Name: Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die bakterielle Adhärenz an Transplantatgeweben mit einem In-vitro-Strömungskammermodell. Diese Methode untersucht die Pathogenese der infektiösen Endokarditis unter standardisierten Flussbedingungen.

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Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation - Flandern (Belgien; Gewährungsnummer - 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.

1. Vorbereitung Graft Gewebe für In-vitro- Studien
Hinweis: Drei Arten von Geweben wurden verwendet: Bovine Perikard Patch (BP), kryokonserviert Homograft (CH) und Rinder Halsschlagader Transplantate (BJV). Im Falle der BJV Conduit und CH (Gewebe durch europäische Homograft Bank (EHB) verarbeitet und gespeichert in flüssigem Stickstoff vor der Verwendung) dienten die Wand und Herzklappenfehler Flugblätter. BP-Patch und BJV Conduit wurden von den Herstellern gekauft. Vor dem Gebrauch auftauen der EHB Anweisungen12nach CH.
<ol><li>Spülen Sie alle Gewebe mit 0,9 % NaCl vor dem Gebrauch ab.</li>
	<li>Bereiten Sie Gewebebiopsien Einweg Hautbiopsie mit Punsch, kreisförmige Gewebe Stücke (10 mm Durchmesser) zu schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie alle Gewebe-Patches auf die gleiche Höhe mit sterilen Einweg-Skalpelle.</li>
	<li>Inkubieren Sie für Gewebe mit Glutaraldehyd (z. B. BJV Conduit) fixiert Transplantat Stücke über Nacht bei 4 ° C mit 200 g/L von Humanalbumin, das Fixiermittel zu neutralisieren.</li>
	<li>Auswaschen Rückstände von Glutaraldehyd mit 0,9 % NaCl in einer Mikrotiterplatte.  Wiederholen Sie 3-Mal für 1 Minute.</li>
</ol>2. Vorbereitung Perfusion Experimente mit Bakterien
Hinweis: Drei bakterielle Isolate wurden verwendet: S. Aureus Cowan (ATCC 12598), ATCC 149900 S. Epidermidis und S. Sanguinis NCTC 7864. S. Aureus und S. Epidermidis wurden bei 37 ° C in tryptic Soy Bouillon (TSB) und S. Sanguinis wurde bei 37 ° C mit 5 % CO2 im Gehirn Herz Infusion Brühe (BHI) angebaut.
<ol><li>Über Nacht Kultur von Bakterien auf einem soliden Blutagar Teller vorzubereiten.<ol>
<li>Verwenden Sie eine sterile Schleife um die gefrorenen Bakterien abkratzen und impfen auf einen Mueller-Hinton-Blutagar-Teller für Übernachtung Kultur bei 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Inokulation Schleife zu holen eine einzige Kolonie von der Übernachtung Blutagar Kultur und impfen in 10 mL TSB oder BHI 14 mL-Tube und Kultur über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Übernacht Kulturen (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und erneut die Pellets in 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie 14 mL-Tuben auf Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie eine aliquote 3,7 mg/mL Lösung von 5 (6) - Carboxy - Fluorescein N-hydroxy-Succinimidyl Ester (CF) in Ethanol und Lagerung bei-20 ° C. Weiter verdünnen Sie den Bestand an CF 150 µg/ml mit "Reinstwasser". Hinweis: Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und speichern bei-20 ° C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Bakterien (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und Aufschwemmen Sie der Pellets in 800 µL PBS und fügen Sie 200 µL der 150 µg/mL CF Lösung (Endkonzentration von 30 µg/mL für Perfusion Experimente genutzt). Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und 30 min mit einem Orbitalschüttler inkubieren.</li>
	<li>Nach der Kennzeichnung, block mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung mit PBS-Puffer und spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Folgen Sie mit einem Waschschritt mit 10 mL PBS und Pellet Bakterien durch Zentrifugieren (3000 x g, 4 ° C, 10 min).</li>
