Name: Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie eine zuverlässige qPCR-basierte Methode zur Quantifizierung der intestinalen Mikrobiota von Mäusen nach oraler Antibiotikagabe. Dieses Protokoll minimiert Gewichtsverluste und ermöglicht präzise Analysen bakterieller Veränderungen.

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Diese Arbeit wurde von der UK Medical Research Council (Finanzhilfe für P.B MR/L008157/1), finanziert. R.j. wurde unterstützt durch eine Marie Curie Intra Fellowship (H2020-MSCA-IF-2015-703639); P.M.B. wurde durch eine Zugehörigkeit von UK Medical Research Council und Kings College London Doctoral Training Partnerschaft in den biomedizinischen Wissenschaften (MR/N013700/1) unterstützt.

Hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt mit ca. 6-8 Wochen alte Wildtyp (C57BL6/J) Mäusen in einer spezifischen Erreger frei (SPF) Anlage gepflegt. Alle Tierversuche wurden von der Kings College London und Francis Crick Institut Animal Welfare und ethische Nachprüfungsstelle das Vereinigte Königreich Innenministerium genehmigt. Vor Beginn jedes Tier Verfahren, stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Berechtigungen durch lokale Institution/Organisation gewonnen werden.
1. Gabe von Antibiotika
Hinweis: Werden zwei alternative Methoden zur Behandlung mit Antibiotika zur Verfügung gestellt: orale Magensonde (Schritt 1.1) und Verabreichung von Antibiotika über das Trinkwasser (Schritt 1.2).
<ol><li>Orale Magensonde<ol>
<li>Bestände der einzelnen Antibiotika durch lösen sie im Autoklaven Wasser in den folgenden Konzentrationen vorzubereiten: Ampicillin bei 100 mg/mL, Gentamicin bei 100 mg/mL, Neomycin bei 100 mg/mL, bei 10 mg/mL Metronidazol und Vancomycin bei 100 mg/mL. Filter mit einem 0,45 µm-Filter zu sterilisieren. Aliquoten und Store bei-20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika durch Mischen der Bestände über vorbereitet. Mischen Sie für ein Volumen von 1 mL 50 µL Ampicillin (5 mg/mL final), 50 µL Gentamicin (5 mg/mL final), 50 µL Neomycin (5 mg/mL final), 500 µL von Metronidazol (5 mg/mL final), 25 µL von Vancomycin (2,5 mg/mL final) und 325 µL Wasser. Der cocktail frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
		<li>Laden Sie die antibiotische Mischung in eine sterile 1 mL Spritze und beheben Sie eine entsprechende Nadel der Magensonde (20 G für 15 – 20 g Mäuse) während die Beseitigung eventuell Luftblasen zu.</li>
		<li>Magensonde Mäuse mit 200 µL des Antibiotika-Mix.<ol>
<li>Schnappen Sie sich die Haut über die Maus Schulter fest, Dehnen des Kopfes und Halses, die Speiseröhre zu begradigen. Direkt dem Kugelende der Fütterung Nadel auf das Dach des Mundes und in Richtung der Rückseite des Rachens. Dann vorsichtig in die Speiseröhre überliefern und 200 μl Lösung zu injizieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwalten Sie die antibiotische cocktail einmal täglich für die Dauer des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antibiotika im Trinkwasser Achtung: Überwachen Sie sorgfältig Maus Gewicht täglich für die ersten zwei Wochen der antibiotische Verabreichung im Trinkwasser.<ol>
<li>Bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika durch Auflösen in 1 L Wasser autoklaviert Folgendes: 1 g Ampicillin (1 g/L Finale), 1 g Neomycin (1 g/L Finale), 1 g Metronidazol (1 g/L Finale), 0,5 g Vancomycin (0,5 g/L Finale) und 8 Sachets (0,75 g) des künstlichen Süßstoff (60 g/L Finale). Schütteln Sie, bis aufgelöst. Shop bei 4 ° C. Hinweis: Süßstoff wird hinzugefügt, den Geschmack von Antibiotika zu verstecken und Mäuse Austrocknung zu verhindern. Während mehrere Süßstoff Marken arbeiten können, kann die Endkonzentration erforderlich für jede spezifische Marke abweichen.</li>
		<li>Den Antibiotika-Cocktail in eine Flasche Wasser füllen (ca. 100 mL/Flasche) und stellen Sie die Flasche auf eine Maus Käfig. Hinweis: Verwenden Sie braune Flaschen oder decken Sie die Flaschen mit Folie zu Antibiotika vor Licht zu schützen.</li>
		<li>Ersetzen des Antibiotika-Cocktails mit frischer Vorrat zweimal in der Woche für die Dauer des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sammlung von Kotproben von Hocker, Ileum Inhalt und Ileum Wand
<ol><li>Wiegen und label 2 mL autoklaviert Rohre für die Probenahme.</li>
	<li>Für die Sammlung von frischen Stuhlproben jede Maus in eine einschränkende und sammeln Sie fäkale Pellets direkt aus dem Anus in ein Sammelrohr zu. Hinweis: Proben können auch erhalten werden, indem Mäuse in einem Käfig sauber autoklaviert und Stuhlproben mit sauberen sterilisierte Pinzette zu sammeln.</li>
	<li>Einschläfern Sie die Mäuse mit CO2 Erstickung gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
	<li>Legen Sie eine Maus-Karkasse mit den Bauch voll ausgesetzt und sprühen Sie Bauchbereich mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Mit sterilisierten Pinzette und Schere, machen Sie eine Quereinschnitt im Bauch, das Peritoneum verfügbar zu machen, ohne irgendwelche internen Gewebe zu beschädigen. Heben Sie das Peritoneum und einen Einschnitt, den Darm verfügbar zu machen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Darm (aus Darm, Magen) mit Zange und Schere und legen Sie sie in eine sterile Petrischale.</li>
	<li>Verwenden Sie sorgfältig Zange um den Dünndarm (SI) zu necken abseits der mesenterialen Arterien und Fett. Erweitern Sie den Darm und legen Sie es auf eine saubere Lab wischen.</li>
