Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K
11. Januar 2019
Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.
Dysregulierte Redox-Signalisierung ist in die Pathogenese verschiedener Krankheiten involviert. Das Studium der Redoxbiologie erfordert den genauen Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies in verschiedenen Zell- und Gewebekompartimenten. Die EPR-Spektroskopie ist die einzige Methode, die freie Radikale eindeutig misst.
Dieses Protokoll zeigt eine praktische Methode zur Handhabung und Lagerung von biologischen Proben für die EPR-Spektroskopie. Diese Protokolle veranschaulichen die Verwendung von EPR und Spinsonden in zwei repräsentativen Modellen. Obwohl sie angepasst werden können, um die aktiven Arten in anderen biologischen Umgebungen zu bewerten.
Das Design des Experiments und der Umgang mit der Probe sind entscheidend für ihre Reproduzierbarkeit. Wir empfehlen, die Zelldichte zu berücksichtigen und geeignete zeitgerechte Kontrollen sicherzustellen. Beginnen Sie damit, roh 264,7 Zellen mit einem Milliliter Krebs-Henseleit-Puffer oder KHB pro Brunnen sanft zu waschen.
Und behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikroliter KHB, ergänzt mit 100 Mikromil DTPA pro Brunnen. Um mit Superoxid-Dismutase zu pretreat, fügen Sie 15 Mikroliter Superoxid-Dismutase-Lager, oder Fahrzeug, zu jedem Brunnen, und legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Superoxid-Dismutase-Vorbehandlung 12,5 Mikroliter 10 Millimolar CMH und 40 Mikroliter 125 Mikromolar PMA Arbeitslösung zu den entsprechenden Brunnen hinzufügen, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten.
Die Platten sofort auf Eis legen und den Puffer von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Rohre auf Eis sammeln. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter frischekhB plus DTPA zu jedem Brunnen hinzu und kratzen die Zellen vorsichtig von der Unterseite jedes Brunnens. Dann die Zellsuspensionen mit Pipetten wieder aufhängen und die Zellen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren auf Eis übertragen.
Zur Superoxiddetektion bei Raumtemperatur zunächst 50 Mikroliter eines Puffers oder einer Zellprobe in ein Kapillarrohr laden und das Rohr versiegeln. Legen Sie das Rohr sofort in das Elektronen-Paramagnetresonanz- oder EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Raumtemperaturmessungen fest. Testen Sie immer eine leere Pufferprobe, die die gleiche Konzentration der Sonde enthält, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie eine Kontrolle behandelt wird.
Für die Superoxiddetektion bei 77 Grad Kelvin 150 Mikroliter einer Probe in ein ein bis zwei Zoll großes Stück gerades Polytetrafluorethylen oder PTFE,-Schläuche, mit einem Gummistopfen an einem Ende laden. Versiegeln Sie das andere Ende des Rohres mit einem zweiten Stopfen und blitzen Sie die Probe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Entfernen Sie dann schnell die Stopfen und legen Sie die PTFE-Schläuche in ein beschriftetes Kryotube für die Lagerung flüssigen Stickstoffs.
Für EPR-Messungen den Fingerdewar des EPR-Spektrometers mit flüssigem Stickstoff füllen und den PTFE-Schlauch, der die Probe enthält, in den flüssigen Stickstoff geben. Legen Sie den Fingerdewar in das EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Messungen auf 77 Grad Kelvin fest. Für den ROS-Nachweis im gefrorenen Lungengewebe legen Sie das Gewebe auf Trockeneis und verwenden Sie eine Pinzette, um das blitzgefrorene Gewebe auf Trockeneis zu stabilisieren.
Schneiden Sie die Probe in fünf 15 Milligramm Stücke, und wiegen Sie die Stücke in einem geteerten 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie 196 Mikroliter KHB plus DTPA und vier Mikroliter CMH in die Probe ein, und inkubieren Sie die Lungenprobe für eine Stunde in einem 37 Grad Celsius Wasserbad, bevor Sie die Gewebefragmente mit einer kurzen Zentrifugation granulieren. Dann legen Sie die Probe auf Eis, bevor Sie 150 Mikroliter des Überstandes in ein Stück PTFE-Schläuche für das Einfrieren von Blitzen in Vorbereitung der EPR-Messung übertragen, wie gerade gezeigt.
