Name: Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Isolation und Kultivierung primärer Bursazellen von Hühnern zur Untersuchung der IBDV-Replikation. Diese Methode ermöglicht virologische Studien ohne Infektion lebender Tiere und unterstützt die 3R-Prinzipien.

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Die Autoren möchten danken dem Animal Services Team am Pirbright Institut für ihre Expertise in Brut, Aufzucht und Keulung Vögel und die Expertise von Caroline Holt in der Bursa fabricii aseptisch entfernen. A.B wird finanziert durch die Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC) über k.d. wird finanziert durch die BBSRC über Zugehörigkeit BBS/E/ich/00002115, und A.A wird finanziert durch das National Centre for BBS/E/ich/00001845, gewähren die Ersatz, Verfeinerung und Reduzierung von Tieren in der Forschung (NC3Rs) über gewähren NC/R001138/1.

Alle Verfahren mit Tieren müssen ethisch im Voraus genehmigt werden. In unserer Einrichtung werden alle Verfahren gemäß dem UK Tier-(wissenschaftliche Verfahren) Act 1986 unter Home Office Einrichtung, Personal und Projekt-Lizenzen nach der Genehmigung des internen Tierschutz und ethische Review Board (AWERB) durchgeführt.
1. Vorbereitung des chCD40L
<ol><li>HEK 293-msCD8-CD40L Zellkulturen, die stabil eine lösliche chCD40L Ausdrücken in 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten ergänzt (Hallo) konstruieren, fetalen Kälberserum (FCS) und 1 µg/mL Puromycin bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5 % CO 2. Hinweis: Diese Zellen sind vom Pirbright Institut nach der Unterzeichnung des Abkommens entsprechende Werkstoffübergang.</li>
	<li>Teilen Sie die Zellen bei einer 1:5-Dichte bei konfluierende. Sammeln der Überstand (mit dem löslichen chCD40L-Konstrukt) jedes Mal, wenn die Zellen aufgeteilt, bei 400 X g für 5 min, zelltrümmer zu entfernen, und speichern sie bei 4 ° c zentrifugiert</li>
	<li>Wenn 500 mL des Überstands gesammelt hat, bündeln Sie die Flüssigkeit zu und Sterilisieren Sie Filter-es durch einen 0,2 µm-Filter.</li>
	<li>Den Überstand mit zentrifugalen Protein-Konzentratoren mit einem Molekulargewicht Cutoff von 10 K gemäß den Anweisungen des Herstellers zu konzentrieren. Extrahieren des konzentrierten Überstands aus jeder Spalte zusammen bündeln und Filter-Sterilisieren sie indem Sie es durch einen 0,22 µm Spritze Filter übergeben.</li>
	<li>Bestimmen die Endkonzentration in Experimenten verwendet werden, durch die chCD40L-Lösung in 1 Seriell Verdünnung der X Iscove modifiziert Dulbecco Medium (IMDM) (beschrieben in Schritt 2.4) und Kultivierung primären Bursitis Zellen in Anwesenheit der Verdünnungen. Bestimmen Sie die Anzahl und Prozentsatz Lebensfähigkeit der Zellen täglich für bis zu einer Woche. Hinweis: Die niedrigste Konzentration wo Zellproliferation und Lebensfähigkeit ausreichen ist die Konzentration in der Probe verwenden. Dies wird voraussichtlich zwischen 01:20 und 01:50 sein.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Lösungen für Huhn primäre Bursitis Zelle isoliert
<ol><li>Bereiten Sie 1 x Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBBS) mit Kalzium (Ca) durch Zugabe von 10 mL 10 X HBBS mit ca. 90 ml sterile H2O und 0,47 µL von 7,5 % Nahco33.</li>
	<li>Bereiten Sie Kollagenase D Stammlösung bei 8 mg/mL in 1 X HBBS mit Ca. Filter sterilisieren die Lösung durch einen 0,2 µM-Filter. Hinweis: Es ist ratsam, 5 mL Aliquote vorbereiten und Einfrieren bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 X RPMI Medium ergänzt mit 5 % Hallo FCS. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 x 500 mL IMDM ergänzt mit 8 % Hallo FCS, 2 % Hallo Huhn Serum, 50 mM β-Mercaptoethanol, 50 µL der Insulin-Transferrin-Natriumselenit und 1 % Penicillin/Streptomycin. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C. Hinweis: Die oben genannten Lösungen im Voraus vorbereitet.</li>
	<li>1 X HBBS mit Ca. Shop Lösung auf Eis zubereiten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 X HBBS ohne Ca durch Zugabe von 10 mL 10 X HBBS ohne Ca 90 ml sterile H2O, 0,47 µL von 7,5 % Nahco33und EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM. Speichern Sie die Lösung auf dem Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 X Kollagenase D Lösung durch Zugabe von 5 mL der Stammlösung Kollagenase D 13 ml HBBS mit Ca, insgesamt 18 mL zu machen. Speichern Sie die Lösung auf dem Eis. Hinweis: Bereiten Sie die Lösungen in Schritten 2,5 – 2,7 auf den Tag des Experiments erwähnt.</li>
</ol>3. Entfernung der Bursa Fabricii (BF)
<ol><li>Hinten und Luke Hühner in einer geeigneten und zugelassenen Einrichtung und menschlich im Alter von 2 – 3 Wochen zu Keulen. Hinweis: Verwenden Sie Institut zugelassenen Methoden für das Schlachten.</li>
	<li>
Sammeln Sie die BF aus jedes Huhn mit aseptischen Techniken. Hinweis: Verwenden Sie die Protokolle an die Institution.<ol>
<li>Legen Sie den Kadaver in dorsal liegen und Sterilisieren Sie Haut und Federn überlagern den Bauch und Brustkorb mit einer Lösung aus 70 % Ethanol, mit Wasser verdünnt.</li>
		<li>Machen Sie einen ventralen Mittellinie Schnitt in den Unterleib mit einem sterilen Skalpell oder Schere.</li>
		<li>Suchen Sie die Bursa fabricii, die mit dem kaudalen Abschnitt des Dickdarms, kranial an der Kloake verbunden ist.</li>