	<li>Verdünnen Sie Bakterien mit PBS zu 107 Koloniebildenden Einheiten (KBE) /mL (überprüft von KBE zählen auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten), das entspricht einer OD600 (Extinktion) von 0,65. Halten Sie die Rohre in der Dunkelheit auf dem Eis vor Perfusion Experimente. Hinweis. Denken Sie daran, dass die OD600 Messungen die ungefähre Anzahl der Bakterien widerspiegeln. Um die wirksame Impfung Dosis zu zählen, ist die serielle Verdünnungsmethode ein zusätzliche notwendiger Schritt zur Überprüfung der OD Zahlen wie im Abschnitt 3.8 beschrieben.</li>
</ol>3. in-vitro- Perfusion Experimente mit einer Parallel-Platte fließen Kammer
<ol><li>Montieren Sie Gewebebiopsien von 10 mm im Durchmesser und gleicher Dicke (vorbereitet in den Schritten 1.1-1.5) in ein Flow-Kammer-System mit der Innenfläche nach oben kommt man in Kontakt mit der Bakteriensuspension. Hinweis: Die gleiche Dicke der Gewebe in verschiedenen Transplantate sorgt dafür, dass die gleiche Höhe der Gewebe in den Kanal, so dass Laminar-Flow unter allen Bedingungen erreicht wird. Alle Elemente der Strömungsraum vorgestellt und in Abbildung 1beschrieben.<ol>
<li>Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie die Runde Gewebe zwischen einen Objektträger mit einer 8 mm Runde Perforation und eine Gummidichtung. Hinweis: Die Objektträger besitzt die ultra-dünnen Unterfolie um die Generation der 8 mm Bohrung zu ermöglichen. Zusammen mit dem Gummiblatt es behebt das Gewebe um den direkten Kontakt zwischen der Probe und das strömende Medium zu ermöglichen und auch verhindert, dass die Versetzung der Biopsie während des Experiments. Die Oberfläche des untersuchten Gewebes, welches den Fluss (kleiner Durchmesser) ausgesetzt ist nicht von der Zange zu manipulieren.</li>
		<li>Legen Sie den Halter mit dem Gewebe in das Dichtung-Blatt, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.</li>
		<li>Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit dem entsprechenden Dichtung Blatt auf den Unterteil der Kammer mit dem zuvor eingefügten Gewebe-Halter. Anschließend montieren Sie die ganze Kammer mit acht Schrauben und Muttern. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der Kammer in Transplantate immer identisch ist. Hinweis: Die Höhe der Kammer sollte immer beim Anziehen der Schrauben bestimmt werden. Verwenden Sie eine Zange oder Herrscher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verbinden Sie die Fluss-Kammer mit einer peristaltischen Pumpe und Ausgleichsbehälter mit den Rohren.</li>
	<li>Durchspülen der Gewebe mit Suspensionen von 107 KBE/mL (verifiziert durch KBE zählen und im Zusammenhang mit OD600 Messungen) Eindringmittel beschriftet Bakterien mit PBS-Puffer mit einer Scherbeanspruchung von 3 dyn/cm2 (Dyne pro Quadratzentimeter Druckeinheit) durch Mittel der peristaltischen Pumpe (Durchflussmenge 4 mL/min) für 1 h mit 400 mL bakterielle Reservoir (Werksdesign, Abbildung 1) bei 37 ° C über eine Platte-Thermostat (Table of Materials) konditioniert.</li>
	<li>Umwälzen Sie kontinuierlich die 100 mL Bakteriensuspension verwenden den gleichen Sammelbehälter.</li>
	<li>Demontieren Sie nach Perfusion die Kammer um das Transplantat freizugeben und das Gewebe Stück zweimal mit 4 mL PBS in einer 12-Well-Platte mit dem Labor Orbitalschüttler für 3 min waschen. Anschließend Schneiden der innere Teil des Transplantats eine Hautbiopsie mit Punsch mit kleinerem Durchmesser.</li>
	<li>Legen Sie jeder Gewebeentnahme in einer separaten 14 mL Röhrchen mit 1 mL steriler 0,9 % NaCl. Beschriften Sie das Rohr als #1.</li>
	<li>Lösen Sie die Bakterien aus dem Gewebe mit einer Beschallung Bad für 10 min (Amplitude = 100 % und Frequenz = 45 kHz). Hinweis: Vollständige Loslösung von Bakterien aus dem Gewebe, die Transplantate nach Inkubation von Patches über Nacht bei 37 ° C im flüssigen Medium TSB gefolgt von OD600 Messungen ausgewertet werden sollen im Vergleich um zu steuern, Patches mit einer Bakterien-frei-Lösung behandelt.</li>
	<li>Verwenden Sie ein serielles Verdünnungsmethode auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten KBE zählen.<ol>
