Neuartige Methoden für intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie auszuwertende Nase zu Gehirn Drug Delivery
14. November 2018
Hier beschreiben wir zwei neuartige Methoden der stabile intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie mit minimaler körperlicher Belastung für die Versuchstiere. Wir beschreiben auch eine Methode zur quantitativen Bewertung der Droge-Verteilung-Spiegel im Gehirn über die Nase zu Gehirn Weg mit radioaktiven [14C]-Inulin als Modell Substrat von wasserlöslichen Makromolekülen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der pharmazeutischen Wissenschaften über die intranasale Verabreichung und Pharmakokinetik und Pharmakologie von Arzneimitteln von Interesse zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie für die quantitative Bewertung von Nasen-Hirn-Liefermedikamentenkandidaten und Inhalationsanästhesie mit minimalem Stress für die Tiere verwendet werden kann. Die Auswirkungen dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Erkrankungen des zentralnervensystemischen Systems, da sie zur Entwicklung von Medikamentenabgabetechnologien über den Nasen-Hirn-Weg beiträgt.
Demonstriert wird das Verfahren mit Mitsuyoshi Fukuda, einem Doktoranden aus meinem Labor. Zur intranasalen Lieferung über Mikropipette in einer isolierten Radioisotopenanlage. Klebeband und Betäuben Maus auf ein Korkbrett in der Rückenposition, und verabreichen 25 Mikroliter Carbon-14 Inulin-Lösung in ein bis zwei Mikroliter-Dosen, alternativ, in die rechte und linke Nase des Tieres.
Für die umgekehrte Cannulationsabgabe von der Atemwegsseite durch die Speiseröhre, legen Sie die anästhesierte Maus unter ein Sezieren des Mikroskops, und machen Sie einen 1,5 Zentimeter großen Hautschnitt über dem Hals. Verwenden Sie Zangen, um den Schnitt zu erweitern, bis die Luftröhre freigelegt ist, und machen Sie einen Einschnitt von einem Millimeter in der freiliegenden Luftröhre. Legen Sie eine Kanüle 1,2 Zentimeter an die vormarkierte Position in den Schnitt ein und befestigen Sie das gegenüberliegende Ende der Kanüle an der Innenseite einer Inhalationsmaske.
Danach verwenden Sie Zangen, um die Speiseröhre unter der Luftröhre zu belichten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Ein-Millimeter-Schnitt in der Speiseröhre zu machen und legen Sie eine zweite Kanüle 1,4 Zentimeter in die vormarkierte Position in Richtung des hinteren Endes der Nasenhöhle. Es ist wichtig, Kanüle entsprechend dem Gewicht des Versuchstiers auf eine angemessene Länge zu legen und die Länge der Kanüle in anderen anzupassen.
Ligate die Speiseröhrenkanüle und befestige eine 27-Spur-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer Verwaltungslösung gefüllt ist, die mit einer programmierbaren Mikrospritzpumpe verbunden ist. Dann liefern Sie 25 Mikroliter Kohlenstoff-14 Inulin mit einer konstanten Geschwindigkeit von fünf Mikroliter pro Minute, bis das gesamte Lösungsvolumen verabreicht wurde. Eine langsame, aber konstante Diffusionsrate ist wichtig für die Retention von so viel Medikamentenlösung wie möglich in der Nasenhöhle.
Um die Menge an Kohlenstoff-14-Inulin zu quantifizieren, die die Blut-Hirn-Schranke 30 Minuten nach der Inulin-Verabreichung überschritten hat, verwenden Sie eine Schere, um den Schädel jedes experimentell behandelten Tieres von der Medulla-Oblongata-Seite vorsichtig zu öffnen, und verwenden Sie eine Mikrospatula, um die Gehirne sorgfältig auszuhöhlen. Legen Sie jedes Gehirn auf ein Stück saline-befeuchtetes Filterpapier in eine Petrischale auf Eis, während es geerntet wird. Und verwenden Sie einen mit Herzinsen getränkten Wattestäbchen, um Blut von der Oberfläche jedes Gehirns zu reinigen.