		<li>Verwendung von sterilisierten Pinzette und Schere, Schnitt der Bursa fabricii frei aus dem Dickdarm. Achten Sie, dass den Darm durchstechen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Orgel in kaltem PBS und überträgt es auf das Labor auf dem Eis. Hinweis: primäre Zellen sollten so bald wie möglich nach der Ernte Organ isoliert werden.</li>
</ol>4. Isolierung von Huhn primären Bursitis Zellen
<ol><li>Arbeiten in einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank, waschen die BF mindestens 3 X 30 ml kaltem PBS.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einer Petrischale (92 mm Durchmesser, 21 mm in der Höhe) und 5 mL 1 X Kollagenase D Lösung.</li>
	<li>Verwendung von sterilen Schere oder einem Skalpellklinge, schneiden die BF in Stücke von weniger als 5 mm im Durchmesser.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C mit periodischen sanfte Agitation für 30 min. Hinweis: Die Kollagenase-Lösung wird beginnen, um das Gewebe zu verdauen.</li>
	<li>Aspirieren Sie mit einem sterilen Pasteurpipette, immer wieder die Mischung um Zerfall des Gewebes zu fördern. Falls erforderlich, schneiden Sie das Gewebe in kleinere Stücke.</li>
	<li>Fügen Sie ein weiteres 5 mL 1 X Kollagenase D Lösung des Gewebes und bei 37 ° C mit periodischen sanfte Agitation für weitere 30 min inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7, bis das Gewebe vollständig verdaut wird. Hinweis: Es werden kleine Körnchen, die nicht weiter auflösen.</li>
	<li>Durchlaufen Sie die Zellsuspension in 20 mL 1 X HBBS ohne Ca 100 µm Zelle Sieb.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und erneut das Pellet in 10 mL 1 X RPMI mit 5 % FCS.</li>
	<li>Entweder 10 mL Zellsuspension auf 5 mL Dichte Gradienten Medien mit Polysucrose und Natrium Diatrizoate überlagern oder Unterlage 5 mL Dichte Gradienten Medien unter die 10 mL Zellsuspension. Stellen Sie sicher, es gibt eine klare Schnittstelle zwischen den beiden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Overlay bei 900 X g für 20 min bei 4 ° C. Senken Sie oder entfernen Sie die Zentrifuge Pause. Hinweis: Die Felder sollte eine Band an der Schnittstelle zwischen der Zelle und die Dichte Gradienten Medien bilden.</li>
	<li>Mit einer sterilen Pasteurpipette, entfernen Sie die Zellen zu und legen Sie sie in kaltem PBS. Waschen Sie die Zellen 3 X durch Zentrifugieren sie 400 X g für 5 min und resuspending sie in kaltem PBS.</li>
</ol>(5) Kultur der primären Bursitis Zellen Huhn
<ol><li>Die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min zentrifugieren und ihnen in 1 x komplette IMDM aufzuwirbeln.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension, einer Trypan blau-Projektmappe hinzufügen und die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die die Trypan blau ausschließen. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und die prozentuale Rentabilität.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min zentrifugieren und in kompletten IMDM ergänzt mit einem 01:20 Aufschwemmen Verdünnung Huhn CD40L bei einer Dichte von 1 x 107 Zellen/mL. Titrieren Sie konzentrierten überstand mit der chCD40L um die optimale Verdünnung zu bestimmen, die im Bereich von 01:10, 01:50 liegen dürfte.</li>
	<li>Kulturzellen Sie in beiden 96 - oder 24-Well-Platten bei 37 ° C für 48-72 h U-die Talsohle 96-Well-Platten mit flachem Boden Platten vorzuziehen sind. Hinweis: Zellen können auch bei 40 ° C kultiviert werden</li>
</ol>6. die Infektion Huhn primäre Bursitis Zellen mit IBDV
<ol><li>48-72 h nach Isolierung, Tauwetter ein Aliquot des Virus, Wirbel der Probe, und speichern Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Aufschwemmen der primären Bursitis Zellen, nehmen Sie einen 10-µL aliquoten die Zellsuspension, 10 µL einer Lösung Trypan blau hinzu, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und der prozentuale Rentabilität.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Virus in 1 x komplette IMDM, die entsprechende Vielfalt der Infektion (MOI), das Virus Inokulum und Wirbel zu machen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und Zellen in den Virus-Inokulum Aufschwemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 ° C für 1 h unter regelmäßigen rühren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min, entfernen Sie das Inokulum Virus zu und waschen Sie die Zellen in 1 x komplette IMDM Medien.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 400 X g für 5 min zentrifugieren, überstand zu entfernen und Aufschwemmen der Zellen in komplette IMDM Media ergänzt mit Huhn CD40L bei einer Dichte von 1 x 107 Zellen pro mL.</li>
	<li>Kulturzellen Sie in beiden 96 - oder 24-Well-Platten bei 37 ° C. Hinweis: Zellen können auch bei 40 ° C kultiviert werden</li>
</ol>(7) Quantifizierung des IBDV Replikation in primären Bursitis Zellen Huhn
