Name: Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Erfahren Sie eine zeitsparende Kryoschnittmethode für mehrere Nagetiergehirne zur Immunhistochemie. Diese Technik reduziert Färbungsvariabilität und verbessert die Konsistenz bei der Visualisierung anatomischer Strukturen.

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PCH Mission Fördermittel unterstützt die Forschung in diesem Manuskript berichtet. Die Autoren möchte Daniel Griffiths danken für die Aufnahme der Bilder, die in den Figuren verwendet.

Die Megabrain-Technik wurde optimiert, mit ganzen und Hemisected Gehirne von männlichen Erwachsenen C57Bl6 Mäuse5, juvenile Sprague-Dawley Ratten und Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten, die Transcardially durchströmt mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt waren von 4 % Paraformaldehyd6. Ähnliche Ergebnisse können in andere Stämme von Maus und Ratte, bei beiden Geschlechtern und in den verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Die Studie zur Datengenerierung für diese Handschrift juvenile Sprague-Dawley Ratten verwendet und wurde von der University of Arizona institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt, und Versuchstieren wurden für die Zuerkennung der Leitfaden für die Pflege und Nutzung des Labor betreut Tiere-7.
1. Cryoprotection der PERFUNDIERTEN Gehirne
<ol><li>Folgende erfolgreiche Transcardial Perfusion6, sammeln die vollständige Gehirn6,8 von Tieren und Post-zu beheben, indem man in ein 25 mL-Fläschchen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 24 h. Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige Gewebe Fixiermittel; mit Vorsicht handhaben. Übertragen von Paraformaldehyd in einen speziell gekennzeichneten Abfallbehälter, der seine Konzentration und Volumen innerhalb einer chemischen Dampfhaube identifiziert und dann laden in der Chemieabfall Kabinett bis Chemikaliensicherheit oder ordnungsgemäß entsorgt geschultes Personal.</li>
	<li>Nach 24 Stunden, in einer Dampfhaube verstrichen ist entfernen Sie Gehirne aus 4 % Paraformaldehyd mit einem Spachtel. Übertragen Sie das Gehirn in ein Fläschchen mit ca. 20 mL 15 % Saccharoselösung in 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bis Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 h sinkt).</li>
	<li>Im Anschluss daran übertragen Sie das Gehirn auf ein Fläschchen mit ca. 20 mL 30 % Saccharoselösung in 1 X TBS, bis das Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 – 48 h) sinkt.</li>
</ol>2. Gehirn Einfrieren
<ol><li>Legen Sie eine 500 mL-Becherglas auf einem Bett von Trockeneis in einem Eiskübel. Gießen Sie 300 – 400 mL Isopentane (2-Methyl-Butan) in das Becherglas.</li>
	<li>Können Sie die Temperatur des Isopentane-45 ° C bis-50 ° c erreichen Genau zu überwachen Sie und pflegen Sie dieses Temperaturbereichs mit einem Thermometer, Konstanthaltung während des Verfahrens. Sicherstellen Sie, dass die Temperaturwerte aus der Mitte der Lösung und nicht beim Berühren der unteren oder Seite des Bechers entnommen werden.</li>
	<li>Auf der Tischplatte, füllen ein Einweg Form einbetten (siehe Materialliste) ca. 1/2 voller optimale Arbeitstemperatur (Okt; siehe Tabelle of Materials) Compound. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen im Office-Anpassungstool gibt. Gibt es entfernen Luftblasen sie mit einem Spatel oder einer Nadel.</li>
	<li>
Entfernen Sie das erste Gehirn aus der Durchstechflasche von 30 % Saccharose mit einem Spatel. An dieser Stelle Einfrieren entweder Gehirne ganz oder Hemisect, je nach Design der Studie.
	<ol>
