Name: Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie iSCAT-Mikroskopie zur Echtzeit-Detektion einzelner Proteine aus lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht molekulare Beobachtungen ohne Fluoreszenzfarbstoffe.

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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft, eine Alexander-von-Humboldt-Professur und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC 1181) unterstützt. Wir danken Stefanie Schaffer am Universitätsklinikum Erlangen, für die Laz388 Zellen und nützliche Diskussionen. Wir danken Simone Ihloff und Maksim Schwab bei MPL für den technischen Support.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einer der wichtigsten Aspekte zur Gewinnung von Daten nützlich iSCAT ist die Fähigkeit, die richtige Fokuslage an der Oberfläche des Deckglases und darüber hinaus zu finden halten Sie diese Position für längere Zeit. Nichtbeachtung führt zu verbreiterte PSFs, schwache iSCAT Signale und Drift-assoziierten Artefakte im Dynamik-Analysen. Herausstellt, dass die Suche nach der Brennebene auf einem sauberen, blanken Deckgläschen Oberfläche nicht leichte Aufgabe ist da Oberflächen-Features nicht vor dem großen Referenz Strahl Hintergrund sichtbar sind (siehe Abbildung 4-d).
Rohe iSCAT Bilder sind oft verdeckt durch Hintergrund Signale, die von Wavefront Verunreinigungen in die Anregungsquelle entstehen, und kann behindern die Fähigkeit, die richtigen Abbildungsebene zu finden. Aktive Wavefront Subtraktion ist eine nützliche Methode, um dieses Problem zu umgehen und überwachen anschließend die iSCAT Fokus während einer Messung16. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist durch räumliche Muster Modulation. In Kürze gilt ein Funktionsgenerator ein Rechtecksignal 50 Hz für externe Ansteuerung Hafen der Piezo-Bühne, wodurch eine räumliche Muster Modulation bei der angelegten Frequenz (290 nm Amplitude). Synchrone Kamera Akquisitionen werden aus der gleichen Quelle, und wenn durch Rastpositionen Grundsätze, Ergebnis in einem Wavefront kompensiert Bild14,16kombiniert ausgelöst. Das resultierende Bild zeigt in der Regel die Oberflächenrauigkeit des Deckglases (Abb. 4e). Kleine Features, die noch auf das Glas nach der Reinigung lässt sich das Mikroskop in den Mittelpunkt zu Rücken. Parameter für diesen aktiven Hintergrund Subtraktion Schritt können entsprechend der Bildrate, Belichtungszeit oder Hardware geändert werden.
Wie oben erwähnt, die einen qualitativ hochwertigen Strahlteiler im iSCAT Setup (Schritt 1.2.1.) wird empfohlen, als bildgebende Artefakte wie Ghosting oder Störungen aus dünnen planar Strahlteiler wird das Image beeinflussen und stören die Messung. Abbildung 7 zeigt einen Vergleich zwischen einer qualitativ hochwertigen und qualitativ minderwertige Strahlteiler. Beide roh iSCAT Bilder zeigen den gleichen Bereich auf das Deckglas, enthält einige Restpartikel. Das gleiche iSCAT-Setup wurde verwendet, um beide Bilder aufnehmen, nur der Strahlteiler wurde ausgetauscht. Abbildung 7a zeigt das Bild auf der Kamera durch Verwendung von dickeren (5 mm), gebildet AR-beschichtet und verkeilten Strahlteiler. Bauartbedingt eingekeilt der reflektierte Strahl von der Hinterfläche der Strahlteiler ist antiparallel zur Reflexion aus der vorderen Oberfläche und geht nicht ins Ziel. Keine Interferenzen Artefakte auftreten. Abbildung 7 zeigt die gleiche Sichtfeld auf die Probe, aber diesmal ein dünner (1 mm) planare Strahlteiler verwendet wurde. Die zwei Reflexionen von Vorder-und Rückseite der Strahlteiler sind parallel und werden auf die Kamera übertragen. Interferenz-Artefakte sind deutlich sichtbar.