<ol><li>Auf die gewünschte Zeit-Punkt Postinfection Aufschwemmen der Zellen, übertragen Sie sie auf einem geeigneten Rohr, sie 400 X g für 5 min zentrifugieren und Ernten des Überstands für die Virus-Titration durch Plaque-Assay oder TCID50 Assay gemäß der Reed-Münch Methode-15.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in 1 mL PBS und bereiten sie entweder für Immunostaining mit einem Antikörper, der spezifisch für IBDV, oder extrahieren Sie RNA mit einer geeigneten Kit (nach Herstellerangaben) und führen Sie reverse Transkription quantitative Polymerase chain Reaktion (RT-qPCR) mit Primer spezifisch für ein IBDV gen (Sturm, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Umgekehrt, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Mock-infizierten Zellkulturen sollte als Kontrolle verwendet werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie, die wir beschreiben die erfolgreiche Kultur von Huhn primären Bursitis Zellen ex Vivo in Anwesenheit von löslichen chCD40L und zeigen, dass diese Zellen die Replikation von einem attenuierten Stamm und eine sehr virulenten Stamm von IBDV unterstützen können. Dieses ex-Vivo -Modell kann verwendet werden, um festzustellen, wie die Zellen reagieren auf eine IBDV Infektion13, hat deutliche Vorteile gegenüber den in Vivo und in Vitro Studien.
Bei der Ernte von der BF ist es wichtig, den Darm um bakterielle Kontamination der isolierten Bursitis Zellen zu vermeiden nicht zu durchbohren. Darüber hinaus ist es wichtig, die primäre Zellen so bald wie möglich nach der Orgel Ernte Zelltod begrenzen zu isolieren. Die Notwendigkeit, chCD40L zu verwenden ist eine Einschränkung der Technik; Arbeit unter der Leitung von Soubies Et Al. zeigt jedoch, dass die Verwendung von Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), Bursitis Zellviabilität statt chCD40L14 zu verlängern das Modell von einer größeren Anzahl von Laboratorien angenommen werden kann. Die oben beschriebene Protokoll bestimmt die optimale Konzentration der chCD40L empirisch durch Kultivierung primären B-Zellen bei seriell verdünnten Konzentrationen des Moleküls und Beobachtung Zellproliferation und Lebensfähigkeit. Eine mögliche Änderung des Protokolls könnte, das chCD40L-Molekül zu reinigen und den Zellkulturmedien, Variabilität von Charge zu Charge zu vermeiden eine bestimmte Konzentration hinzu.
In Vivo -Studien haben gezeigt, dass folgenden IBDV Infektion, gibt es eine Zunahme der Expression von Genen beteiligt Pro-inflammatorischen Zytokinen Antworten, Typ I IFN Antworten und Apoptose im BF5,9,10 . Nach Infektion ist jedoch ein Zustrom von Entzündungszellen und T-Effektorzellen in der BF, die unterscheiden sich in den Genen, die sie zum Ausdruck bringen, im Vergleich zu den infizierten B-Zelle Bevölkerung9. Es ist daher schwer zu interpretieren, wie infizierte Zellen reagieren auf IBDV. Um dieses Problem anzugehen, haben einige Forschungsgruppen die transcriptional Antwort von Zellen in Kultur16,17,18,19,20mit IBDV infiziert gekennzeichnet. Diese in-vitro- Studien haben den Vorteil von klar definierten MOIs und Zeit-Punkte Postinfection. In-vitro- Studien waren jedoch in der Regel in Fibroblast Zellen16,17,20 oder Dendritische Zellen18gekennzeichnet. Während bietet einen Einblick in Wirt Zelle IBDV Interaktionen, die aktuellen Überzeugung ist, dass die Infektion von B-Zellen entscheidend für die Pathogenese des IBDV und damit die Relevanz der Daten kann nicht overinterpreted werden. Vor unserem ex Vivo Bursitis Kultur Zellmodell hatte nur eine Studie die zelluläre Reaktion der B-Zellen auf IBDV Infektion19gekennzeichnet; Diese Studie verwendet jedoch eine verewigt B-Zell-Linie, die umgebaut wurde, aufgrund einer Infektion mit ALV, begrenzen die Schlussfolgerungen, die gemacht werden könnten. Im Gegensatz dazu ermöglicht die ex Vivo Modell des IBDV Infektion hier beschriebenen Forscher, die Vorteile von in-vitro- Studien, wie definierten MOIs und Zeitpunkten während der Untersuchung der Wechselwirkungen des Virus mit seinen relevanten Wirtszelle zu behalten. Wie die primäre Bursitis Zellen stammen aus nicht infizierten BF Gewebe, gibt es keine entzündlichen oder T-Zellen vorhanden, und wir haben bewiesen, durch flow Cytometry (mit standard-Bedingungen), folgende chCD40L-Stimulation, 97 % der Zellpopulation ist positiv für der B-Zell-Marker Bu-1 (Daten nicht gezeigt). Angesichts der Tatsache, dass 3 % der Zellen Bu-1 sind negativ, es wird interessant sein zu bestimmen, ob diese Zellen sich mit IBDV infizieren und ihre Genexpression und Beitrag zur Pathogenese erforschen.
Wir erwarten, dass die Ex Vivo Huhn primäre Bursitis Kultur Zellmodell auch erweitert werden, um den Wirt Zelle-Virus Interaktionen von anderen B-Zell tropischen Viren infizieren Hühner wie ALV oder REV, studieren und auch für andere Vogelarten (erweitert werden könnte z.B., Enten oder Puten). Die Fähigkeit, auch primäre Bursitis Zellen ex Vivo Kultur eröffnet die Möglichkeit, Aspekte der Pathogenese und Immunsuppression, die durch diese Viren ohne Vögel infizieren. Da in Vivo Studien signifikanten Morbidität führen, wird dies einen erheblichen Einfluss auf die Vermeidung, Verfeinerung und Verminderung des Einsatzes von Tieren in der Forschung haben.
Zusammenfassend lässt sich sagen hat die ex Vivo Huhn primäre Bursitis Kultur Zellmodell hier beschrieben das Potenzial, das Verständnis wie Vogelgrippe B-Zelle zu erweitern, wie tropische Viren mit ihren Wirtszellen zu interagieren, und reduziert die Anzahl der Vögel in in Vivo verwendet Infektion-Studien. Die Techniken können auch auf mehrere lymphatischen Organe, mehrere Viren und unter Umständen mehrere Vogelarten, so dass es ein attraktives Modell, die auf die Vogelgrippe Virologie und Immunologie Felder beitragen können.