<li>Verwenden Sie um Hemisected Köpfe eine neue Rasierklinge um einen sauberen Schnitt durch das Gewebe, die Hemisphären zu trennen. Wenn nicht für die Untersuchung benötigt, entfernen Sie das Kleinhirn und der olfaktorischen Birnen in diesem Stadium. Wenn das Kleinhirn für die Untersuchung erforderlich ist, wird vorgeschlagen, um eine Ebene Fläche am hinteren Ende des Gehirns zugunsten des Gehirns im stehen direkt im Werkzeug zu schneiden. Wenn die Studie nur Gewebe aus einer lokalisierten Region erforderlich ist, kann eine Nagetier Gehirn Matrix verwendet werden, basierte auf bekannten Koordinaten Gehirn blockieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geben Sie einen numerischen Benennungssystem Gehirne. Zeichnen Sie ein Diagramm, wie in Abbildung 1dargestellt. Schreiben Sie die Nummer des ersten Gehirns platziert werden, in der Form von Megabrain in Position 2 Position 1 zu verlassen, als ein leerer Raum, in schnelle Identifizierung der Orientierung zu helfen, in dem die Gehirn eingefroren wurden.</li>
	<li>Mit stumpfen Zange oder Pinzette, Abholung des Gehirns auf Position 1 gestellt werden. Orientieren Sie das Gehirn mit der Seite geschnitten werden erste nach oben. Senken Sie das Gehirn in das Office-Anpassungstool an der entsprechenden Stelle mit der Pinzette um seine Position anzupassen, bis es selbstständig steht.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,5 für die restlichen Gehirn/Hemisphären in 3 – 10 Positionen eingefroren werden. Sollten Sie sich Gehirne/Hemisphären in eine symmetrische Anordnung.</li>
	<li>Überprüfen Sie alle 9 Gehirne in der Megabrain-Form. Sobald die Gehirn unabhängig, aufrecht und richtig herum im Office-Anpassungstool (siehe Abb. 2 b) stehen, die Form fügen Sie mehr OCT hinzu, (bis oben auf die Köpfe fallen). Wieder, sicherzustellen Sie, dass es keine sichtbaren Luftblasen im Office-Anpassungstool.</li>
	<li>Verwenden Sie die Zange um die Ecke des Werkzeugs, sicherzustellen, dass die Zange nicht im Office-Anpassungstool (Abbildung 3A) teilweise untergetaucht werden zu halten. Achten Sie darauf, die Schimmel-Niveau zu halten senken die Form in der Isopentane (-45 ° C bis-50 ° C) so dass unten der dritten Form ist untergetaucht. Halten Sie es hier Luftblasen im Office-Anpassungstool zu steigen an die Oberfläche und entfernt das Gewebe (Abb. 3 b) zu ermöglichen.</li>
	<li>Nach 30 s, unten die ganze Form in die Isopentane und Entlassung aus der Zange, verlassen die Megabrain unter für mindestens 3 min (Abbildung 3 Wasser). Stellen Sie sicher, dass Schimmel ist Ebene gehalten, damit die Gehirne bleiben aufrecht und äquidistanten (Abbildung 3D).</li>
	<li>Nach 3 min eingebettet Gebrauch der Zange zu entfernen den Schimmel mit dem gefrorenen, OCT Gehirne (Abbildung 3E) aus der Isopentane.</li>
	<li>Sofort, wickeln Sie die Form und den Inhalt in Alufolie und beschriften Sie sie mit der Tierzahlen oder Megabrain Identifikation. Berühren Sie die gefrorenen Megabrain so sparsam wie möglich zu vermeiden, Auftauen des Gewebes.</li>
	<li>Diese Megabrain kann jetzt in einem Gefrierschrank-20 ° C übertragen und dort gespeichert für ein Minimum von 24 h. Hinweis: Protokoll kann hier angehalten und die Megabrain kann gespeichert werden eingefroren, bis Kryoschneiden stattfindet.</li>
</ol>3. Vorbereiten der Megabrain-Schnitt auf der Kryostat
<ol><li>Legen Sie die schranktemperatur Kryostaten bis-19 ° C. Stellen Sie sicher, dass diese Temperatur erreicht ist, bevor Sie fortfahren. Schneiden, sicherstellen Sie, dass die schranktemperatur zwischen-18 ° C und-20 ° C bleibt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Megabrain aus dem Tiefkühler-20 ° C und legen Sie sie in den Kryostaten. Legen Sie auch ein Futter von den entsprechenden Abmessungen und zwei dünnen Spitzen Pinsel in Kryostaten. Lassen Sie die Megabrain und das Bohrfutter im Kryostaten für mindestens 15 Minuten auf die Temperatur des Kryostaten kommen.</li>
	<li>Kennzeichnen Sie Folien mit Megabrain-ID-Nummer und die Nummer der Folie entsprechend. Legen Sie die Folien auf einer Folie wärmer (35 – 45 ° C).</li>
	<li>Packen Sie die Megabrain aus der Alufolie. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um vertikal schneiden Sie die Ecken des Schimmels erlauben einfache Entfernung des Blocks Okt. aus der Form (Abb. 4A).</li>
	<li>Eine dünne Schicht (ca. 3 mm dick) Okt. auf das Futter zu verzichten.</li>
