Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Diese Methode kann helfen, die Spinalmechanismen zugrunde sensorische Übertragung, nozizeptive Regulation und chronische Schmerzen oder Schmerzen Entwicklung zu klären Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine ideale neuronale Konservierung ermöglichen kann und es kann In-vivo-Bedingungen bis zu einem gewissen Grad imitieren. Beginnen Sie mit dem Ziehen von Aufnahmeelektroden aus Borosilikatglas-Mikrokapillaren mit einem Kapillarzieher. Dann füllen Sie eine Form mit geschmolzenem Agar, um einen 1,2 Zentimeter mal 1,5 Zentimeter mal 2,0 Zentimeter großen Agarblock vorzubereiten.

Trimmen Sie den Block, um einen zentralen Kanal zu haben, wenn Querabschnitte geplant werden. Oder ein Kanalfleisch mit der Kante des Blocks für parasagittale Abschnitte. Vor der transkardialen Profusion und Rückenmarksextraktion 500 Milliliter Saccharose-basierte ACSF vorbereiten.

Kühlen Sie die Lösung auf Eiseskälte und gleichnden Sie mit 95%O2 und 5%CO2. Kühlen Sie alle Sezierwerkzeuge auf Eis. Machen Sie einen längs fünf Zentimeter großen Schnitt auf der Rückenhaut von kaudal zu rostral.

Dann durchschneiden Sie den Rippenkäfig zwischen der Wirbelsäule und den Rippen auf beiden Seiten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt am kaudalen Ende der Wirbelsäule zu machen. Schneiden Sie dann die umgebenden Gewebe ab und isolieren Sie schnell das lumbosakrale Segment der Wirbelsäule.

Übertragen Sie das lumbosakrale Segment auf eine Glasschale mit eiskalter Saccharose-Basis ACSF. Mit der ventralen Seite nach oben, verwenden Sie eine feine Schere, um durch den Wirbel Pedikle bilateral zu schneiden und das Rückenmark sorgfältig auszusetzen. Isolieren Sie einen zwei Zentimeter langen Teil des Rückenmarks mit der lumbosakralen Vergrößerung und übertragen Sie den Wirbelsäulenbereich in eine andere Glasschale, die mit kalter Saccharose ACSF gefüllt ist.

Arbeiten Sie unter einem Seziermikroskop, um die Meningen und die Pia arachnoiden Membran zu entfernen. Schneiden Sie alle ventralen und dorsalen Wurzeln so schnell wie möglich weg. Achten Sie darauf, die Verletzung des Rückenmarks zu vermeiden, insbesondere das Rückenhorn beim Entfernen der Hirnhaut und der Wirbelsäulenwurzeln.

Legen Sie das Rückenmark auf den zuvor getrimmten Agarblock. Um Querscheiben vorzubereiten, befestigen Sie die ventrale Seite des Rückenmarks mit der Rückenseite an den Agar mit der Rückenseite zur Klinge. Um parasagittale Scheiben vorzubereiten, befestigen Sie die ventrale Seite mit Superkleber an den Agar in vertikaler Richtung.

Dann montieren Sie den Agarblock auf einer Plattform eines Vibratome mit Superkleber. Und bereiten Sie 300 bis 500 Mikron Quer- oder Parasagittalscheiben mit einer fortgeschrittenen Geschwindigkeit von 0,025 Millimetern pro Sekunde und einer Schwingungsfrequenz von 80 Hertz vor. Das Rückenmark sollte dorso-ventral in Scheiben geschnitten werden.

Für die besten Ergebnisse sollte die Scheibe innerhalb von 15 bis 20 Minuten vorbereitet werden. Die Dicke der Wirbelsäulenscheibe sollte nicht mehr als 600 Mikrometer betragen, um die Sichtbarkeit der Zelle zu gewährleisten. Verwenden Sie eine kunststoffbeschnittene Pipette, um die Scheiben auf Nylongewebe in einer Lagerkammer zu übertragen, die kontinuierlich sauerstoffhaltige ACSF bei 32 Grad Celsius enthält.

Um Ganzzellpatch-Klemmenaufnahmen von substantia gelatinosa oder SG Neuronen durchzuführen, verwenden Sie kaliumionenbasierte intrazelluläre Lösungen für die Aufzeichnung, während Cäsiumkation basierte Lösung nur für die Aufzeichnung von hemmenden postsynaptischen Strömen angewendet wird. Bewegen Sie die Rückenmarksscheibe vorsichtig in die Aufnahmekammer. Und dann stabilisieren Sie es fest mit einem U-förmigen Platindraht mit Nylonfäden für optimale Scheibenstabilität.