<li>Bereiten Sie einen einzigen 14 mL-Tube mit 10 mL steriler Kochsalzlösung Verdünnungsreihen die Bakteriensuspension erhalten nach Beschallung zu machen. Beschriften Sie diese Röhre als #2. Hinweis: Für jedes Gewebe Experiment eine Tube mit 10 mL 0,9 % NaCl ist erforderlich.</li>
		<li>Bereiten Sie drei 14 mL Röhrchen mit 10 mL steriler 0,9 % NaCl für serielle Verdünnungen des ersten Bakteriensuspension aus Schritt 2.7. Beschriften Sie die Schläuche wie folgt #3, #4, #5. Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig, die echte KBE-Zahl in Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion Experiment kennen.</li>
		<li>Vortex mischen jedes Rohr 15 S. Wirbel die Rohre mit der Gewebeentnahme sowie die ersten Bakteriensuspension Verdünnungsreihen zu machen.</li>
		<li>Bereiten Sie drei Agarplatten, zwei für die Gewebe-Experiment (Perfusion von Bakterien und Kontrolle Perfusion der PBS) und die dritte für die anfängliche Bakteriensuspension für Perfusionen verwendet.</li>
		<li>Beschriften Sie in drei Sektoren pro Platte für die Gewebe-Experiment in der folgenden Weise 10-1, 10-3 und 10-4. Zum zählen der Anzahl der KBE in der bakteriellen Perfusates beschriften Sie die Platte wie folgt: 10-1, 10-3, 10-5 bis 10-7. Hinweis: Alle Angaben auf Agar Platten wie 10-1, 10-3 usw. beziehen sich auf die endgültige Anzahl der KBE/mL am nächsten Tag berechnet. Steuerplatte erfordert keine Sektoren. Vor Gebrauch sollte Blutagar Platten platziert unter der laminar Haube und geöffnet, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.</li>
		<li>Um den Vorgang fortzusetzen, Vorbereitung der Verdünnungsreihen, übertragen Sie 100 µL Röhre #1 Rohr #2 und mischen Sie kräftig mit Vortex.</li>
		<li>100 µL der Inhalt der Tube #1 und #2 auf die entsprechenden Sektoren 10-1 und 10-3 der Agar-Platte zu verbreiten. Ebenso verbreitet 10 µL des Rohres #2 auf dem Sektor 10-4, wiederholen Sie diesen Schritt 4 mal 4 separate Wucherungen von jedem Volumen von 10 µL zu erhalten. Hinweis: Aufgrund des geringen Volumens für die Beschichtung auf dem Sektor 10-4verwendet, ist es ratsam, mehrere Anzahl der Tröpfchen zu einer durchschnittlichen Anzahl von gewachsenen KBE.</li>
		<li>Um die serielle Verdünnungen der ursprünglichen Kultur vorzubereiten, übertragen Sie 100 µL Bakteriensuspension vom Schritt 2.7 auf Rohr #3 und mischen Sie kräftig mit Vortex. Tube #4 100 µL Rohr #3 hinzufügen und gut mischen, wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Röhre #5.</li>
		<li>100 µL des Inhalts der Röhren #3, #4 und #5 bereinigte Bakteriensuspension (Schritt 2.7), bzw. auf Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blutagar Platte verteilt.</li>
		<li>Lassen Sie den Blutagar-Platten in der laminaren Haube an der Luft trocknen die bakterielle Spreads in der Regel für 10 Minuten. Danach legen Sie die Platten bei 37 ° C für die Inkubation über Nacht.</li>
		<li>Zählen Sie nach der Inkubation über Nacht die Bakterienkolonien um die Anzahl der KBE, aus dem die Haftung an der Gewebebiopsien sowie KBE/mL in den Start Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion zu erhalten. Drücken Sie die Ergebnisse als KBE/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Fluoreszenzmikroskopie haftende Bakterien Gewebe bei der Perfusion verpflanzen
<ol><li>Nach Perfusion, Gewebe Stücke mit PBS waschen (siehe Punkt 3.5) und schneiden Sie den inneren Teil der ein Transplantat mit einem Schlag mit einem kleineren Durchmesser.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6-Well-Platte und legen Sie Tröpfchen Eindeckmedium (Table of Materials).</li>
	<li>Legen Sie jedes Stück des Gewebes mit seiner perfundierten Oberfläche nach unten auf einen einzigen Tropfen Eindeckmittel.</li>
	<li>Lesen Sie einen Teller mit einem Fluoreszenz-Scanner (Table of Materials). Eingestellten Parameter des Anregung und Emission Wellenlängen entsprechend einem Fluorophore für bakterielle Kennzeichnung verwendet.</li>
</ol>