	<li>Platzieren Sie schnell, mit minimalen Kontakt zwischen Fingern und das Office-Anpassungstool, die Megabrain auf dem Futter in der gewünschten Ausrichtung. Große Zange können auch für diesen Schritt verwendet werden, um Auftauen zu minimieren. Vor Beginn der Abschnitt, verlassen die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool komplett gefrieren lassen.</li>
	<li>Sobald die Basisschicht Okt. eingefroren hat, gelten eine 2 mm dicke Schicht OCT um die Seiten des dem Megabrain und zulassen, dass dies von den Seiten auf das Spannfutter heruntergekommen. Dies sichert die Megabrain an das Futter. Wieder, bevor Sie fortfahren, verlassen Sie die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool zu frieren lassen.</li>
	<li>Jede überschüssige OCT von Seiten oder unten des Futters (Abbildung 4 b) entfernen Sie mit einer Rasierklinge.</li>
</ol>(4) Kryoschneiden die Megabrain
<ol><li>Bevor Sie beginnen, zu gewährleisten, dass ein Becher mit mindestens 20 mL 1 X PBS zugänglich ist.</li>
	<li>Positionieren Sie das Spannfutter montiert mit Megabrain, in der Futter-Kopf auf der Kryostat (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Festlegen der Kryostat schneiden auf die gewünschte Dicke. Die aktuelle Methode ist für 10 µm bis 50 µm Abschnitte optimiert worden.</li>
	<li>Schneiden Sie das Office-Anpassungstool und Gewebe wie notwendig, um die gewünschte Gehirnregion für Gewebe-Sammlung (Abbildung 4) zu erreichen.</li>
	<li>Wenn Sie bereit sind, Gewebe zu sammeln, senken Sie die Anti-Rolle-Platte ab, bis es auf der Bühne ruht und drehen Sie den Kryostaten Griff um einen Abschnitt zu nehmen. Heben Sie langsam die Anti-Roll-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die geschnittenen Megabrain nicht auf die Anti-Roll-Platte befestigt ist und nicht von der Bühne Abbildung 4 fällt).</li>
	<li>Verwenden Sie die Pinsel sanft Abschnitt Megabrain abrollen, bis sie flach auf der Kryostat-Bühne (Abbildung 5A) liegt. (Bei Bedarf halten Sie das Office-Anpassungstool flach mit dem Pinsel um Walzen zu verhindern).</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie von Folie wärmer und zeigen Sie die Folie, Label-Seite nach unten, über die Megabrain-Abschnitt auf der Bühne, so dass Abschnitt, um an der Folie kleben.</li>
	<li>Schnell geben Sie einen Tropfen von 1 X PBS zu jedem Gewebe-Abschnitt auf der Folie und lassen Sie sich nicht diese zu trocknen, bis sie flach gereinigt worden sind (siehe Schritt 4,9).</li>
	<li>Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel eingetaucht in 1 X PBS ausbürsten Bläschen im Gewebe und das Gewebe zu entfalten, so dass sie flach auf der Folie (Abbildung 5 b) liegt. Achten Sie darauf, nicht ändern Sie die Position der Gehirn-Abschnitte und verlieren dadurch die relative Position zu den anderen Abschnitten der Gewebe. Bearbeiten Sie das Gewebe mit Sorgfalt um Tränen zu vermeiden. Halten Sie Gehirn Bereiche Weg von den Rändern der Folie, wie peripheren Raum für ein Deckglas und PAP-Stift Anwendung in einigen Färbung Protokolle erforderlich ist.</li>
	<li>Legen Sie die Folie wieder auf der Folie, wärmeren und trockenen für 45 min. Abdeckung je nach Bedarf zu verhindern, dass Staub absetzen auf das Gewebe. Nach dem Trocknen, speichern Sie die Folien bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
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<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Während dieses Vorgangs zu berücksichtigen, dass die Temperatur der Megabrain und seine Umgebung ständig überwacht werden muss, um zu verhindern, Auftauen und wieder einfrieren des Gewebes. Das Gehirn kann nur aus dem Tiefkühler-20 ° C bis zu 3 mal als entfernt werden jedes Mal, wenn es berührt wird und Links in den Kryostaten mit wärmeren schwankende Temperaturen, das Gewebe auftaut und gefriert, wodurch eine Gelee wie Textur und krankhaftes Gewebe Integrität10. Daher ist es optimal, um die Megab...

Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für eine neuartige Methode, die wir Megabrain nennen, zu Cryosection mehrere Nagetier gleichzeitig für nachgeschaltete immunhistochemische Verfahren Gehirne entwickelt. Ein Megabrain ermöglicht die Herstellung der einzelnen Folien mit Gewebe aus mehreren Tieren. Diese Technik wurde optimiert, um koronalen Abschnitte aus 9 Erwachsene Ratte Hemisphären oder 5 Erwachsene voller Gehirne gleichzeitig geschnitten. Daher ist die Technik am ehesten zutreffenden in großen immunhistochemische Studien oder andere Analysen auf Schlitten montiert Hirngewebe aus einer großen Kohorte von Tieren gemacht.
Immunohistochemistry beinhaltet die Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen Proteine des Interesses zu verstehen und zu charakterisieren ihren Ausdruck und zelluläre Veränderungen in bestimmten Gewebe1,2,3. Die Verwendung von Immunohistochemistry ist in der neurowissenschaftlichen Forschung, unter anderen wissenschaftlichen Disziplinen, Beihilfe bei der zellulären und molekularen Verständnis des Gehirns4verbreitet. Groß angelegte Studien, an denen viele Tiere und Gehirn Abschnitte können Ressourcen- und zeitintensiv sein. Als solche gibt es eine vielfältige Beweggründe für die Entwicklung der Megabrain: Verkürzung verbrachte Kryoschneiden, Montage und Färbung Gewebe, wobei folglich weniger Reagenzien. Darüber hinaus die Möglichkeit, den Prozess zu optimieren und Flecken auf mehrere Köpfe in der gleichen Runde hilft, einige der Variabilität zwischen Chargen, eine Beschränkung von Immunohistochemistry3Färbung zu lindern. Darüber hinaus ein Megabrain-Schnitt ist eine zeitsparende Alternative zum Schneiden einzelne gefrorene Nager Gehirne und ermöglicht schnellen Vergleich der Gewebe zwischen Tieren oder sogar Behandlungsgruppen durch mikroskopiertechniken.