	<li>Messen Sie mit einem Lineal und schneiden Sie 4 cm des distalen Ileum des SI (der nächste Teil, der Blinddarm). Schneiden Sie und entsorgen Sie die 1 cm des Darmes proximal zu den Blinddarm. Es wird ein 3 cm Teil Ileum verlassen, die verwendet wird, um die Darmbakterien zu sammeln.</li>
	<li>Halten Sie den Krummdarm Teil (3 cm) über eine 2 mL steriles Röhrchen. Sammeln Sie den Darminhalt durch Extrudieren direkt den Darm und Sammelreise der Probe in der Röhre. In diesem Beispiel werden Bakterien aus dem Ileum Inhalt haben.</li>
	<li>Vorbereiten einer 20 mL Spritze mit kalten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Ileum Teil (Verwerfen der durchströmten) spülen.</li>
	<li>Setzen Sie den Ileum Teil auf einem sauberen Papiertuch und längs mit einer Schere öffnen.</li>
	<li>Kratzen Sie die Innenseite der Krummdarm Wand mit einem Skalpell.</li>
	<li>Sammeln Sie alle Bakterien auf das Skalpell durch das Skalpell mit 1 mL PBS über eine saubere Zentrifugenröhrchen waschen. Drehen Sie mit 8.000 × g für 5 min pellet der Bakterien und den Überstand verwerfen. In diesem Beispiel enthält Bakterien aus dem Ileum-Wand. Hinweis: Stuhlproben von Hocker, Ileum Inhalt und Wand können eingefroren und bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert.</li>
	<li>Wiegen Sie die Rohre, die Proben aus dem Hocker und Ileum Inhalte enthält, und subtrahieren Sie das Gewicht aus der leere Rohre (aus Schritt 2.1) um das fäkale Gewicht in jeder Probe zu erhalten.</li>
	<li>Hocker, Ileum Inhalt und Ileum Wand Proben mit handelsüblichen Kits extrahieren Sie bakteriellen DNA. DNA-Proben bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.</li>
</ol>3. Quantifizierung der intestinalen Mikrobiota von qPCR
Hinweis: Dieses Verfahren umfasst die Generierung von Standard (Schritt 3.1) und die Methode für qPCR-Set-up für Standard- und fäkalen Proben (Schritt 3.2)
<ol><li>Generierung eines Standards für qPCR<ol>
<li>Verwenden Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der 16 s rRNA-Gen von der genomic DNA extrahiert aus einer Bakterienkultur mit den Reagenzien13 und in Tabelle 1aufgeführten PCR-Bedingungen zu verstärken.</li>
		<li>Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 1,5 % Agarosegel und reinigen Sie die DNA-Band mit einem im Handel erhältlichen DNA Extraktion Kit.</li>
		<li>Die gereinigte DNA Fragment mit einem Klonen kit (siehe die Tabelle der Materialien, verwenden Sie einen Vektor mit Antibiotikaresistenz-Marker und β-Galaktosidase (LacZ) gen Fusion für blau/weiße Kolonie Auswahl) verbinden und transformieren DH10 zuständigen E. Coli nach den Anweisungen des Herstellers. Transformation auf Ampicillin-Platte (100 µg/mL), X-gal (20 µg/mL) Luria Bertani (LB) Agarplatten (10 g/L Tryptone, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar). Inkubation über Nacht (O/N) bei 37 ° C.</li>
		<li>Wählen Sie eine einzelne Positive (weiß) Kolonie von der Platte. In 5 mL LB Brühe enthält 100 µg/mL Ampicillin zu impfen Sie und inkubieren Sie O/N bei 37 ° C, bei 250 u/min schütteln.</li>
		<li>Isolieren Sie von der O/N Kultur und reinigen Sie das Plasmid mit einem kommerziellen Miniprep Kit nach Herstellerangaben. Hinweis: Es ist wichtig, die Reihenfolge des Plasmid-Einsatzes in diesem Stadium, um sicherzustellen, dass das Plasmid nur eine Kopie der 16 s rRNA-Gen enthält und seiner Länge in Basenpaaren (bp) zu bestimmen.</li>
		<li>Das Plasmid mit einem Restriktionsenzym schneidet das Plasmid nur einmal zu linearisieren.</li>
		<li>Reinigen Sie die linearisierte Plasmid mit einem kommerziell erhältlichen Kit.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration des Plasmids durch Messung der Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der Kopien/µL Plasmid Probe mithilfe der folgenden Formel14: Anzahl der Kopien = (Menge * 6.022 × 10-23) / (Länge * 1 × 109 * 650) wo ist die DNA-Konzentration erwarb Schritt 3.1.8 (in ng/µL); und Länge beträgt die Gesamtlänge des Plasmids (mit Insert) in bp. Die Anzahl der Kopien werden als Kopien/µL bezogen werden. Hinweis: Es gibt Online-Tools, die auf Grundlage der oben genannten Formel, die einfache Berechnung der Anzahl der Plasmid-Kopien zu ermöglichen.</li>
		<li>Aliquoten und laden den Standard Bedarf bei-20 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR Set-up für Standard- und Stuhlproben<ol>
<li>Die qPCR standard (aus Schritt 3.1.10), Stuhlproben DNA (aus Schritt 2.15) und qPCR Reagenzien (aus einem handelsüblichen Bausatz) auf Eis auftauen. Hinweis: in diesem Beispiel verwendete qPCR-Reagenzien sind die SYBR Green qPCR Reaktion Mix und forward und reverse Primer (Tabelle 2).</li>
		<li>Verdünnen Sie den Standard in der DNA-freie Sterilwasser in einem Bereich von 107 bis 102 Kopien/µL (z. B. 1/5 serielle Verdünnungen von 107 bis 6,4 x 102 Kopien/µL). Verdünnen Sie Kotprobe DNA, 1/2, 1/5, 1/10.
</li>
		<li>Machen Sie eine master-Mix-Reaktion für die Gesamtzahl der Reaktionen plus 1 (Tabelle 2).</li>
		<li>Mischung 30 µL der master-Mix und 5 µL der Vorlage (Standard, Probe oder Wasser für die negativ-Kontrolle)</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL dieser Mischung in jede Vertiefung in einer optischen 384-Well qPCR-Platte. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung.</li>
