicher, dass alle Ventile geöffnet sind. Befestigen Sie die Blasenfalle an einem Vakuum, und schließen Sie die Pumpe an den grünen Seitenschlauch nach der Blasenfalle an. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliter pro Minute, um die grüne Seite vollständig zu füllen.
Dann geben und entsorgen Sie etwa ein bis zwei Milliliter der Medien, da die ersten Paar Milliliter oft abgestorbene Zellen oder zufällige Trümmer enthalten. Stellen Sie sicher, dass die grüne Seite des Schlauches mit Medien gefüllt ist und keine Blasen unterhalb der Blasenfalle hat, bevor Sie fortfahren. Füllen Sie den Kanalschlitten und das Reservoir mit YPD, wobei Darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen.
Schließen Sie die Folie an das Durchflussgerät an. Dann pumpen Sie mehr Flüssigkeit, um einen Puffer von etwa 5 Metern auf der orangen Seite zu schaffen. Dadurch soll verhindert werden, dass bei Rückfluss versehentlich Luft in der Rutsche eingefangen wird.
Bereiten Sie nun das Strömungsgerät für den Transport zum Mikroskop vor, indem Sie zuerst den Ein- und Auslass der Blasenfalle geschlossen pflanzen. Dann klemmen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungsventile geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Schraubverschlüsse für den Pulsationsdämpfer und die Filterflasche dicht sind, da sie sich während der Autoplatierung lösen können.
Trennen Sie die Pumpe von den Schläuchen, um den Transport zu erleichtern. Dann verschieben Sie alle Komponenten, einschließlich des Heißplattenrührers, in einen sekundären Behälter in der Nähe des Mikroskops. Befestigen Sie den Temperaturfühler am Heißplattenrührer und beginnen Sie mit dem Erhitzen des Befestigungskolbens auf 37 Grad Celsius.
Rühren Sie die Medien bei 300 RPM, und halten Sie dies für das gesamte Experiment aufrecht. Montieren Sie das Dia am Mikroskop, und verwenden Sie ggf. Klebeband, um es fest zu befestigen. Befestigen Sie dann die Blasenfalle an einem Vakuum.
Schließen Sie nun die Pumpe an das Durchflussgerät an. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliterpro Minute, und lassen Sie sie etwa fünf bis zehn Sekunden laufen. Dann entfernen Sie die Blasenfalle im ausgelassenen Deckel-Clan.
Lassen Sie die Pumpe weiterlaufen, während sich der Befestigungskolben erwärmt. Sobald der Befestigungskolben und die Inkubationskammer bei 37 Grad Celsius sind, fügen Sie genügend Nachtkultur der Pilzzellen zum Befestigungskolben hinzu, um eine Million Zellen pro Milliliter zu erreichen. Warten Sie 15 Minuten, damit sich die Zellen akklimatisieren.
Öffnen Sie sowohl grüne als auch orange Seitenbefestigungsventile, während Sie beide Wachstumskolbenventile schließen, um den Zellfluss zu starten. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis Zellen die Folie erreichen können. Während dieser Zeit konzentrieren Sie das Mikroskop und passen Sie es an die gleichen bildgebenden Parameter an, die in früheren Experimenten verwendet wurden.
Beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Anlagenphase. Überprüfen Sie nach etwa fünf und zehn Minuten, um sicherzustellen, dass der Fokus beibehalten wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, versuchen Sie, den Fokus unmittelbar nach dem Abgleich des nächsten Bildes anzupassen.
Speichern Sie die Datei unmittelbar nach Abschluss der Anlagenphase. Öffnen Sie dann sowohl grüne als auch orange Seitengmuschelventile, während Sie beide Befestigungskolbenventile schließen. Achten Sie darauf, die Bühne nicht zu stoßen, wenn sich Ventile in der Inkubationskammer befinden.
Ziehen Sie die Thermometersonde ab, und ersetzen Sie den Befestigungskolben durch den Wachstumskolben. Konfigurieren Sie nun die Software so, dass sie alle 15 Minuten über 22 Stunden ein Bild abruft, und beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Wachstumsphase. Sobald die Erfassung der Wachstumsphase abgeschlossen ist und die Datei gespeichert wurde, öffnen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungskolbenventile, die ein Geräusch machen können, wenn der Druck auf der orangen Seite abgibt.