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Abbildung 7: Vergleich der iSCAT Bilder produziert mit hoher und niedriger Qualität Strahlteiler. (a) resultierende roh iSCAT Bild durch Verwendung einer 5 mm dicken, AR-beschichtet und verkeilten Strahlteiler. (b) resultierende roh iSCAT Bild des gleichen Gebietes durch Verwendung von einer 1 mm dicken planar Strahlteiler. Beide Strahlteiler haben das gleiche splitting-Verhältnis (50 % Reflexion, Transmission 50 %). Störungen Artefakte aus Fresnel Reflexionen sind eindeutig in das Bild mit dem 1 mm dicken planar Strahlteiler produziert beobachtet. Skalieren Sie Bars: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Weitfeld-Beleuchtung Schema für iSCAT, wie es ist schnell, einfach zu realisieren und ermöglicht die parallele Erfassung über eine große Fläche14. Eine andere Möglichkeit ist zu verwenden akusto-optischen Deflektoren (Bevollmächtigten) und Scannen Sie einen konfokalen Balken über der Probe12,17. Dieser Ansatz vermeidet die Notwendigkeit einer qualitativ hochwertigen Wellenfronten aber ist mehr experimentell Komplex als herkömmlicher Weitfeld-Bildgebung. Außerdem ist die Geschwindigkeit der konfokalen Beleuchtung von der Anweisungsbefugten beschränkt. Je nach der gewünschten Versuchsparameter können, entweder konfokale oder Weitfeld-Beleuchtung-Systeme im Prinzip genutzt werden, um einzelne Proteine, die aus lebenden Zellen abgesondert zu erkennen.
Wie im gesamten Protokoll erwähnt, ist es unerlässlich, seitliche mechanische Schwankungen in der Probe-Bühne des Mikroskops zu minimieren. Sogar Nanometer Abweichungen in der Position der Probe zu Variationen in aufeinander folgenden Kamera Rahmen führen und verursachen erhebliche äußere Rauschen im differenzierten Bild. Es empfiehlt sich daher, eine mechanisch stabile Mikroskoptisch und eine gedämpfte optischen Tisch (Schritt 1.1.1.) zu verwenden und das Setup mit optischen Vorhänge oder Paneele während eines Experiments (Schritt 3.5.) zu decken.
Eine aktive Fokus Stabilisierung Schema auch für Langzeitmessungen in Erwägung gezogen werden. Bei diesem Ansatz ist ein zweiter Laser integriert das Mikroskop in einer Totalreflexion (TIR) Anordnung und anschließend auf eine Photodiode Quadranten abgebildet. Änderungen in den Systemfokus übersetzen in seitlichen Verschiebungen des TIR Lasers vor Ort auf die Quadranten-Diode, die dann in ein aktives Feedback-Schleife verwendet werden kann, um die z-Achse der Piezo Stufe26zu steuern. Vertikale Drift Langzeitwirkungen sind somit ausgeschlossen.
Mehrere Änderungen und Erweiterungen können die vorgestellten Technik auf experimentelle Bedürfnisse Adresse zugewiesen werden. Zum Beispiel gibt es kommerzielle Mikroskop Bühne Inkubatoren, könnte leicht in iSCAT Mikroskop zur langfristigen Sicherung von Zellen aufgenommen werden. Andere Techniken können auch ergänzend iSCAT bildgebende Verfahren, wie z. B. umgesetzt werden konfokale oder TIR Fluoreszenz Microscopies17. Anpassung auf dem System unter Studie, iSCAT Sekretion, die Messungen in anderen Zelle Medien wie z. B. DMEM oder DPBS, durchgeführt werden können, sollte jedoch pH Indikator Phenol rot vermieden werden, da das Experiment durch Absorption des Laserlichts gestört werden kann. Darüber hinaus enthalten Ergänzungen wie fetalen Kälberserum (FCS) oder menschlichen Thrombozyten lysate (hPL) Proteine, die iSCAT Erkennung stören können. Abhängig von der gewünschten Empfindlichkeit des Experiments sollte diese Ergänzungen aus der Mikroskopie Medium ausgeschlossen werden.
