Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie
30. November 2018
Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.
Der Hauptvorteil dieses plattenbasierten Trübungstests ist, dass er schnell ist und es ermöglicht, mehrere Amyloid-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer sofort ohne ausgeklügeltes Setup oder Anforderungen zu überprüfen. Die Kopfverbindungen, die sich im Fibrin-Trübungstest befinden, können weiter auf ihre Fähigkeit untersucht werden, A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien in den fibrin-Gerinnseln wiederherzustellen, die durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden. Die visuelle Demonstration der Gerinnselvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie-Analyse ist von entscheidender Bedeutung, da Abweichungen in der Präparation zu Variationen innerhalb der experimentellen Ergebnisse beitragen können.
Der Schwerpunkt dieser Demonstration liegt hier auf A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungen. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und den Verbindungen mit dem Fibringer zu analysieren. Beginnen Sie mit 1,5 Mikromolaren frisch zubereitetem Fibrinogen in 200 Mikroliter gerinnungsbildendem Puffer zu jedem A-beta-Negativ 42, das Brunnen enthält und kontrolliert, und brütedien Sie die Platte auf einer rotierenden Plattform bei Raumtemperatur.
Nach 30 Minuten gleichzeitig 30 Mikroliter frisch zubereitete Thrombinlösung direkt in das Zentrum des fibrinogenhaltigen Brunnens geben, um die Gerinnselbildung zu initiieren und sofort die Absorption der In-vitro-Gerinnsel bei 350 Nanometern zu lesen, wobei die Messung im Laufe von 10 Minuten alle 30 bis 60 Sekunden wiederholt wird. Um die Wirkung von A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmern auf die Fibrin-Gerinnselstruktur zu bewerten, verwenden Sie zunächst Zangen, um saubere, 12 Millimeter silikonisierte Glaskreisabdeckung zu einzelnen Bohrungen einer 12-Well-Platte zu platzieren und 80 Mikroliter Fibrinogen auf jeden Deckelschlupf zu legen, wobei die Lösung sanft verteilt wird, so dass sie gleichmäßig verteilt werden. Fügen Sie 20 Mikroliter Thrombin-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Gerinnselbildung zu initiieren.
Bedecken Sie die Platte für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, dann tauchen Sie jedes Gerinnsel vorsichtig in zwei Milliliter eiskalten NatriumkokodilatPuffer für zwei Minuten, bedeckt, bei Raumtemperatur zwei Mal, mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um vorsichtig den Puffer nach jeder Wäsche zu entfernen. Nach der letzten Wäsche den Status der Gerinnselbildung auf dem Decksschlupf überprüfen und die Gerinnsel 30 Minuten lang in zwei bis drei Milliliter eiskaltem 2%glutaraldehyd auf Eis fixieren. Am Ende der Inkubation das Glutaraldehyd aus jedem Brunnen vorsichtig entfernen und die Gerinnsel mit frischem Natriumkakodilatatpuffer waschen, wie auf Eis gezeigt.
Hydratisieren der festen Gerinnsel in einer abgestuften Serie von fünfminütigen eiskalten Ethanol-Wassaufenthalten auf Eis, ohne das Ethanol zwischen den Wärteilen vollständig zu entfernen, um die Gerinnsel vor Luftexposition zu schützen. Während der letzten 100%Ethanol-Wäsche die Deckelschlupfin in einen kritischen Punkttrockner-Probenhalter übertragen, mindestens 1 Scheibe zwischen jedem Abdeckungsschlupf platzieren und den Halter in eine mit Ethanol gefüllte kritische Punkttrocknerkammer legen. Verwenden Sie nach einem 30-minütigen Trocknungszyklus Mit Kohleband die Deckelschlupfe an einzelnen Rasterelektronenmikroskopie-Stubs und übertragen Sie die Proben in die Sputter-Beschichtungskammer eines Vakuum-Sputterlackierers.
Dann spritzen Sie weniger als 20 Nanometer Goldpalladium oder andere leitfähige Materialien für 25 Sekunden bei vier Angstroms pro Sekunde auf die Proben und stellen die Proben auf einem Rasterelektronenmikroskop ab, das mit einem Sekundärelektronendetektor Typ 2 bei vier Kilovolt ausgestattet ist. Die Fibrin-Gerinnselbildung bewirkt eine Streuung des Lichts, das durch die Lösung geht, was zu einer erhöhten Trübung führt, die am Ende der Leseperiode hochist. Wenn das Fibrinogen in Gegenwart von A-beta 42 inkubiert wird, nimmt die Trübung der Lösung ab, wobei die Kurve eine maximale Höhe von etwa der Hälfte der von Fibrinogen allein erreicht.