		<li>Versiegeln den qPCR-Ort, kurz Zentrifugieren und laden Sie die Platte auf die qPCR-Maschine programmiert mit folgenden Radsport Bedingungen: 95 ° C für 20 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min.</li>
		<li>Erhalten Sie CT -Werte für Standard- und Proben.</li>
		<li>Generieren Sie eine Standardkurve durch Auftragen der CT -Werte für Ansprüche gegen den Logarithmus der Anzahl Kopie des Plasmids (wie in Schritt 3.1.9 berechnet). Durchführen Sie lineare Regression der Standardkurve.</li>
		<li>Berechnen Sie die 16 s rDNA Heftnummern für Stuhlproben durch Interpolation CT -Werte (in Schritt 3.2.2 erhaltenen) in der Standardkurve. Hinweis: 16 s rDNA Heftnummern für jede Probe sollte korrigiert werden unter Berücksichtigung den Verdünnungsfaktor der Probe (wie in Schritt 3.2.2 vorbereitet), das Endvolumen Nukleinsäuren, die (in Schritt 2.15) eluiert waren und die Quantität der Kotprobe (berechnet in Schritt 2.14) zu erhalten gen-Kopien pro Gramm Kot.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier bieten wir experimentelle Protokolle für die orale Verabreichung von Antibiotika für Mäuse und Quantifizierung von fäkalen Bakterien durch qPCR. Die Kombination von Antibiotika verwendet in diesem Protokoll (mit Ampicillin, Gentamicin, Neomycin, Metronidazol und Vancomycin) Ziele grampositive und gramnegative Bakterien, bakterizide Aktivität gegen ein breites Spektrum an Bakterien bietet. Orale Magensonde und Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser stark verringern fäkalen Bakterien laden5,6,12. Darüber hinaus haben beide Behandlungen eine tiefgreifende Wirkung auf den Phänotyp der Mäuse, wie sie typisch für keimfreie Mäuse einschließlich reduzierter Milz Größe und vergrößerte Blinddarm mehrere Merkmale zu entwickeln. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens zur antibiotischen Verwaltung kann möglicherweise auf die Länge des Experiments abhängen, wie die orale Magensonde Methode tägliche Verabreichung von Antibiotika erfordert, als arbeitsintensiver und möglicherweise mehr Unbehagen an der Tiere auf lange Sicht.
Für die Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser muss Vorsicht mit dem Zusatz des Süßstoffes, die antibiotische Mischung genommen werden, da dies ein entscheidender Faktor, um Mäuse vor Austrocknung zu halten. Mehrere Gruppen haben gezeigt, wie Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser (ohne Zusatz von Süßstoff) führt zu sehr starken und schnellen Gewichtsverlust mit alle Mäuse verlieren mehr als 20 % des ursprünglichen Körpergewichts in den ersten Tagen des Experiment5 , 6. in unserem Protokoll die Verwendung von Süßstoff Saccharin-basierte schien ausreichen, um den Antibiotika Geschmack im Wasser und Mäuse abgenommen in den ersten Tagen nach der Verabreichung der Antibiotika zu maskieren, aber ihr Gewicht hat sich schnell erholt nach diesem ( Abbildung 1). Dennoch in unseren Experimenten ca. 5-10 % der Mäuse noch erreichen den menschlichen Endpunkt von > 20 % Verlust der Grundlinie Körpergewicht und musste eingeschläfert werden. Wir haben auch getestet, Sucralose-basierte Süßungsmittel, die völlig versäumt, Mäuse Austrocknung zu verhindern (100 % der Mäuse verloren > 20 % des Gewichts) während andere Autoren ähnliche Fehler für Süßungsmittel Aspartam-basierten5,6veröffentlicht haben. Hinzu kommt, sollten Alter, genetische Hintergrund und allgemeine Gesundheitszustand der Mäuse für die Experimente verwendet berücksichtigt werden da sie Gewichtsverlust und Wohlbefinden der Tiere während der Behandlung mit Antibiotika beeinflussen können. Daher sollten sorgfältige Überwachung der Mäuse Gewicht und allgemeine Gesundheitszustand täglich während der ersten zwei Wochen der oralen Verabreichung der Antibiotika erfolgen.
qPCR Methoden bieten einen schnellen und kostengünstigen Ansatz zur Quantifizierung der 16 s rRNA in Stuhlproben. Jedoch einige Einschränkungen bezüglich dieser Technik einschließlich betrachtet werden: ich) die Voraussetzung für eine zuverlässige Qualitätsstandard; (II) die Design und Effizienz der qPCR Primer; (III) die Tatsache, dass Mikroorganismen verschiedene Heftnummern der 16 s rRNA-Gen haben können, können somit gen Kopien nicht direkt Zelle zählt15gleich. Dennoch, qPCR ist eine robuste und empfindliche Methode ermöglicht schnelle Analyse der Stuhlproben. Diese Methode ist besonders nützlich, um schnell die Wirkung der verschiedenen Behandlungen (einschließlich Antibiotika) in fäkale bakterielle Belastungen wie detaillierte hier überprüfen. Darüber hinaus obwohl wir ein Protokoll für die Quantifizierung von insgesamt 16 s bieten rRNA, diese Methode kann leicht angepasst werden (indem Sie entwerfen spezifische Primer16) ermöglicht die Identifizierung der einzelnen bakterielle Taxa, wodurch sowohl quantitative und qualitative Informationen über Microbiome Größe und Zusammensetzung.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir zwei Protokolle für orale antibiotische Behandlung von Mäusen und eine qPCR basierende Methode, Antibiotika-induzierte Veränderungen im fäkalen Bakterien zu quantifizieren bereitgestellt. Obgleich diese Protokolle weiter optimiert und können in mit anderen Ansätzen, nach experimentellen Bedürfnissen Kombination, können sie als schnelle, kostengünstige und zuverlässige Werkzeuge die murine intestinale Mikrobiota manipulieren und um die Auswirkungen zu studieren dienen. der antibiotischen Behandlung bei intestinalen Homöostase und Krankheit.