Als nächstes, schnell, aber sorgfältig, sezieren Sie die Gehirne in olfaktorische Glühbirne, Großhirn, und Medulla oblongata, plus Pons Abschnitte. Und legen Sie die Gehirnproben in Gewebe-Löser für eine Stunde bei 50 Grad Celsius, gefolgt von der Zugabe von 10 Mikroliter flüssigen Szintillationscocktail. Um die Radioaktivität der angewendeten Lösung zu bestimmen, übertragen Sie ein 25-Mikroliter-Aliquot der Verabreichungslösung, gelöst im Szintillationscocktail, in eine Szintillationsdurchstechflasche und messen Sie die Disintegrationen pro Minute der Kohlenstoff-14-Radioaktivität in der Hirnprobe und die aufgebrachte Lösung in einem flüssigen Szintillationszähler.
Bei Inhalationsanästhesie wird bei intranasal-medikamentös gelieferten Tieren keine experimentelle interindividuelle Variation beobachtet. Wenn die ösophageale umgekehrte Kanüle Nasenhöhlenverabreichungsmethode verwendet wird, werden in der Olfaktor-Glühbirne, dem Großhirn und der Medulla oblongata deutlich höhere Konzentrationen von Kohlenstoff-14-Inulin beobachtet als über die Mikropipette-Abgabe. Darüber hinaus wird höheres Kohlenstoff-14-Inulin in der Riechbirne und der Medulla oblongata nachgewiesen, die beide im Nasen-Hirn-Weg prominent entwickelt sind, als im Großhirn.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Nasen-Hirn-Versorgung, um die Bioaktivität großer Molekül-Therapeutika im zentralen Nervensystem zu erforschen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt zwei neuartige Methoden für eine stabile intranasale Applikation unter Inhalationsanästhesie vor, die darauf ausgelegt sind, den physikalischen Stress für Versuchstiere zu minimieren. Zudem beschreibt er eine quantitative Evaluierungsmethode zur Verteilung von Wirkstoffen im Gehirn über den Nase-Hirn-Weg unter Verwendung von radioaktiv markiertem [14C]-Inulin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pharmazeutische Wissenschaften
- Arzneimittelabgabesysteme
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Die intranasale Applikation ist ein aussichtsreicher Weg für die Arzneimittelfreigabe an das zentrale Nervensystem.
- Die Minimierung von Stress während der Experimente ist entscheidend für ethisch vertretbare Forschungspraktiken.
- Eine quantitative Bewertung der Arzneimitteldistribution kann das Verständnis der Pharmakokinetik verbessern.
- Radiomarkierte Verbindungen können als effektive Modelle zur Untersuchung von Arzneimittelabgabemechanismen dienen.
Zweck der Studie
- Entwicklung von Methoden zur stabilen intranasalen Medikamentenverabreichung.
- Beurteilung der Wirksamkeit der Medikamentenabgabe über den nasalen Weg zum Gehirn.
- Minimierung der physischen Belastung für Versuchstiere während der Verfahren.
Verwendete Methoden
- Verabreichung einer Kohlenstoff-14-Inulin-Lösung mittels Mikropipette.
- Anwendung von Inhalationsanästhesie zur Reduktion von Stress bei Mäusen.
- Positionierung der Mäuse in Rückenlage auf einer Korkplatte für Stabilität.
- Abwechselnde Verabreichung von Arzneimitteldosen in das rechte und linke Nasenloch.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Verabreichung von Wirkstoffen mit minimalem Stress für die Tiere.
- Quantitative Bewertung der erreichten Wirkstoffverteilung.
- Nachweis der Wirksamkeit der Nase-Hirn-Ableitungsmethode.
- Mögliche Auswirkungen für die Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelten Methoden bieten einen zuverlässigen Ansatz für die intranasale Arzneimittelabgabe.
- Diese Techniken können die Forschung in der Pharmakologie und bei Arzneimittelabgabesystemen voranbringen.