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<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuchen, o...

Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.
Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.
Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Pflaster für Rinderperikard (BP), Supple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Leitungen für Rinder-Jugularvenen (BJV)</td><td>Contegra-Leitung; Medtronic Inc, USA</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH kryokonserviertes Homotransplantat</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, USA</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>humanes Albumin</td><td>Flexbumin; Baxter, Belgien</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Deutschland</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Herzinfusionsbrühe (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescein N-Hydroxysuccinimidester (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe (MODELL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Deutschland</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Beschallungsbad</td><td>VWR Ultraschallreiniger; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel</td><td>Invitrogen von ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (Fluoreszenzscanner)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - Reinstwasser - H2O MilliQ Millipore</td><td></td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische Objektträger - Gewebekulturkammern (1 Well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1-Well auf Lumox abnehmbar</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl - chirurgische Klingen</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Silikonschlauch, 1/8" ID x 1/4" OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Temperaturbereich: &ndash; 80 bis 200°; C Sterilisieren: Mit Ethylenoxid, Gammabestrahlung oder Autoklav für 30 min, 15 psi Druck</td></tr><tr><td>PharMed BPT Schlauch</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoklavierbar 30 min bei 121 °; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Schlauch</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade;</td><td></td><td></td>15312022</tr><tr><td>Thermostat</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

ein in-vitro- modell eines systems parallel-platte perfusion, bakteriellen einhaltung der gewebe transplantat zu studieren

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.
Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.

Besseres Verständnis die Mechanismen hinter IE Entwicklung, dieses Modell ermöglicht die Auswertung der bakteriellen und Gewebe verbundenen Faktoren zu präsentieren, in der in-Vivo -Situation der Infektion auftreten.
Im Detail, die neuartige in-vitro- Ansatz ermöglicht die bakterielle Adhäsion in Strömungsverhältnisse zu verschiedenen Transplantat Geweben quantifizieren von Vorrichtung Eindringmittel b...

Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in der Pathogenese der infektiösen Endokarditis zu beantworten, und Pathobiogramme durch Felder wie das Zusammenspiel zwischen Bakterien, Blutzellen, und Endothelzellen Auskleidung Muskulatur. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Gewebetransplantate direkt gegenseitigen Wechselwirkungen mit verschiedenen Zielen ausgesetzt sein könnten, wie Bakterien, Thrombozyten und Proteine unter standardisierten Strömungsbedingungen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie von infektiöser Endokarditis, weil sie wichtige molekulare Wechselwirkungen und Faktoren entwirren kann, die eine hohe Infektiosität bestimmter Gewebe antreiben.Diese Methode gibt Einblick in die Pathogenese der Vegetationsbildung. Es kann auch in Studien zur Untersuchung der vaskulären Durchlässigkeit, Zellmobilität und Genzellexpression anwendbar sein. Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie eine zuvor vorbereitete Gewebebiopsie mit einem Durchmesser von 10 Millimetern und der gleichen Dicke zwischen einem Mikroskopschlitten und einer kreisförmigen Perforation von acht Millimetern sowie eine Gummidichtung mit der nach oben gerichteten Innenfläche auf, um die bakterielle Suspension zu kontaktieren.Konzentrieren Sie sich auf die Gewebetransplantatausrichtung, während Sie im Halter platziert werden. Stellen Sie sicher, dass die innere Oberfläche des Gewebes bereits der Blutbahn ausgesetzt ist, um Ihr experimentelles Medium zu kontaktieren. Als nächstes legen Sie Ihren Halter mit dem Gewebe in das Dichtungsblech ein, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit der entsprechenden Dichtungsfolie mit dem zuvor eingesetzten Gewebehalter an der Unterseite der Kammer. Dann montieren Sie die gesamte Kammer mit acht Schrauben und Schraubenmuttern. Stellen Sie sicher, dass die Kammerhöhe bei Transplantaten immer gleich ist, indem Sie einen Bremssattel oder ein Lineal verwenden.Als nächstes verbinden Sie die Durchflusskammer mit einer peristaltischen Pumpe. Dann verbinden Sie das 400 Milliliter Flüssigkeitsreservoir mit den Rohren. Durchdringen Sie die Gewebe mit 100 Milliliter Suspensionen von zehn bis sieben fluoreszierend markierten Koloniebildenden Einheiten in Phosphat gepufferter Saline mit der schieren Spannung von drei Dines pro Quadratzentimeter und der entsprechenden Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute für eine Stunde mit der peristaltischen Pumpe und dem Bakterienreservoir.Rezirkulieren Sie kontinuierlich die 100 Milliliter bakterielle Suspension mit dem gleichen Sammelbehälter. Nach der Durchblutung die Kammer demontieren, um das Transplantat freizusetzen. Waschen Sie das Gewebestück zwei Mal mit vier MilliliterPBS in einer 12-Well-Platte mit einem Orbital-Shaker für drei Minuten.Dann schneiden Sie den inneren Teil des Transplantats mit einem Hautbiopsie-Punch mit einem kleineren Durchmesser. Legen Sie jede Gewebebiopsie in eine separate 14-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid. Lösen Sie die Bakterien mit einem Beschallungsbad 10 Minuten lang aus dem Gewebe.Bereiten Sie eine einzelne 14-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid vor, um serielle Verdünnungen der bakteriellen Suspension nach der Beschallung zu machen. Beschriften Sie das Rohr Nummer zwei. Bereiten Sie drei 14 Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid für serielle Verdünnungen der anfänglichen bakteriellen Suspension vor, die zum Profusionsexperiment gebracht wurde.Beschriften Sie die Rohre Nummer drei, Zahl vier und Nummer fünf. Als nächstes sichern Sie drei Agarplatten, eine für die bakterielle Perfusion, eine für die Kontrolle der Durchblutung von PBS und die dritte für die anfängliche bakterielle Suspension, die für Perfusionen verwendet wird. Beschriften Sie drei Sektoren pro Platte für das Gewebeexperiment auf folgende Weise: 10-1, 10-3 und 10-4.Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in der bakteriellen Perfusing zu zählen, beschriften Sie die Platte wie folgt:10-1, 10-3, 10-5 und 10-7. Wirbeln Sie die Röhren, die die Gewebebiopsie enthalten, jeweils 15 Sekunden lang, um serielle Verdünnungen zu machen. Um die seriellen Verdünnungen vorzubereiten, übertragen Sie 100 Mikroliter des Rohres Nummer eins auf Rohr Nummer zwei, und wirbeln Sie das Rohr gründlich, um die Lösung gründlich zu mischen.100 Mikroliter des Gehalts von Rohr Nummer eins und Zwei auf die entsprechenden Sektoren verteilen, 10-1 und 10-3 der Agarplatte. Dann verteilen 10 Mikroliter Rohr Nummer zwei auf Sektor 10 vier. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um vier separate Wuchse von jedem Volumen von 10 Mikrolitern zu erhalten.Um serielle Verdünnungen der Anfangskultur vorzubereiten, wirbeln Sie zunächst die Verdünnung für 15 Sekunden aus und übertragen Sie 100 Mikroliter bakterielle Suspension auf Tube Nummer drei, und mischen Sie durch Wirbeln kräftig. 100 Mikroliter Rohr Nummer drei zu Rohr Nummer vier hinzufügen und erneut mischen. Wiederholen Sie den Vorgang für Rohr Nummer fünf aus Rohr Nummer vier.Verteilen Sie 100 Mikroliter des Gehalts der Tuben Nummer drei, Zahl vier, Zahl fünf und der beschrifteten Anfangskultur auf die Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blut-Agarplatte. Lassen Sie die Blut-Agar-Platten unter der laminaren Haube, um die bakteriellen Ausbreitungen an der Luft zu trocknen, in der Regel für 10 Minuten. Danach die Teller bei 37 Grad Celsius für die nächtliche Inkubation aufstellen.Zählen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Bakterienkolonien, um die Anzahl der KBE zu erhalten. Unter reinen Stressbedingungen wurde eine ähnliche bakterielle Anhaftung über die verschiedenen Transplantatgewebe sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Staphylococcus epidermidis beobachtet. Im Anschluss an die Verfahren, Streptococcus sanguinis zeigte signifikante Verringerung der Haftung an der Rinder jugular Venenwand, im Vergleich zu den Rinder perikardium Patch.Beim Vergleich der drei Bakterienarten stellt Streptococcus sanguinis eine signifikant geringere Haftung an der Rinderjugularvenenwand in Bezug auf Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis dar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, richtige Gewebe desselben Kopfes vorbereitet zu haben. Es wird ähnliche Bedingungen für alle Versuchsproben gewährleisten und die Datenvariabilität zwischen verschiedenen Versuchsreihen minimieren.Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik den Forschern, die komplexen Störungssysteme Schritt für Schritt zu erforschen, indem sie ihre In-vitro-Modellansätze mit verschiedenen Elementen anreichern, um die volle Komplexität in der Nähe des medizinischen Status aufzubauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Quelle: Ditkowski, B., et al. Ein in-vitro-Modell eines Parallelplatten-Perfusionssystems zur Untersuchung der bakteriellen Haftung an Transplantatgeweben. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert die Methode, eine Parallelplatten-Flusskammer zu verwenden, um fluoreszenzmarkierte Bakterien über vaskuläres Transplantatgewebe zu perfundieren, was eine kontrollierte Analyse der bakteriellen Adhäsion und der frühen Pathogenese unter Scherflussbedingungen ermöglicht.

