Name: Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Lernen Sie den Endotoxin Activity Assay zur schnellen Detektion von Endotoxinämie im Vollblut kritischer Patienten. Diese Methode ermöglicht Früherkennung von Sepsis und verbessert klinische Entscheidungen.

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Wir danken Paolo Bragana und Lisa Mathiasen, Ph.D. für ihre Überprüfung der Assay-Protokoll-Methodik. Dario Winterton, MD, leistete umfangreiche Hilfe bei der Überprüfung des Manuskripts für Englischkenntnisse.

Das Protokoll wird nach institutionellen Richtlinien in Bezug auf den Umgang mit menschlichen Bioproben und nach den aktuellen Standardverfahren unseres klinischen Labors durchgeführt. Die Verwendung von EA-Daten und klinischen Informationen von getesteten Patienten folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.
1. Laborgeräte und Assay Kit-Inhalte
<ol><li>Bewahren Sie das EA-Kit bei 2–8 °C auf, wenn es nicht verwendet wird.</li>
	<li>
Jeder EA-Test besteht aus 5 verschiedenen Rohrarten; für einen anderen Teil des Tests verwenden (siehe Abschnitt 2).
	<ol>
<li>Verwenden Sie Tube #1 (das "Control"-Rohr), um die basale Aktivität des unspezifischen oxidativen Ausbruchs der Neutrophile des Patienten in Ermangelung eines spezifischen Antikörpers zu messen.</li>
		<li>Verwenden Sie tube #2 (das "Sample"-Rohr), um den oxidativen Ausbruch als Reaktion auf den LPS-Antikörper-Komplex zu messen.</li>
		<li>Verwenden Sie Tube #3 (die "Max" Röhre), um den maximalen oxidativen Ausbruch der Neutrophile des Patienten als Reaktion auf einen Überschuss an Endotoxin zu messen.</li>
		<li>Verwenden Sie tube #4 (das "LPS"-Rohr) als Quelle von exogenem Endotoxin.</li>
		<li>Verwenden Sie Tube #5 ("Aliquot" Rohr) für die Blutspeicherung. HINWEIS: Für jede getestete Blutprobe sind Duplikate von #1, #2 und #3 vorgesehen (die EA-Reagenzflasche und der Qualitätskontrolltest können für alle in einem Beutel enthaltenen Tests verwendet werden).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Patientenblutproben in sterilen Röhrchen, die EDTA-Gerinnungsmittel enthalten. Bewahren Sie Blutproben bei Raumtemperatur auf, bevor Sie den EA-Test ausführen.</li>
	<li>Bevor Sie mit dem Test beginnen, schalten Sie das Chemiluminometer und den Inkubator-Shaker ein. Erwärmen Sie den Inkubator auf eine Temperatur von 37 °C.</li>
	<li>Idealerweise beginnen Sie mit der Verarbeitung der Probe innerhalb von 30 min aus der Blutentnahme.</li>
</ol>2. Endotoxin Aktivität Assay
<ol><li>Bereiten Sie die EA-Reagenzgläser für die Blutprobe jedes Patienten vor, die Sie testen müssen. Legen Sie die Rohre in Rohrträger. Entfernen Sie dann die Kappen.</li>
	<li>Mit Hilfe einer Combipipette, Pipette ein 1 ml Volumen des EA-Reagenz aus der Flasche in Rohre #1 (Steuerrohr), #2 (Proberohr) und #3 (Max Rohr), jeweils in doppelter Ausführung. HINWEIS: Pipette an der Seite des Rohres, um zu vermeiden, dass die Lösung wieder nach oben spritzt.</li>
	<li>Mischen Sie die Blutprobe des Patienten, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 20 Mal sanft invertieren. Dann Pipette 0,5 ml Patientenblut in die #4 (LPS max Tube) und Rohr #5 (Aliquot-Rohr). Wirbelrohr #4 für 10 s.</li>
	<li>Legen Sie die Rohrträger mit allen EA-Reagenzgläsern in den Inkubator-Shaker. Schließen Sie den Deckel und brüten Sie 10 min bei einer Temperatur von 37°C.</li>
	<li>Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie die Rohrträger aus dem Inkubator-Shaker. Wirbelrohr #5 (Aliquot-Rohr). Mit einer sterilen Spitze, Pipette 40 l Blut in die Röhrchen #1 und #2, in doppelter Ausführung.</li>
	<li>Vortex-Rohr #4 (LPS-Rohr). Mit der gleichen Pipette Spitze, Pipette 40 l Blut aus Rohr #4 in Rohr #3 (Max Rohr), in dupliziert.</li>
	<li>Die sechs letzten Reagenzgläser (#1, #2, #3 und entsprechende Duplikate) legen sie dann wieder in ihre Regale. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Rohre für die gleiche Zeit gewirbelt sind.</li>
	<li>Legen Sie die Rohrträger wieder in den Brüter und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie den inkubierenden Shaker auf 100 Rpm, dann starten Sie die Bewegung für 14 min.</li>
