Name: Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Lernen Sie eine In-vivo-Methode zur Untersuchung der Blut-Hoden-Schranke bei männlichen C57Black/6-Mäusen mit Inulin-FITC-Injektion. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse genetischer und toxikologischer Einflüsse auf die Fruchtbarkeit.

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Diese Arbeit wurde von der nationalen Schlüssel R & D Program of China (2016YFA0500902), der National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), der Jiangsu Science Foundation Distinguished jungen Gelehrten (BK20150047), die Naturwissenschaft unterstützt. Gründung der Provinz Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) und dem innovativen und unternehmerischen Programm der Provinz Jiangsu, K.Z

Alle durchgeführten Tierversuche wurden von der Nanjing Medical University-Ausschuss genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäusen wurden unter kontrollierter Photoperiode Bedingungen gehalten und waren mit Nahrung und Wasser versorgt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>
Mikroinjektion Kapillaren
	<ol>
<li>Verwenden Sie Mikroinjektion Kapillaren bzw. mit einem Außendurchmesser, innere Dimeter und Länge von 1,0 mm, 0,8 mm und 10,0 cm.</li>
		<li>Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Kapillar Abzieher (Abbildung 1A). Testen Sie und passen Sie die Einstellungen abhängig von der Kapillare Puller-Maschine, die verwendet wird.</li>
		<li>Brechen Sie die Pipettenspitzen mit der Pinzette verwenden, um die Kapillaren mit einem 50 µm Durchmesser an der Spitze zu erhalten. Hinweis: Die Tipps möglicherweise zu lang, um den Hoden zu durchdringen.</li>
		<li>Schärfen Sie die Spitze in einem 30°-Winkel mithilfe einer Mikropipette Beyeler (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenzien
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 % Pentobarbital-Natrium: Natrium Pentobarbital 100 mg in 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Schritt 2.3.3) auflösen.</li>
		<li>10 mg/mL Inulin-FITC vorbereiten: Auflösen von Inulin-FITC 1 mg in 100 μl PBS (Schritt 2.1.6).</li>
		<li>Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd: Auflösen von Paraformaldehyd (PFA) 4 g in 100 mL PBS (Schritt 2.3.3).</li>
		<li>30 % Saccharose vorbereiten: Saccharose 3 g in 10 mL PBS (Schritt 2.3.4) auflösen.</li>
		<li>0,1 % Cadmium Chlorid vorbereiten: Auflösen von Cadmium Chlorid 10 mg in 10 mL PBS (Schritt 2.1.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Methoden
<ol><li>
Anästhesie und Presurgery Vorbereitung
	<ol>
<li>8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von CdCl2zu berechnen. Eine Gruppe von Mäusen zu behandeln (n = 3) mit CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) für 3-d vor der Operation. Eine weitere Gruppe von 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse zu behandeln (n = 3) mit PBS als Kontrolle.</li>
		<li>Führen Sie Operation unter aseptischen Bedingungen mithilfe sterile Spritze, Nadel, Schere und Zange aus.</li>
		<li>Anästhesie Arbeitslösung frisch zubereiten. Die erforderliche Dosis von Anästhesie ist 70 mg Pentobarbital-Natrium/kg Körpergewicht. Im Durchschnitt wiegt ein Erwachsener C57BL/6 Mäuse im Alter von 8 Wochen ~ 25 g, das entspricht 175 μL der 1 %-Pentobarbital-Natrium (1,75 mg / Maus). Hinweis: Das Natrium Pentobarbital wird in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst. Die Lösung wird filtriert von 0,22 Umm Filtereinheit vor der Verwendung.</li>
		<li>Reinigen Sie den Bereich für die Chirurgie mit 75 % Ethanol und die Fläche mit einem sauberen Tuch Handtuch.</li>
		<li>Schalten Sie den Thermostat Heizung und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Inulin-FITC funktionierende Lösung (10 mg/mL) am Tag der Operation vorzubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgischer Eingriff
	<ol>
<li>8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von Anästhesie zu berechnen.</li>
		<li>Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium mit der 1-mL sterile Spritze. Halten Sie die Maustaste in einem sauberen Käfig.</li>
		<li>Beachten Sie die reflex Reaktion des Auges und Atemmuster der Maus zu bestätigen, dass es komplette Narkose ist. Hinweis: In der Regel 10-15 min sind nötig, bis die Maus mit einen völligen Mangel an Zehe Prise Reaktion und Wartung von langsamen, stetigen Atmung tief betäubt ist.</li>