Ziehen Sie auf den grünen Seitenschläuchen, die von beiden Medienkolben kommen, bis sie mindestens mehrere Zentimeter über den Medien liegen. Führen Sie dann die Pumpe mit hoher Geschwindigkeit aus, um alle Medien aus dem Schlauch zu entfernen, was die Reinigung erheblich erleichtert. Schließlich quantifizieren Sie die Videos, wie im Textprotokoll beschrieben.
Dieses Zeitraffer-Dunkelfeldmikroskopie-Video zeigt die Befestigung von Wild-Candida-Albican-Zellen an den Substratunterlauf während der Anhaftungsphase, gefolgt von dem anschließenden Wachstum und der Entwicklung während der Wachstumsphase, die zur Biofilmbildung führt. Die Daten aus diesen Videos können für die Raten der Zellanhaftung und Ablösung und Biomasse im Laufe der Zeit analysiert werden, hier zeigt die gesamte Biomasse innerhalb des Bildgebungsbereichs, die durch densitometrie-Analyse bestimmt wird. Die kumulative Rate der Zellanhaftung und die prozentuale Biomasseablösung im Laufe der Zeit werden ebenfalls angezeigt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die gleichen bildgebenden Bedingungen für alle Experimente zu verwenden, da dies quantitative Vergleiche zwischen ihnen ermöglicht.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Durchflussapparatur, die für die Echtzeit-Bildgebung der Pilz-Biofilmbildung unter Durchflussbedingungen konzipiert ist. Außerdem werden quantitative Algorithmen zur Analyse der gewonnenen Bilder erörtert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Biofilmforschung
- Strömungsdynamik
Hintergrund
- Pilz-Biofilme sind in verschiedenen ökologischen und klinischen Zusammenhängen von Bedeutung.
- Das Verständnis, wie Strömungsverhältnisse die Biofilm-Entwicklung beeinflussen, ist für die Mikrobiologie entscheidend.
- Echtzeit-Bildgebungsverfahren können Einblicke in die Dynamik von Biofilmen liefern.
- Die quantitative Analyse von Bildern kann das Verständnis von Biofilm-Wachstumsmustern vertiefen.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen von Fluidströmung auf das Wachstum von Pilz-Biofilmen.
- Bereitstellung einer Methode zur Echtzeitbeobachtung der Biofilmbildung.
- Entwicklung von Algorithmen zur quantitativen Analyse von Bildgebungsdaten.
Verwendete Methoden
- Aufbau einer Durchflussapparatur zur Bildgebung.
- Montage von Komponenten wie einer Blasenfalle und einer Temperatursonde.
- Verwendung eines Filtersystems zur Steuerung des Fluidflusses.
- Anwendung quantitativer Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder.
Hauptergebnisse
- Die Strömungsvorrichtung bildete erfolgreich die Bildung von Pilz-Biofilmen ab.
- Echtzeitdaten ermöglichten Einblicke in das Biofilmwachstum unter wechselnden Strömungsbedingungen.
- Quantitative Algorithmen erlaubten eine detaillierte Analyse der Biofilm-Entwicklung.
- Die Methode zeigte Vorteile gegenüber herkömmlichen Bildgebungsverfahren auf.
Schlussfolgerungen
- Die Strömungsapparatur eignet sich zur Untersuchung von Pilz-Biofilmen.
- Die Echtzeit-Bildgebung kann die mikrobiologische Forschung erheblich voranbringen.
- Die quantitative Analyse ist entscheidend für das Verständnis der Biofilmdynamik.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der Dynamik von Pilz-Biofilmen unter kontrollierter Strömung und schließt damit eine wichtige Lücke beim Modellieren von Wirt-Pathogen-Interaktionen unter physiologischem Scherstress. Durch die Bereitstellung von Anheftungs- und Ablösekinetiken sowie Biomasse-Messungen unterstützt es die mechanistische Risikominimierung bei der Validierung von antifungalen Zielstrukturen in der präklinischen Forschung. Das kostengünstige, mikroskopkompatible Design ermöglicht eine breite Anwendung in verschiedenen Forschungslaboren für reproduzierbare Biofilm-Phänotypisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung, wie Strömungsverhältnisse die Pilzadhäsion und Biofilmbildung beeinflussen, und liefert Erkenntnisse zur Zielrelevanz in Modellen von Schleimhautinfektionen.