	<li>Legen Sie die EA-beschriftete Chipkarte in das Chemiluminometer ein und drücken Sie den Start. Folgen Sie nach der 14 min Inkubation den Anweisungen auf dem Chemiluminometer, um die EA-Röhren in der richtigen Reihenfolge zu lesen.</li>
	<li>Wirbeln Sie jedes Rohr für 10 s sanft, bevor Sie es auf den Probenhalter des Chemiluminometers legen. Öffnen Sie die Probenschublade und legen Sie das #1 im Probenhalter. Schließen Sie dann die Probenschublade und warten Sie auf den RLU-Wert (Relative Light Unit).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.10 für Rohr 2 und Rohr 3.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.10 für Duplikatrohre 1, 2 und 3. HINWEIS: Versuchen Sie, alle Rohre für die gleiche Zeit während der Schritte 2.10–2.12 zu wirbeln.</li>
	<li>Nachdem alle Rohre verarbeitet wurden, beachten Sie, dass die EA-Ergebnisse automatisch berechnet und gedruckt werden. Die Werte werden als EA-Einheiten ausgedrückt und stellen den Mittelwert doppelter Ermittlungen aus denselben Stichproben dar.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.13 für jede Blutprobe, die getestet werden muss.</li>
	<li>Nach Abschluss des Tests die restlichen Reagenzgläser und EA-Reagenzien bis zu 30 Tage bei 2–8 °C lagern.</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems%3A+the+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li>
<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li>
<li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li>
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<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-Negative+Severe+Sepsis%3A+Nationwide+Trends+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li>
<li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level%5BTitle%5D)+AND+%22The+EUPHRATES+Randomized+Clinical+Trial.+JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness%3A+results+of+the+MEDIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3B+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+et+Diathesis+Haemorrhagica%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).</li>
<li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUPHRATES+trial+%28Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock%29%3A+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218(2014).</li>
<li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock%3A+An+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li>
<li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li>
<li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit%3A+a+pilot+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li>
<li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li>
<li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+%28EA%29+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis%3A+results+of+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).</li>
<li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li>
<li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidental+phenomenon+or+true+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Incidental phenomenon or true pathology?</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).</li>
<li>Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li>
<li>Virzì, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis%3A+Role+of+Endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22in+Cell+Death+Pathways+and+Inflammation.+Kidney+and+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li>
<li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%22%5BJournal%5D)">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li>
</ol>

Die Estor SpA deckte die Kosten für die Veröffentlichungs- und Videoproduktionsgebühr der Zeitschrift. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Septischer Schock ist heute noch mit einer Sterblichkeit von bis zu 40 % verbunden, obwohl diese Rate je nach den betrachteten Berichtenvariiert 16. Die Notwendigkeit neuer und besserer Biomarker wird von den meisten Experten auf den Feldern befürwortet, um Ärzten bei der Frühdiagnose, einem besseren Management und der Prognose von Patienten mit septischem Schock zu helfen6.
Die Durchführung eines EA-Tests erfordert keine technischen Vorkenntniss...

