Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung von Veränderungen ist Darmmikrobiota von Mäusen nach oraler Antibiotika-Verabreichung. Dies kann helfen, die Forschung über Kreuzmikrobiota-Wechselwirkungen, die Einblick in die Pathologien im Zusammenhang mit mikrobiellen Dysbiose wie entzündliche Darmerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Antibiotika-Behandlungssysteme ist, dass sie die charakteristische Gewichtsabnahme verhindern, die normalerweise mit oraler Antibiotika-Verabreichung an Mäuse verbunden ist.

Um die Antibiotikabehandlung durch orale Gavage zu präparieren, bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika vor, indem Sie Stofflösungen mischen, die wie im Tech-Protokoll beschrieben vorbereitet wurden. Für ein Volumen von Milliliter mischen 50 Mikroliter Ampicillin, 50 Mikroliter Gentamicin, 50 Mikroliter Neomycin, 500 Mikroliter Metronidazol, 25 Mikroliter Vancomycin und 325 Mikroliter Wasser. Das Antibiotikum auf eine Ein-Milliliter-Spritze geben, während Blasen eliminiert werden, und befestigen Sie eine geeignete Nadel.

Schnappen Sie sich die Haut über die Schulter der Maus fest und strecken Sie Kopf und Hals, um die Speiseröhre zu begradigen. Richten Sie die Kugelspitze der Futternadel entlang des Munddachs und in Richtung der Rückseite des Rachens. Dann geben Sie es vorsichtig in die Speiseröhre und injizieren Sie die 200 Mikroliter Lösung.

Den Antibiotikum-Cocktail einmal täglich für die Dauer des Experiments verabreichen. Alternativ, um Antibiotika durch das Trinkwasser zu verabreichen, bereiten Sie einen Cocktail von Antibiotika, wie im Tech-Protokoll beschrieben. Es ist wichtig, Süßstoff in die Antibiotika-Mischung aufzunehmen, da dies ein entscheidender Faktor ist, um Eine Austrocknung von Mäusen zu verhindern.

Füllen Sie den Antibiotikum-Cocktail mit ca. 100 Millilitern pro Flasche in eine Wasserflasche. Schützen Sie die Flasche vor Licht und legen Sie sie in einen Mauskäfig. Ersetzen Sie den Antibiotikum-Cocktail zweimal pro Woche für die Dauer des Experiments mit frischem Vorrat.

Sorgfältige Überwachung des Mäusegewichts und des allgemeinen Gesundheitszustandes sollte täglich während der gesamten Verabreichung von Antibiotika vorgeformt werden. Wiegen und beschriften Sie zwei Milliliter-Autoklavenfürden zur Probenentnahme. Für die Sammlung von frischen Stuhlproben legen Sie jede Maus in einem Restrainer.

Dann fäkale Pellets direkt aus dem Anus in einem Sammelrohr sammeln. Nach der Durchführung von Euthanasie, wie im Tech-Protokoll beschrieben, legte eine Maus Karkasse mit dem Bauch vollständig exponiert und sprühen den Bauchbereich mit 70%Ethanol. Mit sterilisierten Zangen und Schere machen einen Querschnitt im Bauch, um das Peratenium freizulegen, ohne innere Gewebe zu beschädigen.

Heben Sie das Peratenium und machen Sie einen Schnitt, um den Darm zu belichten. Entfernen Sie den Darm mit der Zange und Schere und legen Sie es in eine sterile Petrischale. Verwenden Sie vorsichtig Zangen, um den Dünndarm weg von den mesenterischen Arterien und Fett zu necken.

Erweitern Sie den Darm und legen Sie ihn auf ein sauberes Labortuch. Mit einem Lineal messen und schneiden vier Zentimeter des distalen Ileum des Dünndarms. Schneiden und entsorgen Sie den einen Zentimeter Darm proximal zum Cecum.

Es wird einen drei Zentimeter großen Teil des Ileums übrig haben, der zur Sammlung von Darmbakterien verwendet wird. Halten Sie den Ileum-Anteil über ein zwei Milliliter steriles Rohr. Sammeln Sie den Darmgehalt, indem Sie den Darm direkt extrudieren und die Probe in der Röhre sammeln.