<table><tbody><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT Compound (12 Stück)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Einweg-Einbettungsformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand High Precision Straight Broad Broad Strong Point Pinzette/Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 mL HDPE Szintillationsfläschchen mit Polypropylen-Kappe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, Polyflasche 2,5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>Sowohl 15%ige als auch 30%ige Saccharosekonzentrationen müssen nachgebildet werden.</td></tr><tr><td>2-Methylbutan (zertifiziert), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Becher in hoher Form</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Allzweck-Flüssig-in-Glas-Teiltauchthermometer (-50 bis +50 &Grad; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Scoopula Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Rasierklinge</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Edge-Rite Mikrotomklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (1" frost) - weiß</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 10x, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Vor Gebrauch auf 1X verdünnen</td></tr><tr><td>15 Stück feine Pinsel Amazon</td><td></td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Chuck Das in Abbildung 4 gezeigte Futter wurde von einem Labortechniker maßgefertigt, es können jedoch ähnliche Größen von anderen Unternehmen kommerziell bestellt werden.</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

gleichzeitige kryoschneiden mehrere nagetier gehirne

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histologie und Immunhistochemie sind Routineverfahren der Analyse zu visualisieren mikroskopische Anatomie und Proteine in biologischen Geweben zu lokalisieren. In Neurowissenschaften, sowie eine Fülle von anderen wissenschaftlichen Bereichen sind diese Techniken verwendet. Immunohistochemistry kann auf Schlitten montiert Gewebe- oder frei schwebenden Abschnitte erfolgen. Probenvorbereitung von Folie montiert, ist eine zeitintensive Prozess. Das folgende Protokoll für eine Technik, genannt die Megabrain reduziert den Zeitaufwand für Cryosection und Mount Hirngewebe um bis zu 90 % durch die Kombination mehrerer Gehirne in einem gefrorenen Block. Darüber hinaus reduziert diese Technik Variabilität zwischen runden, in einer großen Studie histochemische Färbung gesehen. Die aktuelle Technik wurde optimiert für die Verwendung von Nagetier Hirngewebe in nachgeschalteten immunhistochemische Analysen; jedoch kann es zu verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen angewendet werden, die Kryoschneiden verwenden.

Eine positive Bilanz für diese Prozedur ist Gewebe, das liegt flach auf der Folie, ohne Bläschen oder Risse in der Ausrichtung, in der sie eingefroren waren. Gewebeschnitte werden gleichmäßig verteilt auseinander und leicht erkennbar durch gute Platzierung des Gehirns im Office-Anpassungstool und gute Schreibweise wie in Abbildung 1dargestellt. Vorausgesetzt, dass das Hirngewebe von Tieren in einem ähnlichen Alter gesammelt wurde, und das Gewebe wurde im Offi...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.

Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Diese zeitsparende Methode reduziert die Variabilität zwischen den Runden immunhistochemischer Verfahren in neurowissenschaftlichen Studien, um die Visualisierung von Anatomie und lokalen Proteinen und Geweben zu optimieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die Zeit reduziert, die für die Kryosektion und die Aufnahme von Hirngewebe erforderlich ist, indem mehrere Gehirne zu einem einzigen gefrorenen Block kombiniert werden. Während diese Technik für koronare Abschnitte von Nagetiergehirnen optimiert ist, kann sie an sagittale oder transversale Abschnitte oder verschiedene Arten von Geweben wie Muskel oder Leber angepasst werden.Nach erfolgreicher transkardialer Perfusion, post-fix die Gehirne von den Tieren in einer 25 Milliliter Durchstechflasche von 4%Paraformaldehyd in PBS für 24 Stunden. Danach verwenden Sie stumpf gekippte Zangen, um das Gehirn aus dem Paraformaldehyd zu entfernen. Übertragen Sie das Gehirn in eine Durchstechflasche mit ca. 20 Millilitern 30%Saccharoselösung in TBS.Halten Sie das Gehirn und die Lösung, bis sie auf den Boden der Durchstechflasche sinken. Als nächstes legen Sie einen 500 Milliliter Glasbecher auf ein Trockeneisbett in einen Eiskübel. Dann 300 bis 400 Milliliter Isopentan in den Becher gießen.Bewahren Sie das Isopentan zwischen negativen 45 und negativen 50 Grad Celsius. Füllen Sie auf der Bankplatte eine Einweg-Einbettform etwa halb voll mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung. Verwenden Sie eine Nadel, um Luftblasen aus der Form zu entfernen.Verwenden Sie die stumpf gekippten Zangen, um das erste Gehirn aus der Saccharoselösung zu entfernen. Verwenden Sie dann eine neue Rasierklinge, um das Kleinhirn und die Olfaktor-Lampen zu entfernen, bevor Sie die Hemisphären trennen. Geben Sie als Nächstes dem Gehirn ein numerisches Benennungssystem.Verwenden Sie stumpfe Zange, nehmen Sie das Gehirn in Position zwei platziert werden, und orientieren Sie es mit der Seite zuerst nach oben geschnitten werden. Senken Sie das Gehirn in das OCT und verwenden Sie die Pinzette, um ihre Position anzupassen, bis sie unabhängig steht. Eine wichtige Änderung dieser Technik ist der Leerraum in Position eins.Dieser Raum ist so vorgesehen, dass die Megahirnausrichtung leicht identifiziert werden kann und somit das mit jedem Gehirn verbundene Tier identifiziert werden kann. Nachdem alle Gehirne in der Form positioniert wurden, fügen Sie genügend OCT, um die Oberseiten des Gehirns zu decken, dann verwenden Sie eine Nadel, um alle Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Ecke der Form mit Zangen, um sicherzustellen, dass die Zange nicht teilweise in das OCT eingetaucht wird.Dann senken Sie die Form in das Isopentan, so dass das untere Drittel der Form untergetaucht ist. Nach 30 Sekunden die gesamte Form in das Isopentan senken und aus der Zange lösen. Nach drei Minuten verwenden Sie die Zange, um die Form aus dem Isopentan zu entfernen.Die Form und ihren Inhalt sofort in Aluminiumfolie wickeln und entsprechend beschriften. Übertragen Sie das Megabrain für mindestens 24 Stunden in einen negativen 20 Grad Celsius Gefrierschrank. Stellen Sie zunächst die Temperatur des Kryostatschranks auf negative 19 Grad Celsius ein.Entfernen Sie das Megabrain aus dem Gefrierschrank und legen Sie es in den Kryostat. Dann legen Sie ein Futter und zwei dünne gekippte Pinsel in den Kryostat. Danach beschriften Sie die Dias mit der Megabrain-Identifikationsnummer und der Dianummer und legen sie auf den Diawärmer.Als nächstes, auspacken Sie das Megabrain und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Ecken der Form zu schneiden. Geben Sie eine dünne Oct-Schicht auf das Futter. Dann legen Sie das Megabrain schnell auf das Futter.Nachdem das OCT vollständig eingefroren ist, eine zwei Millimeter schichtoct um die Seiten des Megahirns auftragen und die Seiten auf das Futter herunterlaufen lassen. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges OCT von den Seiten und der Unterseite des Futters zu entfernen. Positionieren Sie zunächst das mit dem Megabrain montierte Futter auf dem Futterkopf des Kryostats.Stellen Sie dann den Kryostat auf die gewünschte Dicke ein. Trimmen Sie das OCT und das Gewebe nach Bedarf, um die gewünschte Hirnregion für die Gewebesammlung zu erreichen. Dann senken Sie die Anti-Roll-Platte, bis sie auf der Bühne ruht und drehen Sie den Kryostatgriff, um einen einzigen Abschnitt zu nehmen.Heben Sie langsam die Anti-Roll-Platte ab, wobei Sie darauf achten, dass der Gewebeabschnitt nicht berührt wird. Verwenden Sie die Pinsel vorsichtig, um den Gewebeabschnitt zu entrollen, bis er flach liegt. Halten Sie bei Bedarf das OCT mit den Pinseln flach, um das Rollen zu verhindern.Entfernen Sie dann die Folie aus dem Schiebewärmer und bewegen Sie die Folienbeschriftung über den Megabrain-Abschnitt und lassen Sie sie an der Folie kleben. Wenden Sie schnell einen Tropfen PBS auf den Gewebeabschnitt an. Mit einem fein gekippten Pinsel in PBS getaucht, bürsten Sie alle Blasen im Gewebebereich und entfalten Sie das Gewebe, so dass es flach auf der Folie liegt.Schließlich legen Sie die Rutsche auf die Rutsche wärmer, um für 45 Minuten trocknen und speichern Sie die Rutsche bei negativen 80 Grad Celsius. In diesem Protokoll wurde Hirngewebe von neun Tieren gleichzeitig vorbereitet und kryosectioniert. Nach dem Kryosektionen kann die H&E-Färbung durchgeführt werden, um die Kryoschutzqualität zu bewerten.Repräsentative Ergebnisse des ionisierten Kalziumbindungsadaptermoleküls einoder Iba1 Färbung von Mikroglia zeigen konsistente Färbung zwischen jedem Studienhirn auf einem einzigen Megahirn. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ständig die Temperatur zu überwachen, während das Megabrain einfriert, um Risse oder Auftauen zu verhindern und dann das Gewebe wieder einzufrieren, was zu einer abnormalen Gewebeintegrität führt. Es wird nicht empfohlen, verschiedene Behandlungsgruppen in separaten Megahirnen zu trennen, da dies Varianz zwischen Gruppen während der Färbung erzeugen und Voreingenommenheit und Subjektivität während der Bildgebung und Analyse reduzieren kann.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von PBE und das Arbeiten in einer Kapuze sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Dieses Video zeigt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung von gefrorenen Hirngewebeschnitten von Mäusen für nachgelagerte Analysen.