In Gegenwart eines A-beta 42-Interaktionsblockers wird die Wirkung von Beta-Amyloid gemildert und die Trübung ist höher als bei A-beta allein. Die Wirkung des Blockers erscheint nicht aufgrund der Hintergrundtrübung, da die Verbindung die Trübung des Fibringerflecks nicht verändert, wenn A-beta fehlt. Darüber hinaus zeigt die Gerinnselbildung in Gegenwart von GPRP, einem Peptid, das bekanntermaßen die Fibrinpolymerisation stört, eine signifikant reduzierte Trübung im Vergleich zur Fibringerengerbildung in Abwesenheit des Inhibitors.
Fibrinogen, das in Gegenwart von Thrombin und Calciumchlorid erzeugt wird, bildet nur ein Fibringewebe mit längenden und interkalierten Fibrinfäden sowie größeren Bündeln. Wenn A-beta vorhanden ist, wurden die Fibrinfäden dünner mit mehreren klebrigen Klumpen in Aggregaten, was auf A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien hindeutet. In Übereinstimmung mit den Trübungs-Assay-Ergebnissen stellt die Gerinnselbildung in Gegenwart eines A-beta-Fibrinogen-Interaktionsblockers teilweise die Struktur des Fibringer aus den A-Beta-induzierten Veränderungen wieder her, da bei dieser Behandlung weniger Klumpen beobachtet werden.
Die Analyseprotokolle "Gerinnseltrübungstest" und "Rasterelektronenmikroskop" wurden für die schnelle und reproduzierbare Bewertung mehrerer A-beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer optimiert. Und bald werden Daten wertvolle Informationen über die Bildung von Fibrin-Gerinnsel liefern, die sowohl in vitro als auch in vivo auf weitere Studien angewendet werden können.
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Übersicht
In diesem Artikel werden Methoden zur Analyse der Wirkung von Beta-Amyloid auf die Fibrin-Gerinnungsstruktur vorgestellt, einschließlich eines in-vitro-Fibrin-Gerinnungsprotokolls sowie Methoden zur Trübungsmessung und Rasterelektronenmikroskopie von Gerinnseln.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Beta-Amyloid ist an neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt.
- Fibrin-Klumpen spielen eine Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen.
- Das Verständnis der Fibrin-Klumpenstruktur kann Einblicke in Krankheitsmechanismen liefern.
- Frühere Studien haben strukturelle Anomalien in Fibrin-Klumpen aufgrund von A-Beta gezeigt.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von Beta-Amyloid auf die Fibrin-Gerinnungsstruktur.
- Screening von Inhibitoren der Wechselwirkungen zwischen Amyloid-Beta und Fibrinogen.
- Demonstration der Herstellung von Gerinnseln zur Analyse mittels Rasterelektronenmikroskopie.
Verwendete Methoden
- Plattenbasierte Trübungsmessung für schnelle Screening-Verfahren.
- Herstellung von in-vitro-Fibrin-Blutgerinnseln unter Verwendung von Fibrinogen.
- Rasterelektronenmikroskopie zur Analyse der Gerinnselstruktur.
- Anpassung der Protokolle zur Untersuchung anderer Proteinwechselwirkungen.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Leitverbindungen, die die strukturelle Integrität wiederherstellen.
- Die visuelle Demonstration der Gerinnungspräparation ist entscheidend für die Konsistenz.
- Variationen bei der Präparation können die experimentellen Ergebnisse beeinflussen.
- Möglichkeit für weiterreichende Anwendungen bei der Untersuchung von Proteinwechselwirkungen.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellten Methoden eignen sich zur Analyse der Fibrin-Gerinnungsstruktur.
- Die Untersuchung von Inhibitoren kann zu Erkenntnissen über therapeutische Strategien führen.
- Weitere Forschungsarbeiten können die Wechselwirkungen weiterer Proteine umfassender untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Untersuchung von Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen Amyloid-Beta und Fibrinogen mithilfe eines plattenbasierten Trübungstests und unterstützt so die frühe Zielvalidierung in der therapeutischen Entwicklung bei Alzheimer-Krankheit. Die Methode liefert quantitative Daten zur Gerinnselbildung sowie strukturelle Bestätigung mittels Rasterelektronenmikroskopie und beschleunigt so den Übergang von Treffern zu Leitverbindungen für Substanzen, die A-Beta-induzierte Fibrin-Gerinnungsstörungen verbessern. Durch die Kombination von Trübungsmessungen mit REM-Bildgebung bietet der Ansatz eine mechanistische Entlastung und vorhersagbare Sicherheit für Entdeckungsprogramme, die auf das neurovaskuläre System abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese, dass die Interaktion zwischen A-beta und Fibrinogen die Bildung pathologischer Gerinnsel bei der Alzheimer-Krankheit verursacht.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem die Trübung des Gerinnsels als direkter Nachweis der Hemmung der A-beta-Fibrinogen-Bindung gemessen wird.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffen im Portfolio, indem Verbindungen identifiziert werden, die die normale Fibrin-Gerinnselstruktur wiederherstellen, was auf eine Zielstrukturenbindung und biologische Risikominderung hinweist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Der optimierte Trübungstest ist schnell, hochgradig reproduzierbar und kompatibel mit Mehrmuldenplattenformaten zur Untersuchung großer Substanzbibliotheken.