Die globale Geflügelindustrie ist wichtig, genügend Nahrungsmittel für eine wachsende Weltbevölkerung zu sichern. Jedoch ist die Bedrohung für die Ernährungssicherheit und das Wohlergehen der betroffenen Vögel Immunsuppression und stellt eine wichtige wirtschaftliche Herausforderung für die Industrie. Die Mehrzahl der Fälle der Immunsuppression bei Hühnern werden durch die Infektion mit immunsuppressiven Viren, mit denen größte Verantwortung für die Beeinträchtigung der erworbenen Immunität haben einen Tropismus für T- und B-Lymphozyten1verursacht. Vögeln befinden sich die Mehrheit der B-Zellen innerhalb eines Organs, bekannt als der Bursa fabricii (BF). B-Zellen sind anfällig für Infektionen mit mehreren immunsuppressive Viren, einschließlich Lyse, wie z. B. IBDV und Marek Krankheit-Virus (MDV), führen zu und Transformation, wie Vogelgrippe noch Virus (ALV) und Reticuloendotheliosis Virus (führen zu REV).
Um bessere Strategien zur Steuerung dieser Infektionen entwickeln, gilt es, die Interaktion der Viren mit Huhn B-Zellen zu kennzeichnen. Aber wenn ein Vogel B-Zellen entfernt sind, überleben sie nicht gut in ex Vivo Kultur2, macht es schwierig, eine gründliche Analyse der Wechselwirkungen des IBDV mit Huhn B Zellen oder die frühen Ereignisse nach ALV oder REV Infektion führen. Infolgedessen wurden viele Gastgeber Zell-Virus Wechselwirkungen studierte in Vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Obwohl diese Studien informativ sind, beziehen sie den Gebrauch von infizierten Vögel, die an Krankheiten leiden, die schwerwiegend sein können.
CD40-Ligand ist ein Molekül, das B-Zell-Proliferation11induziert. Nach Identifizierung des Gens Codierung Huhns CD40L (chCD40L), ein lösliches Fusionsprotein wurde so entwickelt, dass wenn die Nährmedien hinzugefügt, induziert die Verbreitung von Huhn primäre B Zellen ex Vivo12. Im Jahr 2015 wurden B-Zellen, die auf diese Weise kultiviert gefunden die Replikation des MDV2 und im Jahr 2017, wir und andere zu unterstützen, dass primäre Bursitis Zellen angeregt mit chCD40L als Modell verwendet werden könnte, IBDV Replikation13,14zu studieren. Hier beschreiben wir die Isolation und Kultur Huhn primären Bursitis Zellen, die Infektion der Zellen mit IBDV und die Quantifizierung der Virusreplikation. Obwohl wir die Methode im Zusammenhang mit der BF beschreiben, könnte dies zu isolieren und Kultur Zellen aus verschiedenen lymphatischen Organen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>hitzeinaktiviert bei 56 &deg; C für 1 h</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Steriler Einwegfilter mit PES-Membran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88528</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Millex-GP Spritzenvorsatzfilter</td><td>Merck</td><td>F7648</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBBS) - CaCl22 - MgCl2</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure saure Lösung (EDTA)</td><td>Merck</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 x) + GlutaMAX</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Hühnerserum</td><td>Merck</td><td>C5405-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Natrium-Selenit</td><td>gibco von Life Technologien</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Zellsieb</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Merck</td><td>10831-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Nunc96 Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten mit rundem Boden</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem flachem Boden TC-behandelt, mit Deckel, steril</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Rneasy Mini Bausatz</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