iSCAT stützt sich auf ein Analyt Fähigkeit zu streuen Licht – eine Eigenschaft, die untrennbar mit allen Proteinen ist – und ist somit von Natur aus unspezifisch. Dennoch ist ein gewisses Maß an Spezifität als iSCAT Signale Skala linear mit Eiweiß Masse14,27,28möglich. Dies ermöglicht die Kalibrierung eines iSCAT Systems mit standard Proteinproben wie Rinderserumalbumin (BSA) und Fibrinogen14,27,28. In der Tat, vor kurzem junge Et al. 28 haben auf der Arbeit von Piliarik &amp; Sandoghdar14 erweitert und haben gezeigt, dass iSCAT verwendet werden kann, um festzustellen, das Molekulargewicht der Proteine so klein wie Streptavidin (53 kDa) mit einer Massenauflösung 19 kDa und einer Genauigkeit von ca. 5 kDa. Mehrere konventionelle Ansätze können weitere iSCAT ergänzen, indem ein zusätzliches Maß an Spezifität. Als ein Beispiel, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) und/oder anderen Oberflächenmodifikationen Schränken Sie Protein Bindung Ereignisse so ein, dass nur das Zielprotein erkannten16ist.
In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie iSCAT Mikroskopie verwendet werden kann, zu untersuchen, zelluläre Sekrete auf einzelne Proteinebene mit Atemanhalten Zeitauflösung16. Die Technik ist allgemein und auf alle gewerblichen oder selbst gebaute Mikroskop umgesetzt werden kann. Im Gegensatz zu Einzelmolekül-Fluoreszenz die Methode leidet nicht Immunofluoreszenz oder Effekte, aber es blinkt immer noch Single-Protein Empfindlichkeit erreicht. Diese Eigenschaften machen iSCAT ein mächtiges Werkzeug im Bereich Biosensoren und Mikroskopie. Zukünftige Anwendungen konzentriert sich auf die Aufklärung von komplexen zellulärer Interaktionen z. B. immunologische Reaktion auf einen Stimulus oder zelluläre Kommunikation.

Sekretierten Proteine spielen eine bedeutende Rolle in verschiedenen physiologischen Prozesse1. Aus diesem Grund werden sie routinemäßig als eine kollektive Ensemble (Proteomics) oder als einzelne Elemente2,3untersucht. Proteomics untersucht traditionell die Gesamtheit der Proteine in einem bestimmten biologischen System durch z. B. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA), Durchflusszytometrie oder Massenspektrometrie4,5, 6. Einzelne Proteine, auf der anderen Seite, werden in der Regel erkannt mit einer Vielzahl von Techniken, die auf Fluoreszenz7,8, Plasmonik9,10oder kryogene Elektron11 Microscopies. Alle diese Techniken verwenden komplexe Instrumente, Kennzeichnung, oder beides und oft keine Dynamik Informationen, wie sie nur langfristige Informationen zum System unter Studie liefern.
Hier verwenden wir iSCAT12,13 Mikroskopie, Sinn einzelne Sekretorische Proteine mit unter einer Sekunde zeitlicher Auflösung14. Wichtig ist, erkennt die Technik der verstreuten schwach untrennbar mit jedem Protein12,14. Die Lichtmenge, die eine kleine Bioparticle streut skaliert mit der Polarisierbarkeit. Geht man davon aus, dass die Form eines Proteins durch eine effektive Streuung Kugel14,15,16, und dass verschiedene angenähert werden kann kann Proteine haben sehr ähnliche Brechungsindizes, das gemessene Signal direkt das Molekulargewicht (MW) des Proteins verbunden. Die empirischen Kalibrierung des iSCAT Kontrast im Vergleich zu Molekulargewicht von Referenzmessungen erlaubt es, Proteine in verschiedenen Größen zu unterscheiden. iSCAT Experimente können leicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie17,18, Immunosorbentprobe Reagenzien sowie fluoreszierende oder Streuung Etiketten ermöglichen eine spezifische Erkennung von jedem Protein des Interesses14 ergänzt werden , 17 , 19.