		<li>Bewegen Sie die Maus auf das OP-Feld und decken Sie ihre Augenpartie mit einem feuchten Papiertuch zu Trockenheit während der Narkose (Abbildung 2A) zu vermeiden.</li>
		<li>Rasieren Sie seinen Bauch Haare mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 75 % Ethanol.</li>
		<li>Machen Sie mit einer scharfen Schere einen Hautschnitt von 1 cm oberhalb der Präputial Drüsen, die Bauchdecke verfügbar zu machen. Heben der Bauchdecke mit kleinen Zangen und einem 0,5 cm Einschnitt, der Bauchhöhle (Abb. 2 b) verfügbar zu machen.</li>
		<li>Verwenden Sie Zange zur Fettpolster um die Nebenhoden und Hoden Suche. Ziehen Sie vorsichtig die Fettpolster heraus, um den beigefügten Hoden deutlich verfügbar zu machen (Abbildung 2 und 2D). In der Regel auf einem Hoden gleichzeitig betreiben. Hinweis: Berühren Sie die Fettpolster und Hoden mit Händen.</li>
		<li>Legen Sie eine Papier (9 cm Durchmesser) unter dem Fettpolster und Hoden (Abbildung 2).</li>
		<li>Injizieren Sie Inulin-FITC in einer Mikroinjektion Pipette und schließen Sie es an das defekte Gerät (Abbildung 1). Sanft legen Sie die Mikroinjektion Pipette unter der Tunica Albuginea und laden Sie insgesamt 20 μL der Inulin-FITC in das Interstitium der Hoden (Abb. 2E und 2F). Hinweis: Drücken Sie vorsichtig die Mikroinjektion Pipette, um zu vermeiden, wenn Sie ihn bewegen.</li>
		<li>Überwachen Sie die Bewegung der Inulin-FITC in den Hoden (Abbildung 2).</li>
		<li>Sofort setzen Sie die Hoden wieder in die Bauchhöhle nach Abschluss der Injektion.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Diese Hoden wird mit 20 μl PBS als Steuerelement injiziert.</li>
		<li>Schließen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht und bewegen Sie die Maus auf einem Wärmekissen eines thermostatischen Heizung (Abbildung 1 b). Verabreichen Sie eine Dosis von 1 mg Analgetikum (Buprenorphin) pro 1 kg Körpergewicht durch subkutane Injektion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ernte der Hoden und Gefrierschnitte Vorbereitung
	<ol>
<li>40 min nach der Injektion die Empfänger Maus durch zervikale Dislokation nach Tierbetreuung einschläfern und Richtlinien.</li>
		<li>Verwenden Sie ein paar der scharfen Schere um die Hoden zu sammeln. Legen Sie die Hoden in 1 mL eiskaltem PBS, Verunreinigungen Blut zu entfernen.</li>
		<li>Beheben den Hoden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C für 12-24 h. verwerfen die 4 % PFA und waschen das Gewebe 3 X mit 1,5 mL 1 % PBS bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Das Gewebe in 30 % Saccharose über Nacht austrocknen. Den Hoden in der einbettenden Rahmen und bedecken Sie das Gewebe mit optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte (OCT). Nachdem das Office-Anpassungstool gesperrt ist, OCT füllen Sie einbetten Frame ein, so dass der ganze Hoden mit OCT abgedeckt werden kann.</li>
		<li>Schnitt 5 μm Dicke, gefrorene Querschnitte der Hoden in einem Kryostaten bei-20 ° C und lassen sie die Objektträger einhalten. Hinweis: Reinigungserinnerung eingebetteten Gewebe in Trockeneis erhöht die Steifigkeit zum Schneiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bild-Suchauftrag
	<ol>
<li>Legen Sie die Folien in einer befeuchteten Box. Die Folien bei Raumtemperatur für 10 min warm.</li>
		<li>Waschen Sie die Abschnitte 3 X mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bei Raumtemperatur.</li>
		<li>An der Luft trocknen Sie für 5 min in der Dunkelheit. Wischen Sie alle verbleibenden TBS mit staubfreien Papier.</li>
		<li>Decken Sie die Querschnitte mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Ort der invertierten Deckglas auf einen Objektträger.</li>
		<li>Abrufen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop. Insgesamt 20 X Vergrößerung ist in der Regel ausreichend für die Erkennung der hell Fluoreszenzsignal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
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<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
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<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Spermatogenese findet in seminiferous Epithel und ist ein hoch geordneten und dynamischen Prozess, die Keimzellen und somatischen Zellen unterliegt (z. B. Sertoli-Zellen)13. Die BTB-Struktur, die durch die Sertoli-Zellen aufgebaut ist, teilt die seminiferous Epithel in eine basale und eine apikale Fach. Die Entwicklung der meiotischen und haploiden Keimzellen erfolgt in der apikalen Fach bildet eine immunologische Barriere14.
Di...

