Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Wir stellen hiermit ein Protokoll vor, um am Krankenbett die Endotoxinaktivität menschlicher Vollblutproben zu messen. Der Endotoxin Activity Assay ist ein einfacher Test und kann ein nützlicher Biomarker bei kritisch kranken Patienten mit Sepsis sein.

Sepsis kann zu Multiorganversagen und Tod führen. Das Endotoxin ist ein grundlegender Bestandteil gramnegativer Bakterien. Erhöhte zirkulierende Konzentrationen von Endotoxin könnten Patienten mit höherem Risiko identifizieren, eine schwerere Krankheit zu entwickeln.

Der Endotoxin Activity Assay kann als einfacher, schneller und zuverlässiger Biomarker der systemischen Endotoxämie verwendet werden. Die Früherkennung dieses Toxins könnte Ärzten helfen, Patienten mit septischem Schock zu behandeln. Bei Patienten mit septischem Schock könnte die frühzeitige Erkennung eines sich rasch entwickelnden Zustands zu einer schnelleren und intensiveren lebenserhaltenden Therapie führen, was möglicherweise zu besseren Ergebnissen führen kann.

Die Molekularbiologin Lisa Mathiasen demonstriert dieses Verfahren, die mit unserer Forschungsgruppe zusammenarbeitet. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie ein EA-Testkit fest und packen Sie die fünf verschiedenen Rohrarten aus. Verwenden Sie das Rohr Nummer eins, das Kontrollrohr, um die basale Aktivität des unspezifischen oxidativen Ausbruchs der Neutrophile des Patienten in Ermangelung eines spezifischen Antikörpers zu messen.

Verwenden Sie das Rohr Nummer zwei, das Probenrohr, um den oxidativen Ausbruch als Reaktion auf den LPS-Antikörperkomplex zu messen. Verwenden Sie das Rohr Nummer drei, das Max-Rohr, um den maximalen oxidativen Ausbruch der Neutrophile des Patienten als Reaktion auf einen Überschuss an Endotoxin zu messen. Verwenden Sie das Rohr Nummer vier, das LPS-Rohr, als Quelle von exogenem Endotoxin.

Und verwenden Sie Tube Nummer fünf, die Aliquot-Röhre, für die Blutspeicherung. Sammeln Sie Blutproben des Patienten in sterilen Schläuchen, die EDTA-Antikoagulans enthalten, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bevor Sie den EA-Test durchführen. Bevor Sie mit dem Test beginnen, schalten Sie das Chemiluminometer und den Inkubator-Shaker ein und erwärmen Sie den Inkubator auf 37 Grad Celsius.

Legen Sie zunächst die EA-Rohre in Rohrträgern und entfernen Sie die Kappen. Verwenden Sie eine Combipipette, um einen Milliliter des EA-Reagenzes aus der Flasche in die Rohre Nummer eins, Nummer zwei und Nummer drei zu übertragen, indem Sie die Seite der Rohre nach unten pfeifen. Um die Blutentnahmeröhrchen 20 Mal sanft umzukehren, um die Blutprobe des Patienten zu mischen.

Dann Pipette 0,5 Milliliter Patientenblut in Tube Nummer vier und Rohr Nummer fünf. Vortex-Rohr Nummer vier für 10 Sekunden. Legen Sie die Rohrträger mit allen EA-Reagenzgläsern in den Inkubator-Shaker.

Schließen Sie den Deckel und bebrüten Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach öffnen Sie den Inkubatordeckel und entfernen Sie die Rohrträger aus dem Shaker. Wirbelrohr Nummer fünf.

Mit einer sterilen Spitze, Pipette 40 Mikroliter Blut in die Röhren Nummer eins und Nummer zwei, in doppelter Ausführung. Wirbelrohr Nummer vier. Mit der gleichen Pipettespitze 40 Mikroliter Blut aus Tube Nummer vier in Tube Nummer drei in Doppeltum übertragen.

Wirbeln Sie die sechs letzten Reagenzgläser nacheinander. Legen Sie die Rohrträger wieder in den Brüter und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie den Shaker auf 100 Rpm, und starten Sie die Bewegung für 14 Minuten.

Setzen Sie die EA-beschriftete Chipkarte in das Chemiluminometer ein, und drücken Sie Start. Folgen Sie nach der 14-minütigen Inkubation den Anweisungen auf dem Chemiluminometer. Wirbeln Sie jedes Rohr 10 Sekunden lang sanft, bevor Sie es auf den Probenhalter des Chemiluminometers legen.

Öffnen Sie die Probenschublade, und legen Sie das Rohr Nummer eins in den Probenhalter. Schließen Sie dann die Probenschublade, und warten Sie auf den Wert der relativen Lichteinheit. Wiederholen Sie diesen Lesevorgang für die Röhren zwei und drei sowie für alle Duplikate, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nachdem alle Rohre verarbeitet wurden, werden die EA-Ergebnisse automatisch berechnet und ausgedruckt. Wiederholen Sie den gesamten Assay-Prozess für jede Blutprobe, die getestet werden muss. Bewahren Sie das EA Assay Kit und seine Komponenten in der original versiegelten Verpackung bei einer Temperatur zwischen zwei und 25 Grad Celsius auf.

In dieser Studie wird ein Endotoxin Activity Assay durchgeführt, um Vollblut-Endotoxämie bei kritisch kranken Patienten zu erkennen. Ein EA-Wert von weniger als 0,40 EA-Einheiten weist auf eine niedrige Endotoxinaktivität hin, die einer niedrigen zirkulierenden LPS-Konzentration entspricht, die ein geringes Risiko für die Progression zu einem schweren Krankheitszustand darstellt. Ein Ergebnis zwischen 0,40 und 0,59 EA-Einheiten zeigt einen mittleren Endotoxinaktivitätsgrad an, der ein Zwischenrisiko für die Entwicklung einer schweren Sepsis und eines septischen Schocks darstellt.

Ergebnisse von 0,60 EA-Einheiten oder mehr weisen auf ein hohes Endotoxin-Aktivitätsniveau hin, was ein hohes Risiko für septischen Schock und schlechte Patientenergebnisse darstellt. Blut aus den Röhrchen Nummer vier und fünf muss mit dem richtigen Reagenzglas gemischt werden. Es ist besonders darauf zu achten, dass die richtige Reihenfolge im Protokoll angegeben ist.

Jede Röhre wird in Duplikaten ausgeführt, was in dieser Phase zu Fehlern führen kann. Nach seiner Einführung wurde der EA-Test als Biomarker für die Risikoschichtung von Patienten mit systemischer Hypoperfusion vorgeschlagen. Außerdem wurde es als Screening-Test untersucht, um Patienten für fortgeschrittene Behandlungsstrategien zur Hämorifikation auszuwählen.