Die Säugetier-Magen-Darm-Schleimhaut ist eine einzigartige Umgebung, die kolonisiert durch eine hochkomplexe Mischung von Mikroorganismen, die eine symbiotische Beziehung mit dem Host zu etablieren. Das Abwehrsystem der Darmschleimhaut besteht aus einer Epithelschicht und eine Fülle von Immunzellen, die Kommensalen innerhalb des Darms zu beschränken, unter Wahrung ihrer Zahl und Vielfalt. Im Gegensatz dazu sind Kommensale Organismen für die Entwicklung eines funktionsfähigen Immunsystems erforderlich. Während Interaktionen zwischen Host und Kommensalen Bakterien normalerweise vorteilhaft sind, wird es immer deutlicher, dass das Dysregulated Immunsystem-Mikrobiota Übersprechen die Entwicklung von chronischen Entzündungskrankheiten, solche Asinflammatory Darm begünstigen können Krankheit, Arthritis oder Asthma1,2.
Der Darm Microbiota kann durch verschiedene Faktoren verändert werden, aber vielleicht sind die drastischsten Veränderungen induziert durch antibiotische Behandlung, die die Größe und Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften3,4stark verändert. Während die Vorteile von Antibiotika zur Behandlung von Infektionen unbestritten sind, können die Mikrobiota induziert durch Antibiotika Exposition beim Menschen auch Immunabwehr Änderungen nachteilige Auswirkungen auf die Gesundheit führen kann. Zum Beispiel Antibiotika-Behandlung bei Menschen mit einem erhöhten Risiko von Clostridium Difficileverknüpft wurde-induzierte, Durchfall, Asthma und bestimmte Arten von Krebs3. Antibiotische Behandlung bei Mäusen rekapituliert die Auswirkungen und die langfristige Veränderungen im Darm Gemeinschaften der mit Antibiotika behandelten Patienten gefunden und Untersuchung der mechanistischen Verbindungen zwischen Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaften und Immunzelle Funktion aktiviert hat. Mehrere Berichte haben jedoch gezeigt, dass die Verabreichung von Antibiotika auf das Trinkwasser Ad Libitum in sehr deutlicher Gewichtsverlust führt, wie Trinkwasser, vermutlich wegen seiner schlechten Geschmack5,6Mäuse unterlassen. So kann die schwere Dehydratation, orale antibiotische Verabreichung begleitenden in diesen Modellen die Interpretation der Experimente mit dem Ziel, die Wirkung der antibiotischen Behandlung in Immunzelle Funktion identifizieren erschweren.
Mehrere Ansätze können verwendet werden, um die Größe und Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften in den Darm Fach7zu erkunden. Nächste Generation Sequenziertechnologien lieferten wertvolle Daten auf dieser Angelegenheit8, aber diese Methoden relativ teuer sind und benötigen kompetente bioinformatische Analysen für die Interpretation der Daten. Auf der anderen Seite, traditionelle mikrobiologische Kulturmethoden ermöglichen die Erkennung von Bakterienarten, aber sie haben geringen Empfindlichkeit und ein großer Teil der Kommensalen Bakterien (insbesondere Anaerobier) sind sehr schwer oder gar nicht mit pflegen derzeit verfügbaren Methoden8. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Techniken werden zunehmend zur Quantifizierung und Identifizierung von fäkalen Bakterien-Spezies eingesetzt, da sie eine schnelle und zuverlässige kulturunabhängig Maßnahme des gesamten mikrobiellen Belastung bieten. Dementsprechend haben qPCR Methoden, Veränderungen in der Mikrobiota, verbunden mit dem Alter oder mit einer Progression von mehreren Krankheiten einschließlich entzündliche Darm-Krankheit9,10studieren nützlich erwiesen. Im Einklang mit dieser bieten qPCR Methoden einen schnellen und kostengünstigen Ansatz um die Wirkung der verschiedenen Behandlungen (einschließlich Antibiotika) zu überprüfen in fäkale bakterielle Belastungen und Mikrobiota Zusammensetzung10,11,12.
Hier präsentieren wir Ihnen Schritt für Schritt detailliert über zwei unterschiedliche Protokolle für die orale Verabreichung der Antibiotika, Mäuse, Kotprobe Sammlung, DNA-Extraktion, Erarbeitung von Normen und Quantifizierung von Bakterien in Stuhlproben von qPCR. Diese Protokolle stellen eine zuverlässige Methode, die intestinale Mikrobiota bei Mäusen zu manipulieren und die Auswirkungen der antibiotischen Behandlung bei intestinalen Homöostase und Krankheit zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Neomycnin-Trisulfat-Salzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin-Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat-Salz</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Süßstoff Sweet'n</td><td>Low Sweet'N Low</td><td></td><td>Erhältlich in Deutschland von Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoyl B-D-galactopyranosid)</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-Qualität Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>mit ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA cloningTM für die Sequenzierung</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp fast DNA Stool Mini-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel&nbsp; Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,45 &Mikro; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM sterile Skalpellklingen aus Kohlenstoffstahl</td><td>Fisher scientific</td><td>11792724</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (20 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Kristallklares Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Ultra high Rückgewinnungs-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Orale Dosiernadeln 20 G x 38 mm gebogen (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin Petrischale 50 mm&nbsp;</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR-Plattendichtungen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM optische 384-Well-Platte&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Angewandte Biosysteme)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 Echtzeit-PCR-System mit 384-Well-Block</td><td>Thermo Fisher Scientific (Angewandte Biosysteme)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (Nanodrop 1000)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prismen-Mikrozentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax Thermocycler</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative polymerase kettenreaktion-basierte analysen der murinen intestinale mikrobiota nach behandlung mit oralen antibiotika