Im Prinzip funktioniert iSCAT durch die Verstärkung des Proteins schwach gestreute Licht über interferometrischen mischen mit einer sekundären Referenz-Welle. Die ermittelte Intensität (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) in eine iSCAT Mikroskop wird beschrieben durch
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
wo <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> ist die einfallende Intensität, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> ist ein Koeffizient für den Beitrag der Referenz-Welle <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> steht für die Stärke der Streuung des Nano-Objekts unter Studie, und <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> ist die Phasenverschiebung zwischen den verstreuten und verweisen "Wellenlinien"14. Entweder die übertragenen oder Rückseite reflektiert einfallendes Licht dient in der Regel als Referenz Welle, wo in jedem Fall <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> entfallen die Transmissivität oder Reflektivität der Probenkammer, beziehungsweise. Der Begriff <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> ist proportional zu des Proteins Streuung Querschnitt und im Vergleich zu dem Kreuz Begriff vernachlässigt werden kann. Und setzt damit, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> für komplette destruktive Interferenz der detektierten Lichts ergibt sich aus <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> wo <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> ist die Referenz-Intensität und <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> ist die Intensität der Störung.
iSCAT Mikroskopie bietet eine hervorragende Methode, um biologische Prozesse auf der Einzelmolekül-Ebene zu studieren. Als Beispiel, wir untersuchen Laz388 Zellen – eine Epstein - Barr-Virus (EBV) verwandelt sich B-Lymphozyten Zelle Zeile20,21 — wie sie Proteine wie IgG Antikörper16absondern. Aber die Methode ist allgemein und kann auf eine Vielzahl von anderen biologischen Systemen angewendet werden. iSCAT ist von Natur aus unspezifischen und erkennt kein Protein oder Nanopartikel oder es kann mit herkömmlichen Oberfläche Funktionalisierung Methoden für spezifische oder Multiplex-Erkennung erweitert werden. Seine Einfachheit und die Fähigkeit, mit anderen optischen Techniken, wie die Fluoreszenz-Mikroskopie, kombinierbar zu machen iSCAT ein wertvolles ergänzendes Instrument in der Zellbiologie.

<table><tbody><tr><td>Artikel/Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat Ölimmersion</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA Objektiv</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Tisch</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>3-Achsen Tisch mit 100x100x10&micro; m range</td></tr><tr><td>Diodenlaser (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>Optik/Optomechanik</td><td>Thorlabs/Newport-Objektive</td><td>, Spiegel, Pfosten, Halterungen</td><td></td></tr> <tr><td>Pinhole</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>LED-Lichtquelle</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>Kurzpassfilter (580 nm)</td><td>Omega Optical</td><td>580SP</td><td>zur Modifikation des Spektrums der LED für Fluoreszenzanregung</td></tr><tr><td>Langpassfilter (500 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td><td>zur Modifikation des Spektrums der LED für die Fluoreszenzanregung</td></tr><tr><td>70R/30T Strahlteiler</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>Economy Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td><td>für den Vergleich von Streifeneffekten</td></tr><tr><td>Keilplattenstrahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td><td>für den Vergleich von Streifeneffekte</td></tr><tr><td>Kurzpass-dichroitischer Spiegel (550 nm)</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>8R/92T Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td>CMOS-Kamera</td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>für iSCAT-Erfassung</td></tr><tr><td>CMOS-Kameras</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>für Hellfeld- / Fluoreszenzerfassung</td></tr><tr><td>Langpassfilter (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>FELH0600</tr><tr><td>Computer</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp;</td><td>-</td><td>Core i7 Prozessor, 16 GB RAM, SSD Erfassungssoftware</td></tr> <tr><td></td><td>LabVIEW-LabVIEW</td> <td>2016 Suite</td><td></td></tr> <tr><td>Analysesoftware</td><td>Matlab-Matlab</td><td></td> <td>2014 Suite</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener</td><td>Diener Pico</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Binder</td><td></td><td>Modell CB</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz/Material</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>ohne Phenolrot</td></tr><tr><td>HEPES Puffer Lösung (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>Deckfolien</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenkulturschalen</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td>zur Kalibrierung verwendet</td></tr><tr><td>Immersol Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>Flexible Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, Pellets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>zur Herstellung von 0,2 M NaOH-Lösung</td></tr></tbody></table>

markierungsfreie imaging der einzelnen proteine abgesondert von lebenden zellen über iscat mikroskopie

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Wir zeigen interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, eine Methode in der Lage, einzelne unbeschriftete Proteine aus einzelnen lebenden Zellen in Echtzeit abgesondert zu erkennen. In diesem Protokoll decken wir die grundlegenden Schritte, um eine iSCAT Mikroskop erkennen und ergänzen es mit zusätzlichen bildgebenden Sendern, die Lebensfähigkeit einer Zelle unter Studie zu überwachen. Im Anschluss daran verwenden wir die Methode für Echtzeit-Erkennung von einzelnen Proteinen, wie sie von einer lebenden Zelle abgesondert werden, die wir mit einem verewigt B-Zell-Linie (Laz388) zeigen. Notwendigen Schritte in Bezug auf die Vorbereitung des Mikroskops und Probe sowie die Analyse der aufgezeichneten Daten werden diskutiert. Das video Protokoll zeigt, dass iSCAT Mikroskopie bietet eine einfache Methode um Sekretion der Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen.

