Methionin funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere für gezielte Plasmid-DNA-Lieferung
6. August 2019
Diese Arbeit stellt die Herstellung von Methionin funktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymeren (mBG) über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Verfahren (RAFT) vor. Die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz wurden ebenfalls untersucht. Die RAFT-Methode ist sehr vorteilhaft für die Polymerisation von Monomeren, die spezielle funktionelle Gruppen enthalten.
Kationische Polymer-Wirkstoffträger haben die Vorteile einer guten Stabilität, geringen Immunogenität und einer einfachen Vorbereitung und Modifikation. Hier bieten wir eine schnelle und einfache Methode für seine Synthese. Reversible Addition-Fragmentierungs-Verkettungspolymerisationsmethode ist ein Verfahren, das zur Ausbeute von Blockpolymeren mit kontrolliertem Molekulargewicht und Struktur und tragender funktioneller Gruppen geeignet ist.
Diese Arzneimittelträger können gleichzeitig verschiedene Medikamente tragen, um die Zusammenarbeit Behandlung von Krebs, Entzündungen und anderen Krankheiten zu erreichen. Die IFT-Polymerisation ist eine klassische Methode, und dieses Protokoll gibt ein Beispiel für seine Anwendung in der Gentherapie. Der Schlüssel zum Erfolg für die Synthese dieses Polymers ist die präzise Steuerung der Reaktionstemperatur.
Es ist ratsamer, ein Ölbad als ein Wasserbad zu verwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie einen rund-Boden-Kolben mit einem Gummistopfen und einem Magnetischen Rührer, der als Polymerisationsflasche verwendet werden soll. 1,87 Gramm Bis-Hydroxy-HEMA in einem Milliliter destilliertem Wasser in der Polymerisationsflasche auflösen.
In einem Fünf-Milliliter-Becher 0,03 Gramm CTP und 0,02 Gramm ACVA in 0,5 Milliliter 1, 4-Dioxan auflösen. Fügen Sie diese Mischung in die Polymerisationsflasche. Verwenden Sie dann eine Kondensatfalle, um die Lösung in der Polymerisationsflasche einzufrieren.
Befestigen Sie die Flasche an der Eisenstütze, und verwenden Sie einen mit einer Nadel ausgelösten Schlauch, um Stickstoff in das Reaktionsgemisch zu saugen und zu injizieren. Versiegeln Sie dann die Polymerisationsflasche und tauen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie diesen Freeze-Pump-Tau-Zyklus dreimal.
Danach die Flasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und die Lösung 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen. Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationsreaktion zu beenden. Als nächstes präcooles Aceton im Kühlschrank bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden und mischen Sie es mit der Reaktionslösung in der Polymerisationsflasche im Verhältnis 50 zu eins.
Zentrifugieren Sie diese Mischung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um das Aceton zu entfernen und den Niederschlag zu sammeln. Um das synthetisierte Poly-Bis-Hydroxy-HEMA zu reinigen, lösen Sie den gesammelten Niederschlag in zwei Milliliter reinem Wasser auf. Dann mischen Sie es mit 100 Milliliter vorgekühltem Aceton im Verhältnis eins zu 50.
Zentrifugieren Sie die Lösung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um den Niederschlag zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Reinigungsprozess des Lösens, Mischens und Zentrifugierens des Niederschlags dreimal. Lösen Sie zunächst 0,96 Gramm APMA und 0,93 Gramm des gereinigten Poly-Bis-Hydroxy-HEMA in fünf Milliliter destilliertem Wasser in einem 10-Milliliter-Becher.
0,01 Gramm ACVA in 0,5 Millilitern 1, 4-Dioxan auflösen und der APMA- und Poly-Bis-Hydroxy-HEMA-Lösung hinzufügen. Diese Mischung in eine Polymerisationsflasche geben und eine Stunde lang mit trockenem Stickstoff belüften. Dann die Polymerisationsflasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen.
Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationslösung zu beenden. Zunächst säen SIE MCF-7-Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Brunnen. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden.
