Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im molekularen und zellulären Bereich zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung homologe Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie genau, zuverlässig und weit verbreitet ist. Diese Methode kann also Einblicke in die Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie genetisch veränderte Zellen oder Tiere. Im Allgemeinen wird einzelne neue dieser Methode kämpfen, weil es lange dauert und mehrere Schritte umfasst. Mischen Sie für jede gDNA 30 Mikroliter 10 x Puffer für DRA eins, drei Mikroliter DRA eins und 10 Mikrogramm gDNAs pro Probe.

Fügen Sie Wasser hinzu, bis das endgültige Volumen 30 Mikroliter beträgt, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht, um die gDNAs zu verdauen. Bereiten Sie ein 1%Agarose Elektrophorese Gel mit Ethidiumbromid. Laden Sie die zuvor erworbenen Proben zusammen mit einer KB-Leiter auf das Gel und führen Sie es mit 30 bis 40 Volt über Nacht.

Am nächsten Tag das Gel in einem Tablett mit einer 0,2 Newton Salzsäurelösung einweichen. Verwenden Sie einen Shaker, um das Tablett bei Raumtemperatur 20 Minuten lang sanft zu schütteln. Übertragen Sie das Gel in ein Tablett, das eine DNA-Denaturierungslösung enthält.

Schütteln Sie es vorsichtig für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dann das Gel in ein Tablett mit einer DNA-Neutralisationslösung geben. Und schütteln Sie es vorsichtig für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie die DNAs mit einem schnellen Abwärtsübertragungssystem vom Gel auf die Membran. Als nächstes montieren Sie den Turble Blotter und Blotting Stack, wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben. Danach nehmen Sie die Membran heraus und waschen Sie sie mit zwei X-Saline-Natriumcitrat für eine Minute.

Absorbieren Sie die Flüssigkeit mit Geweben, und verwenden Sie dann einen UV-Verklinker, um die DNA mit der Membran zu vernetzen. Um mit der Kennzeichnung der DNA-Sonden mit Radioaktivität zu beginnen, fügen Sie die wärmedenaturierte Sonde DNAs in die Röhre ein, die die gebrauchsfertigen DNA-Etikettierungsperlen enthält. Pipette nach oben und unten zu mischen.

Und fügen Sie fünf Mikroliter radioaktiv beschriftetes Desoxycytintriphosphat hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Reinigen Sie die beschrifteten Sonden mit G 50 Mikrosäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um die Radioaktivität zu messen. Um mit der Hybridisierung der Membranen mit den beschrifteten Sonden zu beginnen, legen Sie die Membran in das Hybridisierungsrohr. Fügen Sie die gemischte Vorhybridisierungslösung hinzu.

Die Röhre in den Hybridisierungsofen geben und die Vorhybridisierung bei 42 Grad Celsius 30 Minuten lang verlaufen lassen. Dann entfernen Sie das Rohr aus dem Ofen und gießen Sie die Vorhybridisierungslösung in ein 50-Milliliter-Rohr. Fügen Sie die denaturierte Sonde hinzu, und mischen Sie sie vorsichtig.

Um die nicht hybridisierten Sonden zu entfernen, legen Sie die Membran in eine Schale mit einem X-Saline-Natriumcitrat mit 0,1% SDS und schütteln Sie 10 Minuten lang sanft bei 55 bis 60 Grad Celsius. Danach die Membran mit Plastikfolie umwickeln und in der Belichtungskassette fixieren. In einem dunklen Raum, setzen Sie die Membran zwei Blatt Röntgenfilm.

Entwickeln Sie den Film, um die Ergebnisse zu visualisieren. Bestimmen Sie, ob ein entsprechender ES-Klon der gewünschte mit dem Ziel der Rekombination ist oder nicht, entsprechend den Größen der DNA-Bänder, die von den Sonden erkannt werden. In dieser Studie werden Southern Blotting und PCR verwendet, um HR-Ereignisse zu identifizieren, die in Maus-ES-Zellen für die Erzeugung von NM zwei genetische Ersatzmausmodelle mit ES-Zellen-basierte HR-vermittelte Targeting-Technologie auftreten.

Da die genomischen DNAs in viele Fragmente mit unterschiedlichen Längen geschnitten sind, zeigen sie einen abstrichähnlichen Status auf dem DNA-Gel an. Dies deutet auf eine vollständige Verdauung der genomischen DNAs hin. Als letzten Schritt der südlichen Blotting werden die Signale einer Radioaktivität sonden bezeichnet, die mit einem Ziel-DNA-Fragment hybridisiert wird.

Das Auftreten erwarteter Bänder spiegelt das Auftreten von HR-Ereignissen in den ES-Klonen wider. Nach dem Vorentwurf in der Studie haben ES-Klone mit mutiertem Allel zwei unterschiedliche Größenbänder. Während Wild-Typ ES-Klone nur ein Band haben, was darauf hindeutet, dass die gewünschten ES-Klone heterozygot sind.

Nach der PCR-Reaktion können die PCR-Produkte auf dem DNA-Gel analysiert werden. Wenn ein bestimmtes NPCR-Band der richtigen Größe beobachtet wird, deutet dies auf das Auftreten von HR-Ereignissen hin, die durch Sequenzierung dieses PCR-Bandes weiter bestätigt werden können. Die Implikation dieser Technik erstreckte sich auf die Therapie der Identifizierung der Punktmutation, da die Grundlage identisch ist.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist wichtig, daran zu denken, geduldig und vorsichtig zu sein. Nach diesem Verfahren kann eine andere Methode wie die Mikroinjektion von ES-Zellen in Blastozysten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bildung von chimarischen Tieren zu beantworten. Diese Technik ebnete dem Forscher auf seinem Gebiet der Molekular- und Zellbiologie den Weg, um die Funktion eines bestimmten Gens oder die Folge eines mutierten Gens bei Mäusen oder darüber hinaus zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Radioaktivitätsetikettierer P32 DCTB extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Abschirmung mit Schutzplatine immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.