Abbildung 4azeigt eine schematische Darstellung eines iSCAT Mikroskop. Repräsentative Hellfeld, Fluoreszenz und rohe iSCAT Bilder sind in Abbildung 4 b, 4 cund 4D, bzw.16gezeigt. Abbildung 4e und 4f zeigen die Ergebnisse der Hintergrund entfernen und differenzielle Nachbearbeitung; zwei Proteine adsorbiert werden als Beugung begrenzte Flecken in Abbildung 4fangezeigt. Abbildung 6 zeigt ein Histogramm der gefundenen Proteine im Verlauf von 125 s. Diese Daten wurden durch die Anwendung eines Peak-suchenden Algorithmus auf den aufgenommenen Bildern zählen die verbindliche Ereignisse und katalogisieren ihre Kontrast16erhalten. Eine Gesamtanzahl von 503 Proteine wurden erkannt.
Nächste, sekretierte Arten sind im Vergleich zu Referenzmessungen durchgeführt auf gereinigtes Protein-Lösungen oder durch zusätzliche Messungen mit funktionalisierten Glas Oberflächen14,16gekennzeichnet. Die iSCAT Daten visualisieren so direkt zelluläre Sekretion Dynamik auf ein Atemanhalten Skala16. Als Beispiel haben wir bereits festgestellt, dass IgG-Antikörper einen wichtigen Teil der Laz388 Secretome stellen und aus der Zelle mit einer Rate von ca. 100 Moleküle pro zweite16freigegeben werden. Darüber hinaus sind andere Partikel, die ein Spektrum von 100 kDa - 1000 kDa durch die Zellen16abgesondert. Das beschriebene Verfahren kann weitere Arbeitnehmer z. B. das räumliche Konzentrationsgefälle von Sekreten, die Umgebung einer Zelle16zu untersuchen oder die zeitliche Dynamik des zellulären Lyse16bestimmen werden.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Abbildung 6: Quantifizierung der sekretierten Proteine von einer Einzelzelle Laz388. Das Histogramm zeigt die gefundenen Proteine während eines Zeitraums von 125 S. Kontrast Werte in 1 x 10-4 Kontrast Lagerplätze (blaue Balken) angesammelt werden. Insgesamt 503 einzelne Proteine wurden gezählt, während dieser Messung. Das Experiment wurde mit ähnlichen Ergebnissen 10 Mal wiederholt. Diese Zahl wurde angepasst von McDonald, M.P. Et al. 16. Copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir präsentieren ein Protokoll für die Echtzeit-optische Erkennung von einzelnen unbeschriftete Proteine, wie sie von lebenden Zellen abgesondert werden. Grundlage hierfür ist interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, die auf eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Systemen und Konfigurationen angewendet werden können.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

ISCAT haben wir erstmals 2004 im Rahmen der Detektion und Spektroskopie von Gold-Nanopartikeln vorgestellt. In den folgenden 10 Jahren haben wir diese Technik für die Detektion und Verfolgung biologischer Nanopartikel wie Viren und kleine Proteine weiterentwickelt. Das Wesen der Technik ist, dass jedes materielle Objekt, egal wie klein, einen endlichen Auslöschungsquerschnitt hat.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die etikettenfreie Detektion. Das bedeutet, dass wir, wenn wir empfindlich genug sind, fast alles entdecken können, wie Proteine oder Exosomen, die aus einzelnen Zellen abgesondert werden. Das Problem, bei dem man vorsichtig sein muss, ist, wie man den Streuhintergrund behandelt.Ein großer Vorteil eines iSCAT-Mikroskops ist, dass es komplett selbst gebaut und einem vorhandenen kommerziellen Mikroskop hinzugefügt werden kann. Dies bedeutet, dass es leicht mit anderen optischen Techniken kombiniert werden kann, wie Fluoreszenz, und dies ist einer der