ein ex-vivo huhn primärkultur bursitis-zelle modell zur bursitis infektionskrankheit virus pathogenese

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursitis Infektionskrankheit Virus (IBDV) ist eine Birnavirus für die Geflügelindustrie von wirtschaftlicher Bedeutung. Das Virus infiziert die B-Zellen, Morbidität, Mortalität und Immunsuppression in infizierten Vögel verursacht. In dieser Studie beschreiben wir die Isolation von Huhn primäre Bursitis Zellen aus der Bursa fabricii, die Kultur und die Infektion der Zellen mit IBDV und die Quantifizierung der Virusreplikation. Die Zugabe von Huhn CD40 Ligand deutlich erhöht Zellproliferation um das Vierfache über sechs Tage Kultur und deutlich verbesserte Zellviabilität. Zwei Stämme von IBDV, angepasste eine Zellkultur, Belastung, D78 und eines sehr virulenten Stamm, UK661, gut in den Zellkulturen ex Vivo repliziert. Dieses Modell wird der Einsatz bei der Bestimmung, wie Zellen reagieren auf IBDV Infektion und ermöglichen eine Verringerung der Zahl der infizierten Vögel in IBDV Pathogenese Studien verwendet werden. Das Modell kann auch an andere Viren ausgeweitet werden und auf verschiedene Vogelarten angewendet werden.