Ersetzen Sie danach das Kulturmedium durch das frische Kulturmedium, das kationisches Polymer und pDNA-Polyplex-Polyplexe mit unterschiedlichem Verhältnis von Stickstoff-Phosphor-Verhältnissen enthält. Kultur die Zellen für sechs Stunden, und dann ersetzen Sie das Medium mit zwei Milliliter frische RPMI 1640 Medium. Fahren Sie mit der Kultivierung für 48 Stunden fort.
Sammeln Sie dann die Zellen, und verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die grüne Fluoreszenz zu erkennen. In dieser Studie werden Methionin-funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere über die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungsmethode hergestellt und die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz untersucht. Die durchschnittliche Partikelgröße und das Zeta-Potenzial von mBG/pDNA-Polyplexen betragen 124 Nanometer bzw. plus 15,7 Millivolt bei einem N-Zu-P-Verhältnis von 16.
Die elektrophoretische Retardierung zeigt, dass sich pDNA mit einem N-zu-P-Verhältnis von Null im Agarose-Gel ohne Einschränkungen bewegen kann und als Streifen im Gelbildr beobachtet wird. Wenn pDNA mit mBG komplexiert wird, wird die Bewegung von pDNA verzögert, und in der Folge wird die Helligkeit des Bandes reduziert. Dies zeigt, dass mBG die pDNA vollständig komplexisieren kann, wenn n bis P höher als vier ist.
Die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe wird dann mit dem Standard-MTT-Assay gemessen Diese Ergebnisse zeigen, dass mBG/pDNA-Polyplexe eine Zytotoxizität haben als PEI/pDNA-Polyplexe bei den N-zu-P-Verhältnissen von vier, acht, 16 und 32. Wie auch zu sehen ist, steigt die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe mit einem erhöhten N-zu-P-Verhältnis. Diese erhöhte Zytotoxizität ist ein Ergebnis der positiv geladenen GPMA-Komponente.
Das im pDNA-Transfektionsexperiment verwendete N-zu-P-Verhältnis wird entsprechend den Zytotoxizitätsergebnissen ausgewählt. Die Transfektionsfähigkeiten von mBG1, mBG2 und mBG3 werden durch Messung der GFP-Fluoreszenzintensität verglichen, und die Ergebnisse zeigten, dass mBG3 der optimale Genträger ist. Es ist wichtig, Luft aus dem Schlick-Rundbodenkolben abzuschöpfen und die Reaktionstemperatur aufrechtzuerhalten.
Die erhaltenen Polymer-Wirkstoffträger können auf die gleichzeitige Abgabe von Chemotherapie-Medikamenten und Genmedikamenten angewendet werden, um medikamentenresistenten Krebs synergistisch zu behandeln. Der molekulare Mechanismus der Kombination von Genmedikamenten und Chemotherapeutika kann für die Behandlung von medikamentenresistenten Tumoren weiter erforscht werden. Aceton wird wegen seiner akuten Toxizität als niedrig toxisch eingestuft.
Schlüssel, Einatmen oder Kontakt mit Augen oder Haut sollten vermieden werden. Vermeiden Sie das Risiko von Verbrühungen während des Heizvorgangs.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine schnelle und einfache Methode zur Synthese kationischer Polymer-Wirkstoffträger unter Verwendung des reversiblen Additions-Fragmentierungskettentransfers (RAFT) Polymerisationsverfahrens. Die synthetisierten methioninfunktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymere (mBG) wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Komplexierung von Plasmid-DNA und ihrer Transfektionseffizienz untersucht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsgebiet
- Polymerchemie
- Gentherapie
- Wirkstoffabgabesysteme
Hintergrund
- Kationische Polymer-Wirkstoffträger bieten Stabilität und geringe Immunogenität.
- RAFT-Polymerisation ermöglicht eine kontrollierte Molekülmasse und Struktur.
- Diese Träger können mehrere Medikamente für eine kombinierte Behandlung transportieren.
- Eine präzise Kontrolle der Reaktionstemperatur ist entscheidend für eine erfolgreiche Synthese.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Synthese biokompatibler Blockcopolymere zu entwickeln.
- Die DNA-Komplexierungsfähigkeit der synthetisierten Polymere zu untersuchen.
- Die Transfektionseffizienz der Wirkstoffträger zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Reversibles Additions-Fragmentierungskettentransfer (RAFT) Polymerisation.