Gründe, dass viele Gruppen jetzt auch iSCAT und verwandte Techniken verwenden. Hier nutzen wir LUZ-Zellen als Modellsystem, um den Nachweis individueller und sekretoher Proteine zu zeigen.Diese Methode kann jedoch auch auf fast jeden biologischen Prozess auf molekularer Ebene angewendet werden. Um ein stabiles Mikroskop zu erreichen, beginnen Sie mit einem gedämpften optischen Tisch und einem starren massiven Block für die Probenstufe. Erstellen Sie eine Mikroskop-Probenstufe, die ein hohes numerisches Blendenobjektiv und eine Übersetzungseinheit enthält, die eine laterale Probenübersetzung sowie eine Änderung der Fokusposition für das Ziel ermöglicht.Verwenden Sie einen 45-Grad-Vertikal-Kupplungsspiegel und eine 50 Zentimeter Brennweite Singlet-Linse, um das Licht eines Diodenlasers bei Wellenlänge 445 Nanometer auf die hintere Brennebene des Objektivs zu fokussieren. Diese Weitfeldlinse erzeugt einen kollimierten Strahl am Vorwärtsfokus des Objektivs, der zur iSCAT-Beleuchtungsquelle wird. Tragen Sie ein Tröpfchen Tauchöl auf das Objektiv auf und legen Sie einen Glasdeckel in die Probenebene der Mikroskopstufe.Dies führt zu einem Strahl, der durch das Bildobjektiv nach unten reflektiert. Um den Bildweg einzurichten, führen Sie einen reflexmittelbeschichteten Strahlteiler in einem 45-Grad-Winkel relativ zum Einfallsstrahl und etwa 10 Zentimeter nach der Weitfeldlinse ein. Stellen Sie sicher, dass die Antireflexbeschichtung auf die Laserquelle zeigt.Achten Sie darauf, wie ein dicker Strahlsplitter wird erhebliche Strahlverschiebung einführen, so dass der Laser nicht mehr in das Ziel gerade eindringen. Richten Sie bei Bedarf den Laserstrahlweg vor dem Strahlteiler neu aus, um die korrekte Ausbreitung durch das Objektiv zu gewährleisten. Um sicherzustellen, dass die Probenebene und die Kamera parfokal sind, legen Sie zunächst eine konkave Linse mit einer negativen Brennweite von 45 Zentimetern an einer Position fünf Zentimeter nach der Breitfeldlinse im einfallenden Strahlweg.Dies führt dazu, dass ein kollimierter Strahl in die hintere Öffnung des Objektivs eintritt. Wenn der Bildschirm im reflektierenden Arm des Interferometers platziert ist, bewegen Sie das Objektiv in vertikaler Richtung, um die grobe Brennpunktposition zu finden. Das Ziel steht im Fokus, wenn der Strahl, der auf den Bildschirm trifft, kollidiert.Entfernen Sie sowohl die negative Brennweite Linse und den Bildschirm, wenn grob Fokussierung abgeschlossen ist. Fügen Sie eine zweite 50 Zentimeter Brennweite Singlet-Linse hinzu, um das Streulicht zu fokussieren und das reflektierte Licht zu kollimieren. Stellen Sie sicher, dass die Linse 50 Zentimeter von der hinteren Brennebene des Objektivs entfernt platziert wird, so dass der übertragene Laserstrahl wieder kollimiert wird.Um die iSCAT-Setup-Baugruppe abzuschließen, legen Sie die CMOS-Kamera 50 Zentimeter vom 50 Zentimeter brennweiten Objektiv entfernt und positionieren Sie den Strahl direkt auf der Mitte des Chips. Um zusätzliche Bildverarbeitungskanäle einzurichten, koppeln Sie die Ausgabe einer LED-Lichtquelle in ein Ziel über lange Arbeitswege. Installieren Sie mechanische Komponenten über der Probenkammer, die eine Fokussierung und seitliche Positionierung des LED-Ausgangs auf die Probe ermöglichen.Verschieben Sie das obere Ziel seitlich, sodass das obere Breitfeldziel und das untere iSCAT-Ziel kolinear sind. Dies wird bestimmt, indem ein Bildschirm unter das untere Ziel gesetzt und