- Operativer Wert: Bietet Echtzeit- und quantifizierbare Messgrößen für Anheftungs- und Ablöseraten von Zellen unter Scherbelastung und unterstützt damit hypothesenbasierte Targetscreens.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt zeitlich aufgelöste Daten zu Biomasse und Ablösung mittels Densitometrie und ermöglicht den quantitativen Vergleich von Wildtyp- und Mutantenstämmen unter Flussbedingungen.
- Operativer Wert: Kompatibel mit gängigen Lichtmikroskopen, wodurch eine skalierbare und kostengünstige Implementierung für Screening-Kampagnen von antimykotischen Verbindungen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert strömungsbedingte Bedingungen der oropharyngealen Candidiasis und verbindet damit in-vitro-Befunde mit klinischem Biofilmbewegungsverhalten unter Speichel-Scherkräften.
- Operativer Wert: Unterstützt die longitudinale Biofilm-Bildgebung (bis zu 22 Stunden) und ermöglicht die zeitliche Analyse der antimykotischen Wirksamkeit und der Entwicklung von Resistenzen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Vorrichtung passt in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung und liefert strömungsangepasste phänotypische Daten, um Targets vor der Verbindungsscreening zu entlasten.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die mechanistische Untersuchung von Adhäsionswegen und Biofilmregulatoren unter physiologisch relevanten Flussbedingungen und klärt die Zielfunktion in Infektionskontexten.
- Screening: Stellt standardisierte, quantitative Biofilm-Metriken (Anheftungsrate, Ablösungsprozent, Biomasse über die Zeit) für reproduzierbare Wirkstoff-Screenings unter dynamischen Bedingungen bereit.
- Analytik: Ermöglicht die dichtebasierte Quantifizierung der Biomasse und die kinetische Analyse von Anheftung/Ablösung, was einer datengestützten Priorisierung von Wirkstoffkandidaten dient.
- Translationale Forschung: Modelliert menschenrelevante Scherkräfte in der Mundschleimhaut und verbessert so die Vorhersagekraft präklinischer Biofilmmodelle für die Entwicklung von Antimykotika.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Für die mehrfache Nutzung mit modularen Komponenten konzipiert, ermöglicht dies die Standardisierung in verschiedenen Laboren und Projekten zur Untersuchung mikrobieller Adhäsion unter Flussbedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei der Validierung von antifungalen Zielstrukturen, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit strömungsabhängigen Biofilm-Phänotypen verknüpft werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Strömungsraten, Bildgebungsbedingungen und quantitative Analyseprotokolle über verschiedene Experimente hinweg sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Abbruch durch frühzeitige Wirksamkeitsdaten unter Berücksichtigung der Strömungsbedingungen im Biofilm und reduziert späte Fehlschläge aufgrund unzureichender Relevanz des Targets in dynamischen Wirtsumgebungen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antifungalen Wirkstoffkandidaten basierend auf ihrer Leistung unter Scherbelastung, wodurch die klinischen Infektionsnischen besser abgebildet werden.
Umsetzungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrofluidischen Aufbauten, sterilen Techniken und Zeitraffermikroskopie für einen konsistenten Betrieb.
- Benötigt ein Lichtmikroskop mit stabilem Objekttisch, Temperaturkontrolle (37 °C) und einer peristaltischen Pumpe mit einer Förderleistung von 3,3 mL/min.
- Setzt eine standardisierte Abstimmung der Bildgebungsparameter (Fokus, Beleuchtung, Aufnahmeintervall) über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus, um quantitative Vergleiche zwischen einzelnen Durchläufen zu ermöglichen.
- Die Anpassung an Nicht-Candida-Arten oder alternative Kulturmedien kann eine Optimierung der Durchflussraten und der Oberflächenchemie erfordern, um Verstopfungen oder Biofouling zu vermeiden.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählt die geringe Durchsatzkapazität aufgrund der manuellen Präparation der Objektträger und der begrenzten Bildgebungsareale, wodurch das Verfahren für primäre Hochdurchsatz-Screenings ungeeignet, jedoch ideal für mechanistische Folgeuntersuchungen ist.