Huhn primären Bursitis Zellen können in Anwesenheit von Huhn CD40L kultiviert werden
Wenn Huhn primären Bursitis Zellen in Anwesenheit von löslichen chCD40L gezüchtet wurden, die Anzahl der Zellen vervierfacht von 9.02 x 105 bis 3,63 x 106 pro mL über einen Zeitraum von 6 Tagen, im Gegensatz zu, wenn es nicht vorhanden war (p &lt; 0,05) ( Abbildung 1A). Zellviabilität wurde auch deutlich verbessert, zum Beispiel von 25 % am 3. Tag Post-Kultur in Ermangelung von chCD40L auf 48 % im Beisein von chCD40L (p &lt; 0,05) (Abbildung 1 b)13.
Huhn primären Bursitis Zellen können die Replikation der beiden Zellkultur angepasst und sehr virulente Stämme des IBDV unterstützen.
Mock-infiziert und infizierten Zellkulturen gefixt 18 h postinfection, beschriftet mit einem monoklonalen Antikörper gegen IBDV VP2 und Sekundärantikörpers konjugiert, Alexa Fluor 488 und counterstained mit DAPI. Infizierte Zellen hatten Beweise der grünen Fluoreszenz um den Atomkern (Abbildung 2A), konsistent mit der Anwesenheit des IBDV im Zytoplasma. Dies zeigte sich bei zwei Stämmen des IBDV, eine Zellkultur angepasste Belastung, D78 und eines sehr virulenten Stamm, UK661 (Abbildung 2A). Bei 5, 18, 24 und 48 h Postinfection wurde RNA aus infizierten Kulturen extrahiert und RT-qPCR mit Primer spezifisch für eine konservierte Region des Gens IBDV VP4 unterzogen. Die Expression von VP4 wurde zunächst auf die Housekeeping Gene TBP normalisiert und dann ausgedrückt als Falte Veränderung im Vergleich zu mock Proben in einer ΔΔCt Analyse. IBDV VP4 Ausdruck stieg auf 16.603 Kopien in 48 h Postinfection mit D78 und 38.632 Kopien in 48 h Postinfection mit UK661. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Huhn primären Bursitis Zellen die Replikation von Zelle-Kultur angepasst und sehr virulent IBDV Stämme13unterstützen könnte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Abbildung 1: Chicken primäre Bursitis Zellen können in Gegenwart von Huhn CD40L gezüchtet werden. Huhn primäre Bursitis Zellen wurden in das Vorhandensein oder Fehlen von chCD40L kultiviert (schwarze Balken und weißen Balken). (A) die Anzahl der lebenden Zellen und (B) der Anteil der lebensfähigen Zellen wurden bei den angegebenen Zeitpunkten Postinfection bestimmt. Die angezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens drei wiederholte Experimente, Fehlerindikatoren repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwerts und die statistische Signifikanz wurde anhand einer gekoppelten Student t-Test zu jedem Zeitpunkt * p &lt; 0,05. diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Dulwich Et Al. modifiziert 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Abbildung 2: Huhn primäre Bursitis Zellen unterstützen die Replikation von sowohl Zellkultur angepasst und sehr virulente Stämme des IBDV. (A) Huhn primäre Bursitis Zellen wurden Mock-infizierten oder infizierte D78 oder UK661 und eine Probe von jeder Kultur wurde behoben, beschriftet und bebildert: IBDV VP2, grün; Kerne, blau. Maßstabsleiste = 7 µm. (B) RNA wurde bei den angegebenen Zeitpunkten-Postinfection Rückseite transkribiert, extrahiert und eine konservierte Region des Gens IBDV VP4 wurde durch quantitative PCR verstärkt. Die Log10 Falte ändern in VP4 Exemplarzahl war auf das TBP Housekeeping gen normalisiert und drückte im Vergleich zu Mock-infizierten Proben nach den 2–ΔΔCT Methode. Die angezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens drei wiederholte Experimente und Fehlerindikatoren repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwerts. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Dulwich Et Al. modifiziert 13.