Die Auswertung der gesamten Superoxidproduktion in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert wurden, wie gezeigt, zeigt, dass die Nitroxidkonzentration sowohl in der Zellsuspension als auch im Puffer der PMA-behandelten Zellen aufgrund der durchlässigen Natur und des schnellen Gleichgewichts der Spinsonde ähnlich ist. Das Signal der Nitroxidradikale erhöht sich in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert werden, im Vergleich zu Kontrollzellen, aber nicht in Zellen, die mit zellunperinabler Superoxiddismutase vorbehandelt sind. Die Konzentration von Nitroxid, die bei niedrigen Temperaturen in rohen 264,7 Zellen nach Stimulation mit PMA gewonnen wird, wird auch in Gegenwart von Superoxiddismutase im Einklang mit den Raumtemperaturdaten abgeschwächt.
Die Nitroxidkonzentration wird im Blut und bronchoalveolar Spülflüssigkeit von Bleo-Mäusen und behandelten Mäusen sowie innerhalb der Überwältigungen von geernteten Lungengewebestücken von Bleo-Mäusen und verletzten Tieren im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollen erhöht. Darüber hinaus zeigen Bleo-Mäuse und behandelte Tiere nach retroorbitaler Spinsondeninjektion ein höheres Spinsondensignal im Vergleich zu Kontrollen. Diese praktischen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Produktion freier Radikale in verschiedenen Zellkompartimenten und biologischen Proben durch EPR zu testen, einschließlich Niedrigtemperaturmessungen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine praktische Methode zur Sammlung und Handhabung biologischer Proben für die Elektronenspinresonanz-(EPR-)Spektroskopie vor. EPR ist eine einzigartige Technik zur eindeutigen Messung von freien Radikalen, die in der Redoxbiologie von entscheidender Bedeutung sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Redoxbiologie
- Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie
- Nachweis freier Radikale
Hintergrund
- Störungen der Redox-Signalübertragung stehen in Verbindung mit verschiedenen Erkrankungen.
- Die genaue Nachweisung reaktiver Sauerstoffspezies ist in der biologischen Forschung unerlässlich.
- Die EPR-Spektroskopie ist die einzige Methode, die eindeutige Messungen von freien Radikalen ermöglicht.
- Diese Studie konzentriert sich auf Handhabungs- und Lagerprotokolle für biologische Proben.
Zweck der Studie
- Eine praktische Methode zur Probenentnahme für die EPR-Spektroskopie demonstrieren.
- Die Verwendung selektiver Spinproben in biologischen Systemen veranschaulichen.
- Protokolle bereitstellen, die an verschiedene biologische Modelle angepasst werden können.
Verwendete Methoden
- Sammlung biologischer Proben für EPR-Messungen.
- Verwendung selektiver Spinproben zur Detektion freier Radikale.
- Protokolle zur Probenvorbereitung und -lagerung.
- Anwendung der Methoden in repräsentativen biologischen Modellen.
Hauptergebnisse
- Die Protokolle erleichtern effektiv die Handhabung und Lagerung von Proben.
- Die EPR-Spektroskopie liefert zuverlässige Messungen von freien Radikalen.
- Spinproben können an verschiedene biologische Kontexte angepasst werden.
- Die Studie zeigt die Vielseitigkeit der EPR in der Redoxbiologie auf.
Schlussfolgerungen
- Die EPR-Spektroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von freien Radikalen.
- Eine sachgemäße Probenhandhabung ist entscheidend für genaue Messungen.
