Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Denn diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entzündung und Immunologie zu beantworten. Zum Beispiel, was sind die molekularen Mechanismus der Leukozytenadhäsion und trans-endotheliale Migration. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine unbegrenzte Anwendungsdiskriminierung zwischen Transmigration und starker Zugabe von Monozyten zu endotheliaalen Monolayern ermöglicht.

Obwohl diese Methode Informationen über die Rekrutierung von Monozyten auf dem Fluss liefert, kann sie auch an andere Zellen der hämatopoetischen Systeme wie T-Zellen, B-Zellen oder Derivate von Subpopulationen angepasst werden. Nach dem Waschen die humanen Nabelvenen-Endothelzellen oder HUVEC mit 30 Mikrolitern 37 Grad Celsius M199 Medium mit einem Mikromolaren CMFDA für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ergänzt. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 150 Mikrolitern komplettem M199-Medium waschen und die Kultur in 150 Mikroliter frischem m199-Medium für weitere 30 Minuten inkubieren.

Dann ersetzen Sie den Überstand durch 150 Mikroliter komplettes M199-Medium, das die entsprechenden experimentellen Ergänzungen enthält, und geben Sie die Diakammerkultur für sechs Stunden an den Inkubator zurück. Zur isolierung der menschlichen PAN-Monozyten eine frisch entnommene Blutprobe in PBS, ergänzt mit einer Millimolar-EDTA im Verhältnis eins zu eins, verdünnen und sorgfältig 20 ml der Blutlösung auf 20 ml Dichtegradientenmedium schichten, um die Dichte gradienten durch Zentrifugation zu trennen. Sammeln Sie die mittlere periphere mononukleäre Blutplättchenschicht in eine neue 50 ml Tube mit 40 ml PBS, ergänzt mit 1 Millimolar EDTA, und bringen Sie das Endvolumen mit zusätzlicher PBS-EDTA auf 50 ml Nach dem Zählen isolieren Sie die Monozyten mit dem PAN Monozyten-Isolationskit gemäß der Anweisung des Herstellers.

Und waschen Sie die Zellen dreimal in M199 Medium ergänzt mit 0.5%Bovine Serum Albumin, oder BSA, um alle Spuren von EDTA zu beseitigen. Die Qualität der Monozytenisolation ist entscheidend für die Gewährleistung eines robusten Transmigrations- und Haftungsergebnisses. Daher ist es wichtig, die Empfehlung des Herstellers für die Isolierung strikt zu befolgen.

Setzen Sie das Pellet bei 6 mal 10 bis 6 Monozyten pro ml Konzentration in frischem M199-Medium, ergänzt mit 0,5%BSA, wieder auf und teilen Sie die Zellen in einen 200-Mikroliter-Aliquot pro Mikrozentrifugenrohr pro Rekrutierungstest auf. Dann legen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vor ihrer Injektion in die Strömungskammer. Um das Fluidsystem für die Analyse vorzubereiten, legen Sie zunächst einen männlichen Luer-Stecker in ein Ende eines 8 cm langen 3 mm dicken Stücks Silikonschläuche ein und verbinden das andere Ende mit einem Inline-Luer-Injektionsset.

Dann verbinden Sie den Luer-Stecker an einem Ende eines 40 cm langen 3 mm dicken Stück Silikonrohres. Als nächstes die 20 mm Spritze an ein Ende eines 1 m langen 3 mm dicken Stück Silikonschlauchs und legen Sie einen männlichen Luer-Stecker an das andere Ende. Dann legen Sie beide männlichen Luer-Steckverbinder in eine weibliche Luer-Lock-Kupplung und legen Sie das freie Ende der Silikonschläuche in ein Reservoir von 37 Grad Celsius M199 Medium ergänzt mit 0.5%BSA.

Ziehen Sie den Kolben ein, um den Schlauch mit einem Durchflusspuffer zu füllen, und sichern Sie die Spritze an der Spritzenpumpe. Stellen Sie dann die Pumpe in den Rückzugsmodus ein und geben Sie den Durchfluss an. Um die Schiebekammer zu verbinden, klemmen Sie die Silikonschläuche um den weiblichen Luer-Lock-Koppler und trennen Sie die beiden Luer-Stecker-Männchen von der Kupplung, damit sie mit dem Reservoir des Schlittens verbunden werden können.