Das Lipopolysaccharid (LPS), auch bekannt als Endotoxin, ist ein wichtiger Bestandteil der Membranstruktur von Gram-negativen (GN) Bakterien. Es macht etwa 10% der Zellwand aus und ist für die äußere Membranintegrität und Homöostase lebenswichtig. Darüber hinaus ist es ein potenter Aktivator des angeborenen Immunsystems des Wirts1,2.
In-vitro-Exposition von angeborenen Zellen des Immunsystems an LPS führt zu Veränderungen in der Expression mehrerer Gene3. Die Verabreichung sehr kleiner Mengen von LPS bei gesunden menschlichen Probanden löst die Kaskade einer akuten systemischen Entzündung aus, während Sepsis und septischer Schock mit höheren Endotoxinkonzentrationen4,5auftreten können.
Sepsis ist ein lebensbedrohlicher Zustand, der, wenn er nicht sofort erkannt wird, zu Multiorganversagen und Tod führen kann. Septische Patienten müssen rechtzeitig behandelt werden, mit aggressiver Reanimation, einer adäquaten Antibiotikatherapie, einer optimalen Quellcodeverwaltung und prompten Organunterstützungsstrategien. Die Diagnose der Ätiologie der Sepsis basiert in erster Linie auf klinischer Erkennung und kulturbasiertem Pathogennachweis6. Die Ergebnisse mikrobieller Kulturen können jedoch bis zu 48 h dauern und sind in bis zu 30% der Fälle7nicht schlüssig. Frühzeitige Identifizierung und Intervention können zu besseren Patientenergebnissen führen. Bei Patienten, bei denen eine Sepsis vermutet wird, werden Entscheidungen oft auf der Grundlage physiologischer und biochemischer Parameter getroffen, ohne dass ein klares Anzeichen für Endotoxämie vorliegt.
Die Messung der Endotoxinaktivität (EA) kann mittels eines kommerziellen Assays (siehe Materialtabelle)im Vollblut ermittelt werden. Es kann als Biomarker der systemischen Endotoxämie für die frühe Schichtung der Krankheitschwere verwendet werden, insbesondere bei Patienten mit Risiko für die Entwicklung septischen Schocks8. Der Test wurde verwendet, um Polymyxin B Hämoperfusionstherapie in einer kürzlich veröffentlichten doppelblinden randomisierten kontrollierten klinischen Studie bei Patienten mit septischem Schock9zu führen. Bei kritisch kranken Patienten zeigte die MEDIC-Studie, dass erhöhte EA-Spiegel mit multipler Organdysfunktion, Intensivstation (ICU) Aufenthaltsdauer und Mortalität10in Verbindung gebracht werden.
Verschiedene Assays wurden entwickelt, um Endotoxin zu detektieren. Der Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assay, entweder als Gel-Clot, trübungsrisch oder chromogener Test, wurde bisher am häufigsten für die Schätzung von Serumendotoxin angenommen. Es basiert auf der Fähigkeit von Endotoxin, die Gerinnung der Hämolymphe der Hufeisenkrabbe Limulus polyphemuszu induzieren. Dieser Test hat jedoch einige Einschränkungen in Bezug auf die Spezifität. Insbesondere kann es auch durch andere mikrobielle Produkte als Endotoxin aktiviert werden, wie z. B. Komponenten der Pilzzellwand, und es kann durch verschiedene menschliche Plasmaproteine gehemmt werden11.
Während des letzten Jahrzehnts wurde die Messung von EA als Biomarker der zirkulierenden Endotoxämie entwickelt und validiert. Im Vergleich zum LAL-Test ist EA im klinischen Umfeld schneller und einfacher zu implementieren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass es genauer als LAL im Vollblut ist, mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität, sowohl in vitro als auch in vivo12.
Trotz seiner anfänglichen Implementierung als frühes diagnostisches Werkzeug zur schnellen Identifizierung von GN-Bakterien als Sepsis-Erreger wurde der EA-Spiegel auch als Biomarker für die Schwere der Erkrankung untersucht. In diesem Zusammenhang hat sich gezeigt, dass es besonders nützlich ist, den Hypoperfusionszustand aufgrund anhaltender kritischer Erkrankungen wie septischem Schock oder postkardialem Stillstandssyndrom13zu bewerten. In jüngerer Zeit, seit der Entwicklung von Hämopurifikifikationssystemen, wurde auch ein positives EA-Ergebnis als Screening-Tool vorgeschlagen, um potenzielle Kandidaten für eine solche Therapie genau zu identifizieren14. Kürzlich haben wir eine beobachtungsretrospektive Studie über die Prävalenz und klinische Signifikanz von frühen hohen EA-Spiegeln bei 107 Patienten mit septischem Schock durchgeführt. Im Einklang mit anderen jüngsten Ergebnissen fanden wir heraus, dass EA ein vielversprechender Marker für die Schwere der Erkrankung bei Patienten mit septischem Schock15ist.
Das Ziel des vorliegenden Manuskripts ist es, die Methode zu beschreiben, um den EA-Assay durchzuführen, entweder am Krankenbett oder im Labor, und seine mögliche Verwendung in einem repräsentativen Szenario eines septischen Schocks zu beschreiben. Diese Technik kann LPS-Aktivität erkennen, indem sie den verbesserten oxidativen Ausbruch in Neutrophilen nach ihrer Grundierung durch Komplexe eines Anti-Endotoxin-Antikörpers und LPS misst. Der erhöhte Atemausbruch wird von einem Chemiluminometer nachgewiesen und die Menge des emittierten Lichts wird proportional zur Menge an Endotoxin in der Blutprobe betrachtet. Der Assay benötigt nur wenige Reagenzien, dauert ca. 30 min und verwendet so wenig wie 40 l Vollblut12.