Diese Probe wird Bakterien aus dem Ileum-Gehalt haben. Bereiten Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit kalter Phosphatgepufferung saline vor und spülen Sie den Ileum-Teil, der den Durchfluss durchlässt. Legen Sie den Ileum-Teil auf eine sterile Petrischale und öffnen Sie ihn längs mit einer Schere.

Zerkleinern Sie das Innere der Ileumwand mit einem Skalpell. Sammeln Sie alle Bakterien auf dem Skalpell, indem Sie es mit einem Milliliter PBS über ein sauberes Zentrifugenrohr waschen. Drehen Sie bei achttausend Mal G für fünf Minuten, um die Bakterien zu pellet.

Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand. Diese Probe wird Bakterien aus der Ileum-Wand enthalten. Wiegen Sie die Rohre, die die Proben von Stuhl und Ileum enthalten.

Subtrahieren Sie das Gewicht von den leeren Rohren, um das Fäkaliengewicht in jeder Probe zu erhalten. Extrahieren Sie bakterielle DNA aus Stuhl-, Ileum-Gehalt und Ileum-Wandproben mit handelsüblichen Kits. Bewahren Sie die DNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung auf.

Thaw den qPCR-Standard, Fäkalien-Dna und qPCR-Reagenzien aus einem handelsüblichen Kit auf Eis. Verdünnen Sie den Standard in sterilem DNA-freiem Wasser in einem Bereich von 10 bis sieben bis zehn bis zu zwei Kopien pro Mikroliter. Verdünnen Sie die Fäkalien-Dna auf eine Hälfte, eine Fünftel- und ein Zehntelkonzentration.

Dann machen Sie eine Master-Mix-Reaktion für die Gesamtzahl der Reaktionen plus eins. Mischen Sie 30 Mikroliter der Master-Mischung und 5 Mikroliter der Schablone, die entweder der Standard, Probe oder Wasser für die Negativkontrolle ist. Dann fügen Sie 10 Mikroliter dieser Mischung zu jedem Brunnen in einem 384 gut optischen qPCR-Platte.

Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung aus. QPCR-Platte und Zentrifuge kurz versiegeln. Laden Sie dann die Platte auf die qPCR-Maschine, die wie im Tech-Protokoll aufgeführt programmiert ist.

Schließlich erhalten Sie die Zyklusschwellenwerte für den Standard und Proben, bevor Sie die 16S rDNA Kopiernummern für Fäkalienproben berechnen. Repräsentative Ergebnisse zeigen Gewichtsverlust bei Mäusen nach Verabreichung von Antibiotika durch orale Gavage oder durch das Trinkwasser. Bei Mäusen, die Antibiotika durch orale Gavage erhalten, wird kein spürbarer Gewichtsverlust festgestellt.

Wenn Mäuse mit Antibiotika im Trinkwasser behandelt werden, verlieren sie innerhalb der ersten Tage der Behandlung etwa 10% ihres Körpergewichts, erholen sich danach aber wieder normal. Die Quantifizierung von Bakterien in Fäkalienproben erfordert die Verwendung einer Standardkurve, die durch Plotten des Logarithmus der Kopiernummer für den Standard im Vergleich zu den in der qPCR erhaltenen C-T-Werten ermittelt wird. Innerhalb des linearen Bereichs ermöglicht die Regressionsanalysegleichung die Quantifizierung der 16S rDNA-Fülle innerhalb der Fäkalienproben.

Wie hier gezeigt für Stuhl, Dünndarmgehalt und Dünndarm-Wandproben. Nach fünf oder zehn Tagen oraler Verabreichung von Antibiotika gibt es eine starke Abnahme der Dichte von Bakterien in Stuhlproben von antibiotikabehandelten Mäusen. Jedoch die Dichte der Bakterien in Kot erholt sich auf ein normales Niveau eine Woche nach Antibiotika-Verabreichung gestoppt wird.

Sowohl die orale Gavage als auch die Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser verringern kurzzeitig die fäkale bakterielle Belastung bei behandelten Mäusen. Forscher, die die individuelle Methode auswählen, die den experimentellen Anforderungen besser entspricht, berücksichtigen Faktoren wie die Dauer der Behandlung. Die qPCR-Methode zur Quantifizierung von Bakterien kann modifiziert werden, um einzelne bakterielle Taxa mit spezifischen Primern zu quantifizieren.

Dies wird sowohl quantitative als auch qualifizierte Informationen über die Größe und Zusammensetzung des Mikrobioms liefern.