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Der Darm Microbiota hat einen zentralen Einfluss auf die menschliche Gesundheit. Mikrobielle Dysbiose ist verbunden mit vielen gemeinsamen Immunopathologies wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen, Asthma und Arthritis. So ist das Verständnis der Mechanismen, die Mikrobiota Immunsystem Übersprechen von entscheidender Bedeutung. Antibiotikum Verwaltung, während Beihilfe Erreger Abfertigung, induziert auch drastische Veränderungen in der Größe und Zusammensetzung der intestinalen bakteriellen Gemeinschaften, die sich auf die menschliche Gesundheit auswirken kann. Antibiotische Behandlung bei Mäusen rekapituliert die Auswirkungen und die langfristige Veränderungen der menschlichen Mikrobiota von Antibiotika behandelten Patienten und ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Verbindungen zwischen Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaften und Immunzelle Funktion. Während mehrere Methoden zur antibiotischen Behandlung von Mäusen beschrieben worden, einige von ihnen induzieren, schwere Dehydratation und Gewichtsabnahme erschwert die Interpretation der Daten. Hier bieten wir zwei Protokolle für orale Antibiotika Einnahme, die für die Langzeitbehandlung von Mäusen verwendet werden kann, ohne daß große Gewichtsabnahme. Diese Protokolle stellen eine Kombination von Antibiotika grampositive und gramnegative Bakterien verwenden und entweder Ad Libitum im Trinkwasser oder durch orale Magensonde bereitgestellt werden können. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der mikrobiellen Dichte in Stuhlproben von qPCR die verwendet werden können, um die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung zu überprüfen. Die Kombination dieser Ansätze bietet eine bewährte Methodik für die Manipulation der intestinalen Mikrobiota und die Studie über die Auswirkungen der antibiotischen Behandlung bei Mäusen.