Die Scheibe mit geblasenem ACSF bei Raumtemperatur kontinuierlich überspritzen und die Überflussrate auf zwei bis vier Milliliter pro Minute einstellen, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu erreichen. Identifizieren Sie dann mithilfe einer Mikroskoplinse mit niedriger Auflösung die Region der SG-Neuronen als transluzentes Band. Wählen Sie ein gesundes Neuron, das sich durch eine dreidimensionale Form mit einer hellen und glatten Membran als Zielzelle mit dem hochauflösenden Objektiv auszeichnet, und passen Sie es an die Mitte des Videobildschirms an.

Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten Volumen an Kaliumionen- oder Cäsiumionenbasis intrazellulärer Lösung. Legen Sie dann die Mikropipette in den Elektrodenhalter ein und stellen Sie sicher, dass die intrazelluläre Lösung den Silberdraht im Inneren des Halters anspricht. Bringen Sie die Mikropipette in den Fokus und verwenden Sie den Mikromanipulator, um sie in den ACSF einzutauchen.

Wenden Sie einen leichten positiven Druck an, um Schmutz und Schmutz zu entfernen. Bewegen Sie die Mikropipette nach und nach in Richtung des Zielneurons. Sobald sich die Pipette dem Neuron nähert und sich ein sehr kleiner Dimple auf der neuronalen Membran bildet, geben Sie den positiven Druck frei, ein Gigaseal zu bilden.

Ändern Sie das Haltepotenzial auf minus 70 Millivolt, was in der Nähe des physiologischen Ruhemembranpotentials einer Zelle liegt. Dann wenden Sie eine transiente und sanfte Absaugung auf die Mikropipette an, um die Membran zu brechen und eine gute Ganzzellkonfiguration zu schaffen. Zeichnen Sie die Brenneigenschaften auf, indem Sie das Brennmuster jedes Neurons in stromaktueller Klemme mit einer Reihe von einer Sekunde depolarisierenden Stromimpulsen von 25 bis 150 Picoamps mit 25 Picoamp-Schritten beim ruhenden Membranpotential testen.

Um somatische Unterschwellenströme aufzuzeichnen, halten Sie das Membranpotential bei minus 50 Millivolt im Spannungsklemmenmodus und wenden dann eine Reihe von hyperpolierenden Spannungsimpulsen von einer Sekunde Dauer von minus 60 Millivolt bis minus 120 Millivolt mit einem 10 Millivolt-Dekrement an. Zeichnen Sie exzitatorische postsynaptische Ströme mit der kaliumionsbasierten intrazellulären Lösung im Spannungsklemmenmodus bei einem Haltepotenzial von minus 70 Millivolt auf. Zeichnen Sie IPCKs mit Cäsium-Ionen-basierter intrazellulärer Lösung für die Aufzeichnung von IPSc auf.

Nachdem Sie das Membranpotential etwa fünf Minuten lang bei minus 70 Millivolt gehalten haben, ändern Sie das Haltepotential schrittweise auf null Millivolt. Warten Sie einige Minuten nach der Stabilisierung, und beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der IPSC-Ereignisse. Brennmuster, die durch Injektion einer Reihe von einer Sekunde depolarisierenden Stromimpulsen in ein SG-Neuron am ruhenden Membranpotential bestimmt werden, können als tonisch feuerndes, verzögertes Brennen, Lückenschießen, Initial-Burst, Phasic-Bursting, Single-Spike und Reluctant-Firing klassifiziert werden.

Dieses Bild zeigt das evozierende Protokoll für Unterschwellenströme in spannungsklemme. Diese repräsentativen Spuren zeigen die Reaktion auf hyperpolarisierende Strominjektionen, die als IH, IA und IT klassifiziert sind. Dies ist eine repräsentative Spur von SEPSc von SG Neuronen bei minus 70 Millivolt in Abwesenheit und Vorhandensein von 50 Mikromolar APV und 20 Mikromolar CNQX aufgezeichnet. Diese Ablaufverfolgung zeigt die aufgezeichneten SEPCs vor dem Hinzufügen von APV und CNQX auf einer erweiterten Zeitskala.

Nach diesem Verfahren können die Methoden wie gepaarte Patch-Klemmen-Aufnahmen oder Optogenetik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Charakterisierung spezifischer neuronaler Mikrokreise bei substantia gelatinein.