- Quantitative Ausgabe: Misst die Absorption bei 350 nm über die Zeit und liefert kinetische Daten zur Gerinnung, wodurch die Wirksamkeit von Inhibitoren von Hintergrundeffekten unterschieden werden kann.
- Strukturelle Bestätigung: Trefferverbindungen aus dem Trübungsscreening werden mittels REM validiert, um die Wiederherstellung der Fibringerinnselstruktur sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Treffer keine Artefakte des Assays sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert einen zerebrovaskulären Mechanismus der Alzheimer-Krankheit, der A-Beta mit Fibrin-Clot-Störungen verbindet, die mit Mikroinfarkten und zerebraler amyloider Angiopathie assoziiert sind.
- Translationaler Kontinuität: Verknüpft die in-vitro-Zielstrukturenbindung (Trübung) mit der phänotypischen Gerinnselstruktur (REM) und unterstützt so die mechanistische Entschärfung von Risiken vor der in-vivo-Validierung.
- Risikoadjustierte Fortschrittsbewertung Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf zwei Kriterien: Hemmung der Gerinnungsverzögerung und Umkehrung struktureller Anomalien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und ermöglicht die Hypothesenprüfung der Wechselwirkung zwischen A-Beta und Fibrinogen als medikamentös angreifbares Ziel, wobei die Ergebnisse in Workflows zur Leitsubstanzidentifizierung und präklinischen Validierung einfließen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie A-beta die Trübung und Struktur von Fibringerinnseln verändert, und klärt die Beteiligung von Signalwegen bei neurovaskulären Funktionsstörungen auf.
- Screening: Ermöglicht die Einsatzbereitschaft und Reproduzierbarkeit des Assays zur hochdurchsatzfähigen Bewertung von Inhibitoren der A-beta-Fibrinogen-Wechselwirkung im 96-Loch-Plattenformat.
- Analytik: Bietet kinetische Trübungsmessungen und strukturelle Parameter auf Basis von REM-Analysen, die einen vergleichenden Nachweis der Wirkstoffeffekte auf Gerinnung und Gerinnselarchitektur ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Zielinhibition mit der phänotypischen Wiederherstellung des Gerinnsels und ist damit in Einklang mit der präklinischen Kohärenz für neurovaskuläre Alzheimer-Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der Trübung-REM-Arbeitsablauf stellt eine wiederverwendbare Plattform dar, die auch auf andere Protein-Fibrinogen-Wechselwirkungen jenseits von A-beta anwendbar ist und breit angelegte Zielvalidierungsaktivitäten unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Vorhersagesicherheit, indem biochemische Hemmung mit struktureller Gerinnselrückbildung verknüpft wird, wodurch mechanistische Unklarheiten bei der Zielstrukturvalidierung reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch optimierte Protokolle zur Gerinnselpräparation, -wäschung, -fixierung und -abbildung sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem sowohl funktionelle (Trübung) als auch strukturelle (REM) Validierung erforderlich sind, wodurch biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Inhibitoren, die eine doppelte Korrektur der Gerinnungsverzögerung und der strukturellen Pathologie nachweisen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinaufreinigung, Gerinnungsassays und der Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu einem Plattenlesegerät voraus, das kinetische Absorptionsmessungen bei 350 nm durchführen kann, sowie zu einer Vakuumsputteranlage mit Möglichkeit zur REM-Bildgebung.
- Erfordert die Standardisierung der Schritte zur Gerinnungsfestigung, -dehydrierung und -trocknung, um strukturelle Artefakte zu vermeiden, die die Interpretation der REM-Aufnahmen beeinträchtigen könnten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf andere Protein-Fibrinogen-Wechselwirkungen ausgeweitet wird, insbesondere hinsichtlich Pufferzusammensetzung und Inkubationszeiten.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit, Reagenzien frisch herzustellen, und sorgfältiges Vorgehen, um Variabilität der Gerinnsel durch Luftexposition oder ungleichmäßiges Waschen zu verhindern.