Aufbereitung eines Mausgehirns für die nachgelagerte Analyse

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

Wir präsentieren ein praktisches, schrittweises, schnelles Protokoll für die Entfernung und Dissektion diskreter Regionen aus frischem Hirngewebe von Mäusen. Die Gewinnung von Hirnregionen für molekulare Analysen ist in vielen neurowissenschaftlichen Laboren zur Routine geworden. Diese Gehirnregionen werden sofort eingefroren, um qualitativ hochwertige transkriptomische Daten für die Analyse auf Systemebene zu erhalten.

Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine standardisierte Resektion von Hirntumoren bei Nagetieren durch einen minimalinvasiven Ansatz mit einem integrierten Gewebekonservierungssystem. Diese Technik hat Auswirkungen auf die genaue Widerspiegelung des Pflegestandards in Nagetier- und anderen Tiermodellen.

Implementierung einer minimalinvasiven Hirntumorresektion bei Nagetieren zur hochrentablen Gewebeentnahme

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.

Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Moderne Neurowissenschaften müssen Unterschiede zwischen vielen Arten erforschen, einschließlich Labornagetiere und Menschen. Dennoch entstehen technische Schwierigkeiten, wenn großhirnige Säugetiere beteiligt sind. Dieser Ansatz adressiert die interartische Variation neuronaler Populationen bei sehr unterschiedlichen Säugetieren und liefert vergleichbare Ergebnisse, die zur Aufdeckung evolutionärer Muster kartiert werden können.

Ein vergleichender Ansatz für quantitative Zellzählungsstudien in sehr unterschiedlichen Säugetierhirnen

Erfahren Sie eine zeitsparende Kryoschnittmethode für mehrere Nagetiergehirne zur Immunhistochemie. Diese Technik reduziert Färbungsvariabilität und verbessert die Konsistenz bei der Visualisierung anatomischer Strukturen.

Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

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