Hier bieten wir zwei alternative Protokolle für orale antibiotische Behandlung von Mäusen. Abbildung 1 zeigt den Prozentsatz des Körpergewichts (bezogen auf die ursprüngliche Grundlinie Gewicht für jedes Tier) bei Mäusen, die mit Antibiotika behandelt, entweder durch orale Magensonde (rot) oder im Trinkwasser (blau) für 10 aufeinanderfolgende Tage. Keine spürbaren Gewichtsverlust findet sich bei Mäusen, die Antibiotika erhalten von oralen Magensonde. Jedoch wenn Mäuse mit Antibiotika Ad Libitum im Trinkwasser behandelt werden, verlieren Gewicht (~ 10 %) innerhalb der ersten paar Tage Antibiotika Verwaltung, sondern normale Gewichtszunahme danach (Abbildung 1) zu erholen. Dennoch, etwa 5-10 % der Mäuse erhalten Antibiotika im Trinkwasser erreichen &gt; 20 % Gewichtsverlust innerhalb der ersten Woche der Behandlung, die in diesem Fall sind sie eingeschläfert.
Die Quantifizierung von Bakterien in Stuhlproben erfordert den Einsatz von einer angemessenen Standardkurve die gewonnen wird durch das Protokoll Kopienzahl für den Standard (wie in Schritt 3.2.2 berechnet) im Vergleich zu den CT Werte aus qPCR (Schritt 3.2.7) auftragen. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Beispiel aus einer Standardkurve entspricht die Standardkurve Leistungskriterien mit einem R-2 -Wert von 0.99827, einer Neigung von-3.09 und einen Wirkungsgrad ((-1 + 10^(-1/slope))*100) von 110 %. R2 Werte von 0,99 und PCR-Effizienz im Bereich von 90 bis 110 % werden bevorzugt. Innerhalb des linearen Bereichs ermöglicht die Analyse Regressionsgleichung Quantifizierung der 16 s rDNA Fülle innerhalb der Stuhlproben. Abbildung 2 b zeigt die Anzahl der 16 s rDNA Kopien im fäkalen Hocker, SI-Gehalt und SI Wand. In Abbildung 2 b werden Daten als 16 s rDNA Kopien/g der Kotprobe für fäkale Hocker und SI-Gehalt angezeigt. Für SI-Wand werden Daten als Gesamtzahl der 16 s rDNA Kopien erhalten von Bakterien erholte sich von den 3 cm von SI-Wand (wie die Menge des Ausgangsmaterials zu klein, um eine genaue Gewicht zu erhalten ist) dargestellt.
Um die Wirkung von Antibiotika auf die Dichte der Bakterien in Stuhlproben zu bewerten, Mäuse wurden behandelt mit Antibiotika durch orale Magensonde täglich für 10 Tage (Tage 1 bis 10) und Stuhlproben wurden vor (Tag 0), zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung mit Antibiotika () Tag 5 und 10), und 7 Tage nach Beendigung der antibiotischen Verwaltung (Tag 17; ( Abb. 3A). Wie in Abbildung 3 bgezeigt, induziert antibiotischer Behandlung einen starken Rückgang der Zahl von 16 s rDNA Kopien/g Kot am Tag 5 und 10, während die Dichte der Bakterien im Kot erholte sich auf ein normales Niveau (vergleichbar mit Vorbehandlung) 1 Woche nach erkannt Antibiotika-Verwaltung wurde (Tag 17) gestoppt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> Abbildung 1: Verabreichung von Antibiotika. Mäuse erhalten Antibiotika, orale Magensonde (rot) oder im Trinkwasser (blau) für 10 aufeinanderfolgende Tage. Gewichte von Mäusen während der gesamten Dauer der Experimente im Vergleich zu ursprünglichen Gewicht vor der antibiotische Verabreichung (Tag 0) zeigt. Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> Abbildung 2: 16 s rRNA Gens qPCR Verstärkung des Standards und Stuhlproben. (A) lineare Regression der Standardkurve Standardkurve Deskriptoren. (B) Berechnung der gen Häufigkeiten von Stuhlproben. Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> Abbildung 3: fäkalen Bakterien während der Behandlung mit Antibiotika. (A) schematische Darstellung der Zeitplan für die antibiotische Verwaltung durch orale Magensonde (Ab) und Entnahme von Proben mit dargestellt *. (B) 16 s rDNA Kopien pro Gramm Kot in Stuhlproben von Mäusen, die an den angegebenen Tagen gesammelt. Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Volumen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>8 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Puffer-10 X</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10mM)</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - F Grundierung (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - R Grundierung (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polymerase</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtvolumen</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer-Sequenzen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - F-Grundierung</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - R Grundierung</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Radfahren-Bedingungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: PCR Reagenzien und Bedingungen. Diese Tabelle enthält die Reagenzien und PCR-Radsport-Zustände, 16 s rRNA-Gen von Bakterienkultur zur Erzeugung von einem Standard in der qPCR-Assays verwenden zu verstärken. Primer-Sequenzen wurden ursprünglich von Kruglov Et Al. veröffentlicht. 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>SYBR Green-master-Mix (2 X)</td>
			<td>17.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - F Grundierung (10 mM)</td>
			<td>0,7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubakterien - R Grundierung (10 mM)</td>
			<td>0,7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: qPCR-master-Mix. Die Volumes angezeigt (Endvolumen 35 µL) sind für ein einzelnes Sample in dreifacher Ausfertigung (10 µL) auf einer qPCR 384-Well-Platte (Buchhaltung für extra für Pipettier Fehler 5 µL) ausgeführt werden. Der Betrag kann je nach Anzahl der zu analysierenden Proben hochskaliert.

