Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

Diese Methode bietet ein schnelles und zuverlässiges Diagnoseinstrument zur Identifizierung von Bemisia tabaci, einem invasiven Insektenschädling, der die Produktion von Gemüse und Zierpflanzen in vielen Ländern der Welt beeinflusst. Aufgrund seiner Leichtigkeit kann die Methode vor Ort direkt an den Eingangspunkten für Pflanzenimportprodukte wie Häfen und Flughäfen durchgeführt werden und hat somit das Potenzial, die Verbreitung von Bemisia tabaci entlang von Handelsnetzen zu reduzieren. Verwenden Sie zunächst eine Schere, um einen achtrohrigen LAMP-Streifen in zwei, vierrohrige LAMP-Streifen zu schneiden.

Beschriften Sie dann die Rohre nach dem schemain Ziffer 1 des Textprotokolls. Danach bereiten Sie genügend B.tabaci LAMP Reaktionsmaster-Mix für 80 Reaktionen vor. Dann 22,5 Mikroliter des Master-Mix in jedes der Rohre der vierrohrigen LAMP-Streifen geben.

Pulszentrifuge, und legen Sie sie auf Eis. Schnell Wirbel und Pulszentrifuge B.tabaci LAMP PAC. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter in das Rohr mit der Bezeichnung PAC in jedem der vierrohrigen LAMP-Streifen hinzu.

Schließen Sie anschließend die Deckel und lagern Sie die gebrauchsfertigen B.tabaci LAMP-Kit-Einheiten bei minus 20 Grad Celsius. Um mit der DNA-Extraktion zu beginnen, verwenden Sie sterile Zahnstocher, um die Insektenproben in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren mit 30 Mikroliter N-DNA-Extraktionslösung zu übertragen. Dann inkubieren Sie die Proben für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius in einem ThermoMixer auf 300 Rpm eingestellt.

Kurz Wirbel und Puls zentrifugieren die Proben. Thaw eines der gebrauchsfertigen B.tabaci LAMP-Kits. Dann wirbeln Sie das Kit schnell aus, und Puls zentrifugieren Sie es.

Fügen Sie den S-one- und S-two-Röhren 2,5 Mikroliter DNA-Extrakt der Probe hinzu. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter reine alkalische DNA-Extraktionslösung in das NAC-Rohr. Nach Wirbeln und Pulszentrifugieren des Kits legen Sie das Kit in ein LAMP-Analysegerät ein und führen 60 Minuten lang eine isotherme DNA-Amplifikationsanalyse bei 65 Grad Celsius durch.

Führen Sie im gleichen Durchlauf eine Schmelztemperaturanalyse der DNA-Verstärkungsprodukte durch, indem Sie das Kit zunächst auf 98 Grad Celsius erhitzen und auf 75 Grad Celsius abkühlen. Überprüfen Sie die LAMP-Auslesung mit der automatisierten LAMP-Validierungsanwendung. Definieren Sie zunächst die Zielart und die Anzahl der getesteten Proben, bevor Sie auf die Schaltfläche Bericht generieren klicken.

Übertragen Sie schließlich die Auslesung in die entsprechenden Eingabefelder der Validierungsanwendung. Unmittelbar nach der Eingabe der Daten wird das Ergebnis der Validierung angezeigt. In diesem Protokoll wurden B.tabaci-Insektenproben, die im Rahmen des regulären Schweizer Importkontrollprozesses abgefangen wurden, mittels LAMP-Assay analysiert.

Von insgesamt 80 analysierten Proben wurden 75 Proben korrekt als echte Positivwerte und zwei Proben korrekt als echte Negative identifiziert. Drei Exemplare waren jedoch falsche Negative und wurden fälschlicherweise als nicht B.tabaci identifiziert. Ein Teil der Tests wurde vor Ort von Pflanzengesundheitsinspektoren am Flughafen Zürich durchgeführt.

In den repräsentativen Ergebnissen wurden die Proben eins und zwei korrekt als B.tabaci mittels DNA-Verstärkung nach etwa 30 Minuten bei der erwarteten Glühtemperatur von etwa 82 Grad Celsius identifiziert. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Methode den Weg für eine schnelle und einfach durchzuführende Vor-Ort-Identifikation von Bemisia tabaci. Das Protokoll ist so konzipiert, dass es von Pflanzengesundheitsinspektoren mit eingeschränkter Laborausbildung durchgeführt werden kann.

Nach erfolgreicher Vor-Ort-Validierung der Methode an einem Schweizer Eingangsort für Pflanzenimportprodukte könnte das Verfahren an andere Pflanzenpathogene, aber gegebenenfalls auch an andere menschliche oder tierärztliche Krankheitserreger angepasst werden.