- Synthese von methioninfunktionalisierten Blockcopolymeren.
- Bewertung der Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit.
- Bewertung der Transfektionseffizienz.
Hauptergebnisse
- Die synthetisierten mBG zeigten eine effektive Plasmid-DNA-Komplexierung.
- Die Transfektionseffizienz wurde erfolgreich bewertet.
- RAFT-Polymerisation erwies sich als vorteilhaft für die Synthese funktionalisierter Polymere.
- Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Abgabe mehrerer Medikamente.
Schlussfolgerungen
- Die Studie entwickelte erfolgreich eine Methode zur Synthese von mBG.
- Diese biokompatiblen Polymere zeigen vielversprechende Potenziale für Anwendungen in der Gentherapie.
- Weitere Forschung könnte ihre Wirksamkeit bei der Wirkstoffabgabe verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This work presents a RAFT polymerization-based method for synthesizing methionine-functionalized biocompatible block copolymers capable of complexing plasmid DNA, offering a tunable platform for gene delivery vector development. The ability to control molecular weight, charge ratio, and particle size enables predictive design of non-viral carriers with reduced cytotoxicity compared to PEI, supporting early-stage de-risking of nucleic acid therapeutics. Such systems address the need for scalable, reproducible polymer synthesis in preclinical discovery workflows where mechanistic clarity and formulation consistency impact go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-DNA interactions through quantifiable complexation at defined N/P ratios, supporting target validation via controlled gene delivery.
- Operational Value: Provides a reproducible synthesis route for cationic block copolymers with tunable methionine and guanidine functionalization, reducing variability in early screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-defined polyplexes with measurable zeta potential (+15.7 mV at N/P 16) and size (124 nm), enabling standardized assessment of transfection efficiency and cytotoxicity.
- Operational Value: Facilitates high-throughput screening of polymer variants (mBG1, mBG2, mBG3) by linking APMA content (21%, 37%, 52%) to functional outcomes in gene transfer assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates complete plasmid DNA retardation at N/P >4, indicating reliable cargo protection—a key preclinical benchmark for vector stability.
- Operational Value: Supports formulation screening across N/P ratios (8, 16, 4) to identify optimal transfection conditions while monitoring cytotoxicity trends linked to GPMA content.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling synthesis of defined gene carriers for lead identification in nucleic acid delivery, where polymer structure-function relationships inform advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymer-mediated gene delivery by providing quantifiable outputs (particle size, zeta potential, transfection efficiency) to correlate structure with biological activity.
- Screening: Enables assay-ready polyplex production with consistent size (100–200 nm at N/P 16–32) and surface charge, improving reproducibility across compound evaluation campaigns.
- Analytics: Generates measurable biophysical readouts (N/P ratio, zeta potential, electrophoretic retardation) that allow comparative analysis of polymer variants under standardized conditions.
- Translational Research: Connects polymer design to preclinical relevance through demonstrated pDNA complexation and reduced cytotoxicity relative to PEI, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular RAFT-based platform adaptable to other functional amino acids or therapeutics, promoting cross-project standardization in polymer synthesis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in gene carrier performance by linking molecular design (methionine/guanidine content) to DNA binding and transfection outcomes.
- Operational Value: Delivers a scalable, purification-friendly synthesis protocol using acetone precipitation and RAFT control, improving batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by offering a lower-cytotoxicity alternative to PEI, enabling better go/no-go decisions in nucleic acid therapeutic development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer leads (e.g., mBG3 as optimal carrier) based on transfection efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RAFT polymerization, including freeze-pump-thaw degassing and inert atmosphere handling.
- Dependent on precise temperature control (oil bath at 70°C) and specialized reagents (ACVA, CTP) for reproducible block copolymer synthesis.
- Necessitates analytical infrastructure for GPC, zeta potential, particle sizing, and fluorescence-based transfection assays to evaluate polyplex performance.
- Adaptation to other cell lines or payloads may require re-optimization of N/P ratio and cytotoxicity assessment due to variable GPMA-mediated effects.
- Practical limitations include the need for multi-step purification and sensitivity to oxygen during polymerization, which must be mitigated via rigorous degassing protocols.