- Die vorgestellten Methoden können die Forschung in der Redoxbiologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die genaue Detektion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ist entscheidend für das Verständnis der Redox-Signalübertragung bei Krankheitsmechanismen und der Validierung von Zielstrukturen. Die Elektronenspinresonanz-(EPR-)Spektroskopie ermöglicht eine eindeutige, direkte Messung von freien Radikalen und unterstützt so die Absicherung von Wirkmechanismen in der frühen Forschung. Diese Methode erhöht die Vorhersagegenauigkeit, indem sie eine kompartimentenspezifische Quantifizierung von ROS in zellulären und Gewebemodellen erlaubt und damit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in präklinischen Programmen unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Nachweis physiologischer Konzentrationen spezifischer ROS-Spezies mit hoher Spezifität.
- Operationaler Wert: Unterscheidet extrazelluläres von cytosolischem Superoxid unter Verwendung zellpermeabler Sonden und SOD-Kontrollen und klärt so die Beteiligung spezifischer Signalwege.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Entschärfung von Risiken durch quantitative, kompartimentenspezifische Superoxid-Messungen in krankheitsrelevanten Modellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows durch standardisierte Spinmarkierung und Probensicherung vor.
- Reproduzierbarkeit: Ermöglicht die Probenaufbewahrung bei -80 °C und Analyse bei 77 K und gewährleistet somit konsistente EPR-Messungen über Chargen und Standorte hinweg.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die zuverlässige Wirkstoffbewertung, indem der Transfer und die Wiederverwendung von gefrorenen Proben für Hochdurchsatz-Screenings ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Nachweis von Superoxid in Lungengewebe, Blut und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit aus Verletzungsmodellen, was die translationale Abstimmung von Biomarkern unterstützt.
- Präklinische Kontinuität: Verknüpft in-vitro-Ergebnisse mit in-vivo-Modellen durch identische Detektionsstrategien für Spinproben (z. B. CPH, mito-TEMPO-H).
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet Fortschrittsentscheidungen ein, indem die Zielinteraktion durch ROS-Modulation in relevanten pathophysiologischen Kontexten bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die EPR-Spektroskopie ist in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Validierung eingebettet und liefert eine orthogonale Bestätigung mechanismenbasierter Effekte auf die Redoxsignalgebung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung von Superoxid in spezifischen zellulären Kompartimenten unter Verwendung selektiver Spinproben und enzymatischer Kontrollen.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Probenvorbereitung und Kryokonservierung, wodurch konsistente Messungen freier Radikale über verschiedene Substanzbibliotheken hinweg ermöglicht werden.
- Analytik: Erzeugt quantitative Nitroxid-Signale, die proportional zur Superoxidkonzentration sind, und ermöglicht somit den Vergleich verschiedener Bedingungen sowie die Auswertung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in überstandenen Gewebeproben und biologischen Flüssigkeiten aus Krankheitsmodellen nachgewiesen werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Redox-Profilanalyse über verschiedene therapeutische Bereiche hinweg und reduziert so redundante Methodenentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die eindeutige Nachweisführung von freien Radikalen und verringert damit die mechanistische Unsicherheit bei der Validierung von Redoxwegen.
- Operativer Wert: Stellt durch standardisierte Spin-Proben-Kinetik, kontrollierte Probennahme und Optionen zur Messung bei niedrigen Temperaturen die Reproduzierbarkeit sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem direkte Belege für eine zielvermittelte Modulation reaktiver Sauerstoffspezies geliefert werden und dadurch die Ausschussrate in späteren biologischen Entwicklungsstadien sinkt.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem die mechanistische Zuverlässigkeit von Wirkstoffen in krankheitsrelevanten Systemen bestätigt wird.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Expertise in der EPR-Spektroskopie und der Chemie von Spinproben für eine korrekte Auswahl der Proben und Interpretation der Daten.
- Hängt von der Verfügbarkeit eines EPR-Spektrometers ab, das sowohl Messungen bei Raumtemperatur als auch bei 77 K ermöglicht.
- Erfordert standardisierte Protokolle für Zelldichte, Inkubationszeiten und passende Kontrollen, um den Vergleich der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme (z. B. kultivierte Zellen vs. Lungen Gewebe) hinsichtlich der Probenapplikation und der Gewebeaufbereitung.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit spezieller Schläuche, die bei kryogenen Temperaturen stabil sind, sowie eine sorgfältige Handhabung, um eine Zersetzung der Spinproben zu vermeiden.