Hier bieten wir ausführliche Protokolle für die orale Verabreichung von Antibiotika für Mäuse, Sammlung von Stuhlproben, DNA-Extraktion und Quantifizierung von fäkalen Bakterien durch qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung von Veränderungen ist Darmmikrobiota von Mäusen nach oraler Antibiotika-Verabreichung. Dies kann helfen, die Forschung über Kreuzmikrobiota-Wechselwirkungen, die Einblick in die Pathologien im Zusammenhang mit mikrobiellen Dysbiose wie entzündliche Darmerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Antibiotika-Behandlungssysteme ist, dass sie die charakteristische Gewichtsabnahme verhindern, die normalerweise mit oraler Antibiotika-Verabreichung an Mäuse verbunden ist.Um die Antibiotikabehandlung durch orale Gavage zu präparieren, bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika vor, indem Sie Stofflösungen mischen, die wie im Tech-Protokoll beschrieben vorbereitet wurden. Für ein Volumen von Milliliter mischen 50 Mikroliter Ampicillin, 50 Mikroliter Gentamicin, 50 Mikroliter Neomycin, 500 Mikroliter Metronidazol, 25 Mikroliter Vancomycin und 325 Mikroliter Wasser. Das Antibiotikum auf eine Ein-Milliliter-Spritze geben, während Blasen eliminiert werden, und befestigen Sie eine geeignete Nadel.Schnappen Sie sich die Haut über die Schulter der Maus fest und strecken Sie Kopf und Hals, um die Speiseröhre zu begradigen. Richten Sie die Kugelspitze der Futternadel entlang des Munddachs und in Richtung der Rückseite des Rachens. Dann geben Sie es vorsichtig in die Speiseröhre und injizieren Sie die 200 Mikroliter Lösung.Den Antibiotikum-Cocktail einmal täglich für die Dauer des Experiments verabreichen. Alternativ, um Antibiotika durch das Trinkwasser zu verabreichen, bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika, wie im Tech-Protokoll beschrieben. Es ist wichtig, Süßstoff in die Antibiotika-Mischung aufzunehmen, da dies ein entscheidender Faktor ist, um Eine Austrocknung von Mäusen zu verhindern.Füllen Sie den Antibiotikum-Cocktail mit ca. 100 Millilitern pro Flasche in eine Wasserflasche. Schützen Sie die Flasche vor Licht und legen Sie sie in einen Mauskäfig. Ersetzen Sie den Antibiotikum-Cocktail zweimal pro Woche für die Dauer des Experiments mit frischem Vorrat.Sorgfältige Überwachung des Mäusegewichts und des allgemeinen Gesundheitszustandes sollte täglich während der gesamten Verabreichung von Antibiotika vorgeformt werden. Wiegen und beschriften Sie zwei Milliliter-Autoklavenfürden zur Probenentnahme. Für die Sammlung von frischen Stuhlproben legen Sie jede Maus in einem Restrainer.Dann fäkale Pellets direkt aus dem Anus in einem Sammelrohr sammeln. Nach der Durchführung von Euthanasie, wie im Tech-Protokoll beschrieben, legte eine Maus Karkasse mit dem Bauch vollständig exponiert und sprühen den Bauchbereich mit 70%Ethanol. Mit sterilisierten Zangen und Schere machen einen Querschnitt im Bauch, um das Peratenium freizulegen, ohne innere Gewebe zu beschädigen.Heben Sie das Peratenium und machen Sie einen Schnitt, um den Darm zu belichten. Entfernen Sie den Darm mit der Zange und Schere und legen Sie es in eine sterile Petrischale. Verwenden Sie vorsichtig Zangen, um den Dünndarm weg von den mesenterischen Arterien und Fett zu necken.Erweitern Sie den Darm und legen Sie ihn auf ein sauberes Labortuch. Mit einem Lineal messen und schneiden vier Zentimeter des distalen Ileum des Dünndarms. Schneiden und entsorgen Sie den einen Zentimeter Darm proximal zum Cecum.Es wird einen drei Zentimeter großen Teil des Ileums übrig haben, der zur Sammlung von Darmbakterien verwendet wird. Halten Sie den Ileum-Anteil über ein zwei Milliliter steriles Rohr. Sammeln Sie den Darmgehalt, indem Sie den Darm direkt extrudieren und die Probe in der Röhre sammeln.Diese Probe wird Bakterien aus dem Ileum-Gehalt haben. Bereiten Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit kalter Phosphatgepufferung saline vor und spülen Sie den Ileum-Teil, der den Durchfluss durchlässt. Legen Sie den Ileum-Teil auf eine sterile Petrischale und öffnen Sie ihn längs mit einer Schere.Zerkleinern Sie das Innere der Ileumwand mit einem Skalpell. Sammeln Sie alle Bakterien auf dem Skalpell, indem Sie es mit einem Milliliter PBS über ein sauberes Zentrifugenrohr waschen. Drehen Sie bei achttausend Mal G für fünf Minuten, um die Bakterien zu pellet.Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand. Diese Probe wird Bakterien aus der Ileum-Wand enthalten. Wiegen Sie die Rohre, die die Proben von Stuhl und Ileum enthalten.Subtrahieren Sie das Gewicht von den leeren Rohren, um das Fäkaliengewicht in jeder Probe zu erhalten. Extrahieren Sie bakterielle DNA aus Stuhl-, Ileum-Gehalt und Ileum-Wandproben mit handelsüblichen Kits. Bewahren Sie die DNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung auf.Thaw den qPCR-Standard, Fäkalien-Dna und qPCR-Reagenzien aus einem handelsüblichen Kit auf Eis. Verdünnen Sie den Standard in sterilem DNA-freiem Wasser in einem Bereich von 10 bis sieben bis zehn bis zu zwei Kopien pro Mikroliter. Verdünnen Sie die Fäkalien-Dna auf eine Hälfte, eine Fünftel- und ein Zehntelkonzentration.Dann machen Sie eine Master-Mix-Reaktion für die Gesamtzahl der Reaktionen plus eins. Mischen Sie 30 Mikroliter der Master-Mischung und 5 Mikroliter der Schablone, die entweder der Standard, Probe oder Wasser für die Negativkontrolle ist. Dann fügen Sie 10 Mikroliter dieser Mischung zu jedem Brunnen in einem 384 gut optischen qPCR-Platte.Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung aus. QPCR-Platte und Zentrifuge kurz versiegeln. Laden Sie dann die Platte auf die qPCR-Maschine, die wie im Tech-Protokoll aufgeführt programmiert ist.Schließlich erhalten Sie die Zyklusschwellenwerte für den Standard und Proben, bevor Sie die 16S rDNA Kopiernummern für Fäkalienproben berechnen. Repräsentative Ergebnisse zeigen Gewichtsverlust bei Mäusen nach Verabreichung von Antibiotika durch orale Gavage oder durch das Trinkwasser. Bei Mäusen, die Antibiotika durch orale Gavage erhalten, wird kein spürbarer Gewichtsverlust festgestellt.Wenn Mäuse mit Antibiotika im Trinkwasser behandelt werden, verlieren sie innerhalb der ersten Tage der Behandlung etwa 10% ihres Körpergewichts, erholen sich danach aber wieder normal. Die Quantifizierung von Bakterien in Fäkalienproben erfordert die Verwendung einer Standardkurve, die durch Plotten des Logarithmus der Kopiernummer für den Standard im Vergleich zu den in der qPCR erhaltenen C-T-Werten ermittelt wird. Innerhalb des linearen Bereichs ermöglicht die Regressionsanalysegleichung die Quantifizierung der 16S rDNA-Fülle innerhalb der Fäkalienproben.Wie hier gezeigt für Stuhl, Dünndarmgehalt und Dünndarm-Wandproben. Nach fünf oder zehn Tagen oraler Verabreichung von Antibiotika gibt es eine starke Abnahme der Dichte von Bakterien in Stuhlproben von antibiotikabehandelten Mäusen. Jedoch die Dichte der Bakterien in Kot erholt sich auf ein normales Niveau eine Woche nach Antibiotika-Verabreichung gestoppt wird.Sowohl die orale Gavage als auch die Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser verringern kurzzeitig die fäkale bakterielle Belastung bei behandelten Mäusen. Forscher, die die individuelle Methode auswählen, die den experimentellen Anforderungen besser entspricht, berücksichtigen Faktoren wie die Dauer der Behandlung. Die qPCR-Methode zur Quantifizierung von Bakterien kann modifiziert werden, um einzelne bakterielle Taxa mit spezifischen Primern zu quantifizieren.Dies wird sowohl quantitative als auch qualifizierte Informationen über die Größe und Zusammensetzung des Mikrobioms liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Lo, B. C., et al. Chronische Salmonellen-Infektion induzierte Darmfibrose. J. Vis. Exp. (2019)Das Video demonstriert die Quantifizierung der Bakterienlast in einem Mausmodell einer chronischen Infektion mit streptomycinresistenter Salmonella-Typhimurium.  Nach Euthanasie und steriler Dissektion werden Müses- und Milzgewebe entnommen, mit Stahlperlen homogenisiert, um Bakterien freizusetzen, und seriell verdünnt. Verdünnungen werden auf selektivem Agar verdünnt, und sichtbare Kolonien...

Quantifizierung der bakteriellen Gewebebelastung in einem Mausmodell chronischer Darminfektion

Die Wirksamkeit von Antibiotika wird am häufigsten durch die Durchführung von kinetischen Abtötungsstudien und die Messung von koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt. Durch die Integration der Rasterelektronenmikroskopie (REM) in diese Standardmethoden können wir die pharmakologischen Wirkungen der Behandlung zwischen verschiedenen Antibiotika unterscheiden.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

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Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

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Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

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In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.

Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

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Verwendung der Mikropipetten-gesteuerten Verabreichung von Medikamenten als alternative Methode zur oralen Sonde in Nagetiermodellen

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Besiedlung mit Murine pks+ Escherichia coli unter nicht-entzündlichen Bedingungen

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Erfahren Sie eine zuverlässige qPCR-basierte Methode zur Quantifizierung der intestinalen Mikrobiota von Mäusen nach oraler Antibiotikagabe. Dieses Protokoll minimiert Gewichtsverluste und ermöglicht präzise Analysen bakterieller Veränderungen.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika (Video) | JoVE Journal

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

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