die Intensität des übertragenen LED-Lichts auf dem Bildschirm maximiert wird. Platzieren Sie nun einen 550 Nanometer kurzen Dichroipspiegel, um das übertragene LED-Licht vom iSCAT-Laserpfad zu trennen.Teilen Sie diesen Strahl in zwei Kanäle mit einem acht Prozent reflektierenden, 92 Prozent transmissiven Strahlteiler. Der 92-Prozent-Pfad ist der Fluoreszenzkanal, und der Acht-Prozent-Pfad wird für die Bildgebung in hellen Felden verwendet. Stellen Sie den Hellfeldkanal mit einem fünf Zentimeter langen achromatischen Doublet-Objektiv auf eine CMOS-Kamera.Stellen Sie den Fluoreszenzkanal mit einer fünf Zentimeter langen achromatischen Doppellinse auf eine separate CMOS-Kamera. Verwenden Sie auch einen 600 Nanometer Langpassfilter, um das Anregungslicht zu blockieren. Um den Computer und die Software einzurichten, schließen Sie alle Kameras an einen Computer an.Beobachten Sie bei der komplett montierten Einrichtung das iSCAT-Bild auf der CMOS-Kamera und stellen Sie sicher, dass es im Fokus steht, indem Sie ein Reststaub- oder Schmutzpartikel auf dem Glasdeckel finden. Stellen Sie sicher, dass es sich bei dem Bild des Partikels um eine kreisförmig symmetrische Punktstreufunktion handelt. Die Punktstreufunktion hat keine kreisförmige Form, wenn der Laserstrahl in einem leichten Winkel in das Mikroskopobjektiv eintritt.Dies kann durch eine leichte Einstellung des 45-Grad-Spiegels korrigiert werden, um eine direkte Kopplung in das Objektiv zu gewährleisten. Vergleichen Sie die Kamerabilder des HellenFeldes und der Fluoreszenzkanäle. Stellen Sie sicher, dass beide im Fokus stehen, und zeigen Sie denselben Bereich an, indem Sie eine fluoreszierende Perle oder Zellprobe bebildern.Überprüfen Sie, ob sich die Position des iSCAT-Lasers ungefähr in der Bildmitte befindet, und notieren Sie sich deren Position für eine spätere Referenz. Um die Position und das Sichtfeld des Hellfeldes und des Fluoreszenzkanals zu ändern, bewegen Sie die Kameras auf dem Tisch in Bezug auf die Fokussierlinsen. Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Dazu gehören die Vorbereitung der Zellen und mikroskopischen Mittel sowie die Mikroskop-Probenküvette. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl blockiert ist, um zu verhindern, dass die Zellen direkt dem iSCAT-Laserlicht ausgesetzt werden. Injizieren Sie etwa drei Mikroliter der vorbereiteten Zellprobe leicht aus der Mitte in die Probenküvette.Berühren Sie die Pipettenspitze vorsichtig auf den Deckelund und injizieren Sie die Zelllösung langsam. Lassen Sie die Zellen auf dem Coverslip absetzen. Überprüfen Sie die Anzahl der Zellen in der Nähe des iSCAT-Lasers.Wenn die Anzahl der Zellen zu niedrig ist, wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine ausreichende Anzahl verfügbar ist. Wenn die Abdeckung der Zellen zu dicht ist, verwenden Sie eine Injektion von etwa 20 Mikroliter zusätzlichem Mikroskopiemedium, um die Zellen über den Deckelzuschlag zu dispergieren. Verschieben Sie das Beispiel mithilfe der piezoelektrischen Übersetzungsstufe seitlich, um eine Zelle in der Nähe des iSCAT-Ansichtsfeldes zu positionieren.Stellen Sie sicher, dass die Zelle nicht in das iSCAT-Sichtfeld gelangt, da die direkte Exposition gegenüber dem 445 Nanometer Laserlicht für die Zelle schädlich sein könnte. Entsperren Sie den iSCAT-Laserstrahl und stellen Sie sicher, dass die Deckslip-Oberfläche weiterhin im Fokus steht. Schließen Sie den Isolationstisch ein, um Drift und