Luftblasen stören nicht nur die Bildqualität, sondern induzieren auch Kapillarstress in den Zellen, was zum Zelltod führt. Um Luftblasen zu vermeiden, bestätigen Sie die korrekte Klemmung des Schlauches, bevor Sie den Luer in das Reservoir einsetzen. Entfernen Sie dann die Klemmen, um zu bestätigen, dass die Verbindung nicht undicht ist, und stellen Sie den Schlitten unter das Mikroskop.

Zur Abbildung der Monozytenrekrutierung unter Fluss, fügen Sie 5 Mikroliter Mehleszenz konjugiert Anti CD16 Antikörper und einen geeigneten Kernfarbstoff zu jedem Aliquoted Monozyten für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und sammeln die Zellen mit einer kurzen Zentrifugation. Das Pellet in 250 Mikroliter Durchflusspuffer aussetzen und die Spritzenpumpe starten. Fügen Sie 30 Mikroliter einer Monozytensuspension in eine Kammer des Dias und wählen Sie das 40X Objektiv auf dem konfokalen Mikroskop.

Aktivieren Sie die entsprechenden Fluoreszenzlaser und verwenden Sie die Kammer mit der beschrifteten Monozyten, um die Erfassungsparameter des konfokalen Mikroskops Next einzustellen, wählen Sie drei Sichtfelder innerhalb eines halben Zentimeterradius für die konfokale Bildgebung mit mehreren Positionen aus und legen Sie einen Z-Stack auf den Bereich von 10 bis 12 Mikrometern und die Zeitraffererfassung alle eine Minute fest. Nach drei Minuten Der Bildgebung injizieren Sie 200 Mikroliter Monozyten durch den Inline-Luer-Injektionsport und beginnen Sie mit der Bildgebung der zellulären Interaktion. Stoppen Sie nach mindestens 30 Minuten die Bildgebung und den Durchfluss und klemmen Sie die Schläuche, damit sie vom Schlitten getrennt werden können.

Um die Transmigrationsrate der Zellen über die stimulierten HUVECs zu bestimmen, öffnen Sie Bild J und zählen Sie die Gesamtzahl der anhaftenden Monozyten in jedem Feld, um die Zellzahl pro Quadratmillimeter zu bestimmen. Zählen Sie dann die Anzahl der transmigrierten Monozyten, die in der Basalebene unter den Endothelzellen vorhanden sind, die durch das Vorhandensein einer Schwarzen Lochzone um den Kern identifiziert werden. Eine einfache Möglichkeit, den Aktivierungsstatus der HUVECs nach der Stimulation zu überprüfen, ist die Visualisierung ihrer Dehnung unter Entzündungsstress.

Die konfokale Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der Monozyten auf der apikalen Ebene, auf der deren Phänotyp beurteilt werden kann. Migrierende Zellen, die sich einer Transmigration unterziehen, bewegen sich zum interzellulären Zell-zu-Zell-Knoten, bevor sie von der apikalen Ebene verschwinden und in der Basalebene wieder auftauchen. Die Quantifizierung der Monozytenrekrutierung im Laufe der Zeit bestätigt, dass auf die Monozytenadhäsion eine Transmigration folgt.

Die Transmigrationsrate von CD16-positiver Monozyten ist niedrig, wenn die Endothelzelle nur mit TNF alpha stimuliert wird, erhöht sich aber, wenn die Endothelzellen sowohl mit TNF alpha als auch mit vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor oder VEGFA stimuliert werden. DIE HUVEC-Stimulation mit TNF alpha und TNF alpha plus VEGFA induziert eine Erhöhung der Adhärenz mit CD14-negativen T-, B- und NK-Zellen, verglichen mit CD14-positiven Monozyten. Darüber hinaus induziert die HUVEC-Stimulation nur eine Transmigration der Monozytenpopulation, da T-, B- und NK-Zellen weder unter TNF-Alpha- noch Untertanen-Alpha- oder TNF-Alpha- plus VEGFA-Stimulierenüberkieferbedingungen umwandern.

Um einen optimalen Monozyten-Rekrutierungstest durchzuführen, ist es wichtig, dass Sie Ihr Experiment im Voraus planen und es am selben Tag tun. Und wenn Sie die Zellen reinigen, stellen Sie sicher, dass Ihr Mikroskop bei 37 Grad ist, damit Sie die Zellen während des Experiments nicht auf eine andere Temperatur übertragen. Um dieses Verfahren zu lernen, können alle Methoden wie die Profilierung von HUVEC-Zytokin- und Chemokin-Expression sowie Chemotaxis-Studien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den molekularen Mechanismus zu beantworten, die die Transmigration und Adhäsion einer bestimmten Monozytenpopulation aufrecht erhalten.