<table><tbody><tr><td>EAA-Bausatz</td><td>Spectral Medical Inc.</td><td>EAAST-20</td><td>Paket mit 20 Tests + 1 Qualitätskontrolle</td></tr><tr><td>Smart Line TL</td><td>Berthold</td><td>EAASL</td><td>Luminometer</td></tr><tr><td>Inkubator Shaker</td><td>GRANT</td><td>ES-20</td><td>Mini-Inkubator Shaker</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2790</td><td>Vortex Instrument</td></tr></tbody></table>

endotoxin activity assay for the detection of whole blood endotoxemia in critically ill patients

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Lipopolysaccharid, auch bekannt als Endotoxin, ist ein grundlegender Bestandteil von gramnegativen Bakterien und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Sepsis und septischem Schock. Die frühzeitige Identifizierung eines infektiösen Prozesses, der sich rasch zu einer kritischen Krankheit entwickelt, könnte zu einer schnelleren und intensiveren Behandlung führen und damit potenziell zu besseren Patientenergebnissen führen. Der Endotoxin Activity (EA) Assay kann am Krankenbett als zuverlässiger Biomarker für systemische Endotoxämie verwendet werden. Der Nachweis erhöhter Endotoxin-Aktivitätsniveaus wurde wiederholt mit einer erhöhten Krankheitsschwere bei Patienten mit Sepsis und septischem Schock in Verbindung gebracht. Der Test ist schnell und einfach durchzuführen. Kurz nach der Probenahme wird ein Aliquot von Vollblut mit einem Anti-Endotoxin-Antikörper und mit zusatz LPS vermischt. Die Endotoxinaktivität wird als relativer oxidativer Ausbruch von grundierten Neutrophilen gemessen, wie sie durch Chemiolumineszenz nachgewiesen werden. Die Ausgabe des Assays wird auf einer Skala von 0 (abwesend) bis 1 (maximal) ausgedrückt und als "niedrig" (<0,4 Einheiten), "zwischengeschaltet" (0,4–0,59 Einheiten) oder "hoch" (0,6 Einheiten) kategorisiert. Die detaillierte Methodik und die Gründe für die Umsetzung des EA-Assays sind in diesem Manuskript aufgeführt.