akustische Kopplung aus der Umgebung zu minimieren.Starten Sie die Messung, indem Sie Bilder von iSCAT-, Hellfeld- und Fluoreszenzkameras erfassen. Überprüfen Sie regelmäßig die Lebensfähigkeit der Zelle und den Fokus des Systems. Hier wird zur Anzeige der Kamerabilder eine selbstgeschriebene Mikroskopsoftware verwendet.Hierbei erfolgt die Differentialbildgebung in Echtzeit durch Subtraktion konsekutierter Frames, um Proteinbindungen sichtbar zu machen. Dies führt zu einem gefilterten Bild, das zusammen mit dem rohen Kamerabild auf dem Bildschirm sichtbar ist. Repräsentative Ergebnisse eines zellulären Sekretionsexperiments, das mit iSCAT durchgeführt wurde, werden hier gezeigt.Das Video zeigt Sekrete einer LAZ-Zelle im Laufe von zwei Minuten. Differenzielle iSCAT-Bilder auf der linken Seite visualisieren die Absorption einzelner Proteine in das Deckglas. Die Hellfeldbilder und der Fluoreszenzkanal auf der rechten Seite werden zur Überwachung der Zelllebensfähigkeit verwendet.Dieses Histogramm zeigt die nachgewiesenen Proteine und ihren Kontrastbereich innerhalb dieses Zeitraums von zwei Minuten. Die Daten wurden durch die Analyse einzelner Bindungsereignisse in jedem Frame der iSCAT-Videodaten mithilfe eines benutzerdefinierten Peak-Suchalgorithmus gesammelt. Die ISCAT-Mikroskopie ist nicht nur ein leistungsfähiges Werkzeug in der Biosensie, sondern auch in der Mikroskopie, da sie eine etikettenfreie Detektion von Nanoobjekten in Echtzeit ermöglicht.Insbesondere kann es auf eine Vielzahl von Prozessen wie Diffusion und Transport von Proteinen angewendet werden. Aufgrund seiner exquisiten Empfindlichkeit gegenüber Lichtstreuung kann iSCAT jedes Protein oder jede Entität im Sichtfeld erkennen. Natürlich bedeutet dies auch, dass die Technik die Spezifität fehlt, die Fluoreszenz mit sich bringt, aber um dieses Problem zu umgehen, kann man zusätzliche Methoden wie die Oberflächenfunktionalisierung anwenden, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann, und ein entsprechender Augenschutz sollte immer bei der Montage und Einstellung des Mikroskops getragen werden. Die Echtzeit-Erkennung von Sekretomen ist sehr spannend und ein großer Sprung in der medizinischen Diagnostik, die derzeit viel längere Zeit in Anspruch nimmt und sehr weit von einer einzigen Proteinempfindlichkeit entfernt ist. Es gibt noch viel Raum, um die Leistung der Methode zu verbessern und ihre Anwendungen zu erweitern.Wir hoffen also, dass dieses Video anderen Gruppen hilft, sich dieser spannenden Anstrengung anzuschließen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Dieses Video demonstriert die lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie, um Proteinsekrete von einer einzelnen Zelle zu detektieren. Unter Verwendung eines mikrofluidischen Aufbaus und eines peptidgebundenen plasmonischen Nanostruktur-Chips zeigen Änderungen der reflektierten Lichtintensität am Resonanzwinkel Wechselwirkungen mit sezernierten Proteinen aus einer einzelnen Zelle.

Lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie zum Nachweis von Proteinsekreten aus einer einzelnen Zelle

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie die markierungsfreie iSCAT-Mikroskopie zur Echtzeit-Detektion einzelner Proteine aus lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht molekulare Beobachtungen ohne Fluoreszenzfarbstoffe.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

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