Hier beschreiben wir die Isolation von Huhn primäre Bursitis Zellen aus der Bursa fabricii, die Kultur und die Zellen mit Bursitis Infektionskrankheit Virus-Infektion und die Quantifizierung der Virusreplikation.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Aviären Virologie zu beantworten, z. B. wie immunsuppressive Viren mit B-Zellen interagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Zellen relevanter sind als verewigte Zelllinien, die derzeit im Labor verwendet werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reaktion von Hühnerzellen auf IBDV bietet, kann sie auch auf ALV und REV angewendet werden.Diese Methode reduziert die Anzahl der Vögel in unserer Forschung, und es ist vorteilhaft für die drei Rs, die für den Ersatz, die Verringerung und Die Verfeinerung der Verwendung von Tieren in der Forschung steht. In einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank den BF in 30 Milliliter kaltes PBS mindestens dreimal waschen. Übertragen Sie das gewaschene Gewebe in eine Petrischale und fügen Sie fünf Milliliter einer 1X Kollagennase D-Lösung hinzu.Verwenden Sie eine sterile Schere oder eine Skalpellklinge, um den BF in Stücke mit einem Durchmesser von weniger als fünf Millimetern zu schneiden. Bei 37 Grad Celsius mit periodischer sanfter Rührung 30 Minuten inkubieren. Danach verwenden Sie eine sterile Pasteur Pipette, um die Mischung wiederholt anzusaugen, um den Zerfall des Gewebes zu fördern.Fügen Sie weitere fünf Milliliter 1X Kollagennase D-Lösung in das Gewebe, und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius mit periodischer sanfter Agitation für weitere 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Mischung ansipirieren, frische Kollagenase D-Lösung hinzufügen und inkubieren, bis das Gewebe vollständig verdaut ist. Beachten Sie, dass es kleine Granulate geben wird, die sich nicht weiter auflösen.Übergeben Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in 20 Milliliter 1x HBBS ohne Kalzium. Zentrifuge bei 400 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter n1X RPMI mit 5%FBS wieder auf.Dann überlagern Sie 10 Milliliter der Zellsuspension auf fünf Milliliter Dichtegradientenmedien, die Polysucrose und Natriumdiatrizoat enthalten. Stellen Sie sicher, dass es eine klare Schnittstelle zwischen den beiden Ebenen gibt. Zentrifuge bei 900 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.Die Zellen sollten ein Band an der Schnittstelle zwischen dem Zellmedium und dem Dichtegradientenmedium bilden. Als Nächstes verwenden Sie eine sterile Pasteur Pipette, um die Zellen zu entfernen und sie in ein Rohr mit kaltem PBS zu übertragen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang mit 400 mal g zentrieren und dann in kaltem PBS wieder aufhängen.Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Zunächst zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Setzen Sie die Zellen in 30 Millilitern des 1x kompletten IMDM aus.Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension und fügen Sie es zu einer Trypan blue Lösung hinzu. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die Trypan blau ausschließen, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und die prozentuale Lebensfähigkeit. Danach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten.Resuspend die Zellen in vollständig IMDM ergänzt mit einer Ein-zu-20 Verdünnung von Huhn CD40 Liganden mit einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter. Kultur die Zellen in entweder 96-oder 24-Well-Platten für 48 bis 72 Stunden. 48 bis 72 Stunden nach der Isolation, tauen Sie ein Aliquot des Virus.Wirbeln Sie die Probe, und speichern Sie es auf Eis. Setzen Sie die primären Bohrzellen im IMDM-Medium wieder aus. Nehmen Sie einen 10-Mikroliter Aliquot der Zellsuspension, und fügen Sie es zu 10 Mikroliter einer Trypan blau Lösung.Bestimmen Sie dann die Anzahl der Zellen und die prozentuale Lebensfähigkeit. Verdünnen Sie das Virus in 1X komplette IMDM auf die entsprechende Vielzahl von Infektionen, um das Virus inoculum zu machen. Mischen Sie diese Verdünnung durch Wirbel.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie als Nächstes den Überstand, und suspendieren Sie die Zellen im Virus inoculum. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit periodischer Aufregung.Danach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie das Virus inoculum, und waschen Sie die Zellen in 1X komplette IMDM-Medien. Kultur die Zellen entweder in 96-oder 24-Well-Platten.In dieser Studie werden Hühner-Primär-Bursalzellen sukzessive ex vivo in Gegenwart von löslichem Huhn CD40 Ligand kultiviert. Zellen, die in Gegenwart von löslichem Huhn CD40 Ligand kultiviert werden, werden gesehen, um das Vierfache von 902, 000 auf 3,63 Millionen pro Milliliter über einen Zeitraum von sechs Tagen zu erhöhen. Die Zelllebensfähigkeit wird auch in Gegenwart von Huhn CD40 Ligand deutlich verbessert.In repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern wird eine grüne Fluoreszenz um den Zellkern gesehen, die mit dem Vorhandensein von IBDV im Zytoplasma übereinstimmt. Dies ist offensichtlich für zwei Stämme von IBDV, eine zellkulturangepasste Sorte, D78, und eine sehr virulente Sorte, UK661. Die RNA wird dann nach der Infektion nach fünf, 18, 24 und 48 Stunden extrahiert und RT-qPCR mit Primern unterzogen, die spezifisch für eine konservierte Region des IBDV VP4-Gens sind.IbDV VP4 Ausdruck wird gesehen, um auf 16, 603 Kopien bei 48 Stunden nach der Infektion mit D78 und auf 38, 632 Kopien bei 48 Stunden Nachinfektion mit UK661 zu erhöhen. Diese Daten zeigen, dass primäre Bursalzellen von Hühnern die Replikation zellkulturangepasster und sehr virulenter IBDV-Stämme unterstützen können. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie RT-qPCR, Microarray oder RNA-Seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Zellen auf die Infektion reagieren.Wir haben verglichen, wie die Zellen auf infektionen mit einem abgeschwächten Stamm und einem sehr virulenten Stamm von IBDV reagieren und wir untersuchen nun, wie sie auf andere Virusinfektionen reagieren. Die Fähigkeit, diese Zellen zu kultizieren, ermöglicht es uns, Aspekte der Viruspathogenese und Immunsuppression zu untersuchen, ohne Vögel infizieren zu müssen. Dies wird erhebliche Auswirkungen auf die drei R, die Ersetzung, Verfeinerung und Verringerung des Einsatzes von Tieren in der Forschung haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Dieses Video zeigt die Isolierung der tumortragenden chorioallantoischen Membran aus dem Hühnerembryo. Das geerntete CAM kann für weitere Downstream-Anwendungen verwendet werden.