Säugetier-Spermatogenese wird einen sehr strukturierten Prozess betrachtet, der spermatogonial Selbsterneuerung und Differenzierung durch Spermatozyten in haploide Spermien über Mitose und Meiose Spermiogenesis, während die dramatischen umfasst biochemische und morphologische Veränderungen auftreten. Entwickelnden Keimzellen werden schrittweise von der Basis von seminiferous Röhrchen in Richtung Lumen transportiert. Dieser Prozess wird durch Zell-Zell-Kontakte zwischen den Keimzellen und Sertoli-Zellen1,2geregelt. Benachbarte Sertoli-Zellen bilden die BTB, die nahe der Unterseite von seminiferous Röhrchen befindet. Die BTB teilt physisch das Epithel in eine basale und ein Adluminal Fach. In Phasen VIII - IX des Kreislaufs epithelialen migrieren Preleptotene/Leptotän Spermatozyten aus der basalen Fächer auf der BTB, Eingabe der Adluminal Fächer3. Daher soll die Funktion der BTB eine Immunabwehr Mikroumgebung für den Abschluss der Meiose und Spermiogenesis4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Gewebeprobe Barrieren (z.B., Blut - Hirn-Schranke), die nur von tight Junctions (TJs) bestehen, bildet die BTB vier verschiedene Kreuzungen (TJs ectoplasmic Spezialisierungen, Gap Junctions und Intermediate Filament-basierte Desmosomes) zwischen den Sertoli-Zellen1,7.
Viele Studien haben genetisch veränderte Mäuse, Virus-Infektionen und Umweltgifte verwendet, um die Mechanismen von BTB Integrität7,8,9zu untersuchen. Die BTB-Störung induziert eingeschränkter Spermatogenese und Subfertilität oder Unfruchtbarkeit. Da die BTB Bildung und Integrität bestätigt wurden Kontakte zwischen den Sertoli-Zellen8betroffen zu sein, hat eine in-vitro- Modell basierend auf Primärkultur von isolierten Sertoli-Zellen verwendet worden für BTB-Studie. Dieses Modell kann nicht jedoch genau BTB Dynamik in Vivoimitieren. Darüber hinaus wurde keine solche Kokulturen von Keimzellen mit Sertoli-Zellen in der Lage, alle relevante strukturelle und funktionelle Komponenten der BTB10,11reflektieren gegründet.
Im Allgemeinen basieren in der Regel in Vivo BTB Integrität Assays auf kleinen Molekülen, wie EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin und FITC konjugiert Inulin (Inulin-FITC). Normalerweise wird die Diffusion von Biotin oder Inulin-FITC aus dem basalen Fach von BTB Struktur blockiert. Daher sind wir in der Lage, diese Methode zu verwenden, um zu prüfen, inwieweit der BTB Schaden im Vergleich zu Kontrollgruppen. Während bestimmte Reize, wie Behandlung mit Cadmium Chlorid (CdCl2)12, BTB kompromittiert werden kann wird BTB für kleine Moleküle, die schließlich das Adluminal Fach als Indikatoren geben Sie zugänglich.
Ein frühe in Vivo BTB Integrität Assay wird Biotin oder Inulin-FITC in die Halsschlagader, die Chirurgie umfasst, und ist invasiv, kompliziert und zeitaufwändig. Außerdem, wie Reporter Stoffe durch den ganzen Körper über den Blutkreislauf diffundieren, beschränkt sich die lokale Konzentration von Biotin oder Inulin-FITC in seminiferous Röhrchen. Darüber hinaus kann systemische Exposition Immunreaktionen auslösen. Hier präsentieren wir Ihnen einen einfache und effektive in Vivo BTB Integrität Assay ermöglicht direkten Einspritzung von einer kleinen aliquoten Inulin-FITC in das Interstitium ein Hoden. Die fluoreszierenden Kennzeichnung Methode verwenden, ist die Färbung Prozess praktisch, da sekundäre Antikörper nicht erforderlich sind. Hier wird der Prozess der Fluoreszenzfarbstoff Eintritt in den Hoden visualisiert.