Ein 72-jähriger Mann wurde in die Notaufnahme (ED) eines städtischen Krankenhauses eingeliefert. Wenige Tage zuvor hatte er sich seinem Hausarzt vorgestellt und sich über das Urinieren beschwert. Eine Kurzkurstherapie mit oralem Phosphomycin wurde empfohlen. Seine Krankengeschichte umfasste Bluthochdruck, unkomplizierten Typ-2-Diabetes und gutartige Prostatahyperplasie. Zu seinen Medikamenten gehörten Enalapril, Atorvastatin, Tamsulosin und Metformin.
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Wir stellen hiermit ein Protokoll vor, um am Krankenbett die Endotoxinaktivität menschlicher Vollblutproben zu messen. Der Endotoxin Activity Assay ist ein einfacher Test und kann ein nützlicher Biomarker bei kritisch kranken Patienten mit Sepsis sein.

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Sepsis kann zu Multiorganversagen und Tod führen. Das Endotoxin ist ein grundlegender Bestandteil gramnegativer Bakterien. Erhöhte zirkulierende Konzentrationen von Endotoxin könnten Patienten mit höherem Risiko identifizieren, eine schwerere Krankheit zu entwickeln.Der Endotoxin Activity Assay kann als einfacher, schneller und zuverlässiger Biomarker der systemischen Endotoxämie verwendet werden. Die Früherkennung dieses Toxins könnte Ärzten helfen, Patienten mit septischem Schock zu behandeln. Bei Patienten mit septischem Schock könnte die frühzeitige Erkennung eines sich rasch entwickelnden Zustands zu einer schnelleren und intensiveren lebenserhaltenden Therapie führen, was möglicherweise zu besseren Ergebnissen führen kann.Die Molekularbiologin Lisa Mathiasen demonstriert dieses Verfahren, die mit unserer Forschungsgruppe zusammenarbeitet. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie ein EA-Testkit fest und packen Sie die fünf verschiedenen Rohrarten aus. Verwenden Sie das Rohr Nummer eins, das Kontrollrohr, um die basale Aktivität des unspezifischen oxidativen Ausbruchs der Neutrophile des Patienten in Ermangelung eines spezifischen Antikörpers zu messen.Verwenden Sie das Rohr Nummer zwei, das Probenrohr, um den oxidativen Ausbruch als Reaktion auf den LPS-Antikörperkomplex zu messen. Verwenden Sie das Rohr Nummer drei, das Max-Rohr, um den maximalen oxidativen Ausbruch der Neutrophile des Patienten als Reaktion auf einen Überschuss an Endotoxin zu messen. Verwenden Sie das Rohr Nummer vier, das LPS-Rohr, als Quelle von exogenem Endotoxin.Und verwenden Sie Tube Nummer fünf, die Aliquot-Röhre, für die Blutspeicherung. Sammeln Sie Blutproben des Patienten in sterilen Schläuchen, die EDTA-Antikoagulans enthalten, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bevor Sie den EA-Test durchführen. Bevor Sie mit dem Test beginnen, schalten Sie das Chemiluminometer und den Inkubator-Shaker ein und erwärmen Sie den Inkubator auf 37 Grad Celsius.Legen Sie zunächst die EA-Rohre in Rohrträgern und entfernen Sie die Kappen. Verwenden Sie eine Combipipette, um einen Milliliter des EA-Reagenzes aus der Flasche in die Rohre Nummer eins, Nummer zwei und Nummer drei zu übertragen, indem Sie die Seite der Rohre nach unten pfeifen. Um die Blutentnahmeröhrchen 20 Mal sanft umzukehren, um die Blutprobe des Patienten zu mischen.Dann Pipette 0,5 Milliliter Patientenblut in Tube Nummer vier