- Zukünftige Studien könnten breitere Anwendungen in der Therapie des zentralen Nervensystems untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Exekutive Branchenrelevanz
Die Einrichtung zuverlässiger Modelle für die Nase-Hirn-Übertragung ist entscheidend, um zentrale Nervensystem (ZNS)-gerichtete Therapeutika sicherer zu machen, indem die Blut-Hirn-Schranke umgangen wird. Die quantitative Beurteilung des Transports von Makromolekülen unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht eine vorhersagbare Einschätzung bei der Bewertung von Leitkandidaten. Diese Methoden unterstützen frühe Entscheidungen in der Entdeckungsphase, indem sie reproduzierbare pharmakokinetische Daten aus minimal belasteten Tiermodellen liefern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen zum Transport von makromolekularen Wirkstoffen über die Nase zum Gehirn mittels Quantifizierung radiomarkierter Tracer.
- Operativer Wert: Bietet eine standardisierte Applikation unter Inhalationsanästhesie, um die Variabilität zu verringern und die Reproduzierbarkeit zwischen Studien zu verbessern.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative Verteilungsdaten im Riechkolben, Großhirn und Medulla oblongata, um die Zielinteraktion und die Validierung von Transportwegen zu unterstützen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Gewährleistet eine gleichmäßige intranasale Applikation mittels Spritzenpumpe oder Mikropipette, um eine reproduzierbare Exposition gegenüber der Substanz in Screening-Kampagnen sicherzustellen.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch kontrollierte Applikationsraten und die anatomische Untersuchung von Gehirnregionen für präzise Messergebnisse.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform für verschiedene Wirkstoffkandidaten, indem die Kanülenlänge und Infusionsparameter an das Körpergewicht und die Nasenanatomie der Tiere angepasst werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Bewertung der Effizienz der Nase-Hirn-Übertragung für große Moleküle und unterstützt so die translationale Abstimmung von Biomarkern mit der ZNS-Exposition.
- Operationeller Wert: Verringert die Auswirkungen des mukoziliären Clearance durch umgekehrte Kanülierung, erhöht die Arzneimittelretention und verbessert die Signaldetektion im Hirngewebe.
- Risikominderung: Reduziert falsch-negative Ergebnisse in präklinischen Modellen, indem die Zuverlässigkeit der Applikation sowie die quantitative Empfindlichkeit verbessert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein und liefert quantitative Daten zur Nase-Hirn-Übertragung, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung nasaler Transportmechanismen und die Aufklärung von Wegen durch regionspezifische Messung der Radioaktivität.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, schonende Applikation und quantitative Detektion der Tracer-Verteilung.
- Analytik: Erzeugt Zerfallsraten pro Minute (DPM) aus der Flüssigszintillationszählung, um Gehirnregionen und Applikationsmethoden zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem der Transport makromolekularer Substanzen im Hinblick auf die zentrale Wirkstoffabgabe quantifiziert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Bewertung unterschiedlicher Wirkstoffkandidaten mittels anpassbarer Kanülenapplikation unter Inhalationsanästhesie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Nase-Hirn-Übertragung, indem die Anreicherung von Tracern in Schlüsselregionen des Gehirns entlang des Übertragungswegs quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch standardisierte Anästhesie, Positionierung und Kontrolle der Infusionsgeschwindigkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Wirkstoffen, indem mechanistische Unsicherheiten bezüglich des zentralnervösen Übertragungspotenzials verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffkandidaten basierend auf quantitativen Daten zur Hirnexposition.
Durchführungsüberlegungen
- Setzt Fachkenntnisse in der Chirurgie an Nagetieren, der Anästhesieüberwachung und im Umgang mit radioaktiven Tracern voraus.
- Hängt vom Zugang zu Präparationsmikroskopen, Mikrospritzenpumpen, Szintillationszählern und Einrichtungen für Radioisotope ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams hinsichtlich der Einfügetiefe der Kanüle, der Größe der Inzision und der Protokolle zur Gehirnpräparation.
- Beinhaltet Anpassungen bezüglich unterschiedlicher Tiergewichte und Nasenhöhlenabmessungen bei der Festlegung der Kanülenlänge.
- Praktische Einschränkungen umfassen den chirurgischen Eingriff bei der retrograden Kanülierung sowie den Bedarf an spezieller Schulung, um Konsistenz zu gewährleisten.