<table><tbody><tr><td>Kapillar-Abzieher&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (USA)</td><td>SH30258,01</td><td>Verdünnung auf 1&faches in ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>CITOGLAS (China)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Cadmiumchlorid</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss (Deutschland)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Staubfreies Papier</td><td>Kimberly-Clark (USA)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma (USA)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionskapillaren</td><td>Zhengtianyi (China)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm &fach; 0,8 mm&nbsp; &times 100 mm</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Anfasmaschine</td><td>NARISHIGE (JAPAN)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPAN)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma (USA)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium</td><td>Merck (Deutschland)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer&nbsp;</td><td>Yashen (China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon (JAPAN)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td>Stronger (China)</td><td></td><td>Schere, Pinzette, Nadelhalter</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>KDL (China)</td><td>20163150518</td><td>0,45 mm & mal 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>Thermostatheizung</td><td>KELL (Nanjing, China)</td><td>KEL-2010<</td><td></td></tr><tr><td>stark>10x TBS, pH 7,6</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 Mio. Tris</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 Mio. Nacl</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

eine in-vivo -methode, um die maus blut-hoden-schranke integrität zu studieren

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenese ist die Entwicklung von Spermatogonien zu reifen Spermien in den seminiferous Röhrchen der Hoden. Dieser Prozess wird von Sertoli Zelle Kreuzungen an der Blut-Hoden-Schranke (BTB), unterstützt die engste Gewebe-Barriere im Säugetier-Körper und trennt die seminiferous Epithel in zwei Kammern, eine basale und eine Adluminal. Die BTB schafft eine einzigartige Mikroumgebung für Keimzellen in Meiose ich / II und für die Entwicklung der postmeiotic Spermatids in Spermien über Spermiogenesis. Hier beschreiben wir eine zuverlässige Assays zur Überwachung der BTB Integrität der Maus Hoden in Vivo. Eine intakte BTB blockiert die Diffusion der FITC konjugiert Inulin aus der basalen zum apikalen Fach von seminiferous Röhrchen. Diese Technik eignet sich für das Studium gen Kandidaten, Viren oder Umweltgifte, die BTB Funktion oder Integrität, ein einfaches Verfahren und eine minimale Anforderung von chirurgischen Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Methoden beeinflussen können.

Der Versuchsaufbau für die Durchführung der BTB-Integrität-Assay ist in Abbildung 1dargestellt. Ziehen und Mikroinjektion Kapillaren mit einer Kapillare Puller und Mikropipette Beyeler, bzw. zu schärfen (Abb. 1A und 1 C). Der Thermostat Heizung und Ausrüstung für die Mikroinjektion sind in Abbildung 1 b und 1Ddargestellt.
<p class="jove_content" fo:keep-together....

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität durch Einspritzen von Inulin-FITC in Hoden zu beurteilen. Dies ist eine effiziente in Vivo -Methode, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren, die durch genetische und umweltbedingte Elemente beeinträchtigt werden kann.