Ernte der Chorioallantoismembran von Küken: Eine Methode zur Isolierung einer tumortransplantattragenden chorioallantoischen Membran aus Hühnerei

Fruchtbare Hühnereier werden häufig verwendet, um große Mengen an humanen Influenza-A-Viren zu produzieren, da sie ein bequemes und kostengünstiges System zum Nachweis hoher Viruserträge bieten.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Um den Mechanismus der Lipidverwertung in Dottersackmembranen während der späten Stadien der Embryonalentwicklung von Vögeln zu untersuchen, haben wir ein primäres endodermales Epithelzellkultursystem für japanische Wachteln etabliert.

Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg &gt; 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).

Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von aviären T-Zellen in vitro , indem Gedächtnis-T-Zellen aus infizierten Enten isoliert werden, was die Erzeugung hochreiner spezifischer Enten-T-Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine intrazelluläre Zytokin-Färbemethode (ICS) etabliert, um die IFN-γ-Sekretion in Enten-T-Zellen genau zu messen.

In vitro Kultur für H5N1-spezifische Enten-T-Zellen und Nachweis von Immunantworten mittels intrazellulärer Zytokin-Färbemethode

Diese Methode zeigt den Hühnerembryo als einfaches und kostengünstiges in vivo Modell, um den bakteriellen Erreger L. monocytogenes aus einem lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Zustand wiederzubeleben und mit potenziellen weiteren Anwendungen für das Verständnis der bakteriellen Ruhemechanismen.

Hühnerembryo als In-vivo-Modell zur Wiederbelebung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Krankheitserreger

Erfahren Sie die Isolation und Kultivierung primärer Bursazellen von Hühnern zur Untersuchung der IBDV-Replikation. Diese Methode ermöglicht virologische Studien ohne Infektion lebender Tiere und unterstützt die 3R-Prinzipien.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

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