In-vitro-Parallelplatten-Flussmodell zur Untersuchung der bakteriellen Adhäsion an einer Gewebebiopsie

Quelle: Calatayud Arroyo, M., et al. Bewertung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakteriellen Konsortiums an der in-vitro-Darm-Wirt-Mikroben-Schnittstelle. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert ein in-vitro-Darm-Host-Mikroben-Modell zur Untersuchung der bakteriellen Lebensfähigkeit. Eine Kokultur von Caco-2- und HT29-MTX-Zellen wird mit Bakterien inkubiert, die unter simulierten Verdauungsbedingungen vorbehandelt wurden. Die Integrität der Epithelbarriere wird mit...

In-vitro-Darmmodell zur Bewertung bakterieller Adhäsion und Internalisierung

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Dieses Protokoll stellt den Aufbau und Betrieb eines neu entwickelten, 3D-gedruckten Bioreaktors für die ex vivo Kultur von Blutgefäßen in Perfusion vor. Das System ist so konzipiert, dass es leicht von anderen Benutzern übernommen werden kann, praktisch, erschwinglich und an verschiedene experimentelle Anwendungen wie grundlegende biologische und pharmakologische Studien anpassbar ist.

Ex Vivo Perfusionskultur großer Blutgefäße in einem 3D-gedruckten Bioreaktor

Erfahren Sie die bakterielle Adhärenz an Transplantatgeweben mit einem In-vitro-Strömungskammermodell. Diese Methode untersucht die Pathogenese der infektiösen Endokarditis unter standardisierten Flussbedingungen.

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

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