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Bluttestis-Barriere von Biologie-Feldern über Genkandidaten, Viren oder Umweltgifte zu beantworten, die die Funktion oder Integrität der Bluttestis-Barriere beeinträchtigen können. Behandeln Sie drei Tage vor der Operation täglich mindestens drei acht Wochen alte C57Black/6 männliche Mäuse mit einem Cadmiumchlorid von fünf Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht mittels intraperitonealer Injektion. Legen Sie am Tag der Operation ein sauberes Gewebe über einen 75% Ethanol-sterilisierten Operationsbereich und stellen Sie eine thermostatische Heizung auf 37 Grad Celsius.Legen Sie eine anästhesierte Maus auf das Gewebe, dann bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifung. Rasieren Sie das Bauchhaar mit einem Rasierer und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 75% Ethanol. Machen Sie einen ein Zentimeter Hautschnitt über den Präputialdrüsen, um die Bauchwand zu belichten, und verwenden Sie kleine Zangen, um die Haut zu heben, um einen 0,5-Zentimeter-Schnitt im Peritoneum zu machen.Verwenden Sie die Zange, um nach Fettpolstern um die Epididymis und Hoden zu suchen, sorgfältig ziehen die Fettpolster heraus, um einen angebrachten Hoden zu entblößen. Legen Sie ein neun Zentimeter großes Stück Papier unter die Fettpolster und Hoden und laden Sie eine Mikroinjektionspipette mit frisch zubereiteter Inulin-FITC-Lösung. Schließen Sie die Pipette an eine Mikromanipulatoreinheit an, und verwenden Sie ein Sezieren von Mikroskop, um die Mikroinjektionspipettenspitze vorsichtig unter die Tunika albuginea einzufügen.Drehen Sie den Bedienhebel langsam, um 20 Mikroliter des Inulin-FITC in das Interstitium der Hoden zu liefern. Wenn die Lieferung erfolgreich ist, wird der Testis eine leuchtend grün-gelbe Farbe drehen. Kehren Sie den Hoden sofort in die Bauchhöhle zurück und injizieren Sie den kontralateralen Hoden mit 20 Mikroliter PBS, dann schließen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht.Und legen Sie die Maus auf das Heatpad einer thermostatischen Heizung. 40 Minuten nach der Injektion, verwenden scharfe Schere, um die Hoden von jeder Maus zu sammeln, und waschen Sie das Gewebe in einem Milliliter eiskalte PBS. Als nächstes fixieren Sie die Hoden in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden, gefolgt von drei Wäschen in 1,5 Millilitern von 1%PBS pro Wäsche.Nach 30%Saccharose-Dehydrierung über Nacht, übertragen Sie die Proben in einzelne Einbettrahmen und decken Sie das Gewebe mit optimaler Schnitttemperaturverbindung ab. Stellen Sie die Temperatur eines Kryostats auf negative 20 Grad Celsius ein und legen Sie die Rahmen für etwa 10 Minuten in den Kryostat, bis das OCT eingefroren ist. Füllen Sie dann jeden Einbettrahmen mit frischem OCT, bis der gesamte Hoden in jeder Form abgedeckt ist.Wenn die zweite Oct-Schicht eingefroren ist, erfassen Sie einen fünf Mikrometer dicken Querschnitt jedes Hodens, wobei die Gewebeabschnitte auf Glasmikroskop-Dias erfasst werden, sobald sie erhalten werden. Um die Proben abzubilden, wärmen Sie zuerst die Dias in einer befeuchteten Box bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias nach 10 Minuten dreimal in frischer Tris-gepufferter Saline pro Wäsche und lassen Sie die Abschnitte fünf Minuten lang lichtgeschützt trocknen.Verwenden Sie staubfreies Papier, um Restaline zu entfernen, und montieren Sie die Proben mit DAPI-ergänztem Montagemedium. Bedecken Sie dann jede Probe mit einem invertierten Abdeckzettel, und stellen Sie die Proben unter dem 20-fachen Objektiv eines konfokalen Mikroskops ab. Drei Tage Cadmiumchloridbehandlung verursacht Schäden an der Blut-Testis-Barriere, die eine Inulin-FITC-Diffusion vom Basalfach in das apikale Fach des Seminiferepithels ermöglichen.Im Gegensatz dazu wird diese Diffusion in kontroll-PBS-behandelten Hoden blockiert. Das Ausmaß der Bluttest-Barriereschäden wird durch Berechnung des Verhältnisses des Abstands der Inulin-FITC-Diffusion zum Radius desselben seminiferösen Tubuli bestimmt. Darüber hinaus blockiert die intakte Bluttestis-Barriere bei heterozygoten Rictor-Flocken-Knockout-Mäusen die Inulindiffusion über die Barriere in das apikale Fach, während bedingte Rictor-Knockout-Mäuse eine kompromittierte Bluttestis-Barriere besitzen, die eine Inulindiffusion ermöglicht.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, inulin-FITC am Tag des Experiments vorbereitet zu liefern und das Gewebe vor Licht zu schützen, da FITC ein lichtempfindliches Molekül ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der eingeschränkten Spermatogenese, da die Funktion der Bluttestis-Barriere darin besteht, eine immunprivilegierte Mikroumgebung für die Vollendung der Meiose bei der Spermatogenese zu schaffen. Nach seiner Entwicklung bietet diese Technik forschern auf dem Gebiet der Reproduktionsmedizin eine Möglichkeit, Subfertilität und Unfruchtbarkeit bei Mäusen zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyden extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Kleidungsstücken und Gesichtsmasken immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen...

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Im vorliegenden Protokoll wurde die endotheliale Barrierefunktion der submandibulären Drüse (SMG) durch Injektion verschiedener molekulargewichteter Fluoreszenztracer in die Winkelvenen von Versuchstiermodellen in vivo unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bewertet.

Im lebenden Organismus Nachweis der vaskulären Permeabilität in der submandibulären Drüse der Maus

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) vor, das es uns ermöglicht, altersbedingte Veränderungen im Glukosestoffwechsel zu beobachten, die auf ICSI zurückzuführen sind, und Einblicke in ihre potenziellen langfristigen Auswirkungen auf die menschliche Entwicklung zu geben.

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Lernen Sie eine In-vivo-Methode zur Untersuchung der Blut-Hoden-Schranke bei männlichen C57Black/6-Mäusen mit Inulin-FITC-Injektion. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse genetischer und toxikologischer Einflüsse auf die Fruchtbarkeit.

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

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