und Rohr Nummer fünf. Vortex-Rohr Nummer vier für 10 Sekunden. Legen Sie die Rohrträger mit allen EA-Reagenzgläsern in den Inkubator-Shaker.Schließen Sie den Deckel und bebrüten Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach öffnen Sie den Inkubatordeckel und entfernen Sie die Rohrträger aus dem Shaker. Wirbelrohr Nummer fünf.Mit einer sterilen Spitze, Pipette 40 Mikroliter Blut in die Röhren Nummer eins und Nummer zwei, in doppelter Ausführung. Wirbelrohr Nummer vier. Mit der gleichen Pipettespitze 40 Mikroliter Blut aus Tube Nummer vier in Tube Nummer drei in Doppeltum übertragen.Wirbeln Sie die sechs letzten Reagenzgläser nacheinander. Legen Sie die Rohrträger wieder in den Brüter und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie den Shaker auf 100 Rpm, und starten Sie die Bewegung für 14 Minuten.Setzen Sie die EA-beschriftete Chipkarte in das Chemiluminometer ein, und drücken Sie Start. Folgen Sie nach der 14-minütigen Inkubation den Anweisungen auf dem Chemiluminometer. Wirbeln Sie jedes Rohr 10 Sekunden lang sanft, bevor Sie es auf den Probenhalter des Chemiluminometers legen.Öffnen Sie die Probenschublade, und legen Sie das Rohr Nummer eins in den Probenhalter. Schließen Sie dann die Probenschublade, und warten Sie auf den Wert der relativen Lichteinheit. Wiederholen Sie diesen Lesevorgang für die Röhren zwei und drei sowie für alle Duplikate, wie im Textprotokoll beschrieben.Nachdem alle Rohre verarbeitet wurden, werden die EA-Ergebnisse automatisch berechnet und ausgedruckt. Wiederholen Sie den gesamten Assay-Prozess für jede Blutprobe, die getestet werden muss. Bewahren Sie das EA Assay Kit und seine Komponenten in der original versiegelten Verpackung bei einer Temperatur zwischen zwei und 25 Grad Celsius auf.In dieser Studie wird ein Endotoxin Activity Assay durchgeführt, um Vollblut-Endotoxämie bei kritisch kranken Patienten zu erkennen. Ein EA-Wert von weniger als 0,40 EA-Einheiten weist auf eine niedrige Endotoxinaktivität hin, die einer niedrigen zirkulierenden LPS-Konzentration entspricht, die ein geringes Risiko für die Progression zu einem schweren Krankheitszustand darstellt. Ein Ergebnis zwischen 0,40 und 0,59 EA-Einheiten zeigt einen mittleren Endotoxinaktivitätsgrad an, der ein Zwischenrisiko für die Entwicklung einer schweren Sepsis und eines septischen Schocks darstellt.Ergebnisse von 0,60 EA-Einheiten oder mehr weisen auf ein hohes Endotoxin-Aktivitätsniveau hin, was ein hohes Risiko für septischen Schock und schlechte Patientenergebnisse darstellt. Blut aus den Röhrchen Nummer vier und fünf muss mit dem richtigen Reagenzglas gemischt werden. Es ist besonders darauf zu achten, dass die richtige Reihenfolge im Protokoll angegeben ist.Jede Röhre wird in Duplikaten ausgeführt, was in dieser Phase zu Fehlern führen kann. Nach seiner Einführung wurde der EA-Test als Biomarker für die Risikoschichtung von Patienten mit systemischer Hypoperfusion vorgeschlagen. Außerdem wurde es als Screening-Test untersucht, um Patienten für fortgeschrittene Behandlungsstrategien zur Hämorifikation auszuwählen.

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Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

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