Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT
27. November 2019
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.
Hier stellen wir NETQUANT vor, einen vollautomatischen Ansatz zur Quantifizierung von NETS- und Immunfluoreszenzbildern. Dies wird Forschern helfen, vergleichbare Bildanalysen aus Daten zu erstellen, die von mehreren Benutzern und Bedingungen generiert wurden. Die Vorteile dieser Technik sind die Benutzerfreundlichkeit, die Analyse von Einzelzellendaten, mehrere Kriterien zur Bewertung der NET-Bildung und eine unvoreingenommene Analyse mehrerer Bilder.
Installieren und öffnen Sie die Analysesoftware. Eine aktuelle Version finden Sie im Zenodo GitHub-Archiv oder auf der Nordonfelt Lab-Website. Wählen Sie auf der Registerkarte Setup einen Quellordner für die Analyse aus, indem Sie im Quellmenü auf die Option Pfad abrufen klicken.
Wählen Sie den Ordner aus, der die zu analysierenden Bildsequenzen enthält. Klicken Sie erneut auf die Option Pfad abrufen im Zielmenü, und wählen Sie den Zielordner zum Speichern der Daten nach der Bildanalyse aus. Als nächstes benennen Sie bei verwendung separater Kanalbilder die Kanalordner, sodass der DNA-Kanal dem Kern-DNA-Fleck entspricht, und der NET-Kanal zeigt den neutrophilen Elastase-Fleck in den Bildern.
Benennen Sie außerdem den Ordner, der die Steuerelementabbilddateien enthält, als Steuerelement. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Bildinformationen laden, und laden Sie die Bildmetadaten in die Software. Wählen Sie dann im Untermenü Kanalreihenfolge die richtige Kanalreihenfolge aus, die in den Bildern enthalten ist.
Dies hilft, versehentliche Inkongruenzen zu vermeiden. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Daten vorbereiten, um primäre Bildeigenschaften aus den Rohdaten zu erfassen und die Bilder zu konvertieren. Die konvertierten Bilder werden dann im Untermenü der Beispieltypen angezeigt.
Klicken Sie auf das Menü vom Beispieltyp, wählen Sie ein Bild aus dem Untermenü aus und klicken Sie auf Anzeigebilddaten, um die in die DNA und Neutrophil Extracellular Trap bzw. NET-Kanal aufgeteilten Bilder anzuzeigen. Um die Zellen in ihre jeweiligen Kanäle zu segmentieren, wählen Sie die Registerkarte Segmentierungsmethode aus, und wählen Sie eine Methode im Untermenü der Methode für die DNA- und die NET-Kanäle aus. Die Standardmethode der Segmentierung ist auf adaptiv festgelegt und ist die empfohlene Einstellung.
Andere Optionen sind in der Software einschließlich global edge und chanverse verfügbar. Eine Wassereinzugsgebietsoption wurde ebenfalls aufgenommen, um zwischen eng platzierten Zellen oder NETs zu unterscheiden. Klicken Sie auch auf der Registerkarte Segmentierung auf die Option Segmentsteuerungsmuster.
Wählen Sie dann PMA aus dem Beispieltyp-Untermenü aus und klicken Sie auf die Stapeloption, um mit der Segmentierung aller im Datensatz enthaltenen Bilder zu beginnen. Wählen Sie als Nächstes die Bilder im Menü "Beispieltyp" aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilddaten anzeigen, um die binären Bildmasken für die nach der Segmentierung generierten DNA- und NET-Masken zu visualisieren und zu validieren. Klicken Sie nun auf der Registerkarte Analyse auf die Schaltfläche Schwellenwert bestimmen, um die Kontrollbeispiele zu analysieren.
Ändern Sie dann auf der rechten Seite den Stichprobentyp in PMA, und klicken Sie auf die Schaltfläche Zelleneigenschaften abrufen, um die Analyse der stimulierten Proben abzuschließen. Wählen Sie als Nächstes ein Bild aus dem Untermenü des Beispieltyps aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilddaten anzeigen, um die Überlagerung und die Anzahl der Zellen und NET-bildenden Zellen im Bild anzuzeigen. Wählen Sie zunächst das Beispiel aus dem Untermenü des Beispieltyps aus.
Einzelne Bilder können aus dem Untermenü des Beispieltyps für die Analyse ausgewählt werden oder der gesamte Bildstapel kann durch Auswahl der Batch-Option analysiert werden. Sobald die Option ausgewählt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche NETs analysieren, um die Analyse abzuschließen. Passen Sie die NET-Kriterien manuell an, um optimale Ergebnisse für eine bestimmte Stichprobe zu erzielen.
Vergleichen Sie identifizierte NETs mit den Originalbildern, um die Qualität der Identifizierung zu bewerten. Nach Abschluss dieses Schritts können die NET-Kriterien auf alle Bilder im Dataset angewendet werden. Alle an den NET-Kriterien vorgenommenen Änderungen werden gleichzeitig auf alle Steuerelementstichproben angewendet.
Überprüfen Sie die Datenzusammenfassung im Untermenü zellendaten, in dem die Anzahl der Bilder, die Zellenanzahl pro Bild und der Prozentsatz der NETs pro Bild angezeigt werden. Geben Sie die Registerkarte Ausgabe ein, um die Ergebnisausgaben auszuwählen und anzuzeigen. Untersuchen und vergleichen Sie die verschiedenen Datenausgänge, die aus der Analyse von Kontroll- und PMA-behandelten Proben generiert wurden, indem Sie die Form der Ausgabe auswählen und auf die Schaltfläche Ausgabeergebnisse klicken.
Als Nächstes starten Sie die Ergebnisdatentabelle CSV-Datei, um Einzelzellendaten zu untersuchen, und klicken Sie auf die Ergebnisse PDF-Dateien, um die NET-Bereichsverteilung und DNA-zu-NET-Verhältnis in den Stichproben zu visualisieren. Die rote Linie gibt den Schwellenwert in den Diagrammen an. Klicken Sie schließlich auf die bivariate Verteilungsdatei der Ergebnisse, um den NET-Bereich im Vergleich zur Form der DNA zu bestimmen.
Hier wurden 15 Bilder von Kontrollneutrophilen und 15 Bilder von PMA-stimulierten Neutrophilen in weniger als zehn Minuten analysiert. Die Gesamtzahl der Zellen wurde gezählt und der Prozentsatz der Zellen mit Neutrophilen extrazellulären Fallen wurde mit der in diesem Artikel beschriebenen automatisierten Quantifizierungsmethode bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass PMA-stimulierte Neutrophile eine größere Fläche, eine Zunahme der nuklearen Verformung und ein höheres DNA-zu-NET-Verhältnis haben als Kontrollproben.
In Kombination mit einem 3D-Diagramm zeigen die PMA-stimulierten Proben tendenziell Bereiche, in denen die Gruppierungen enger werden als die Kontrollproben. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Workflow zwar mit mehreren Spendern getestet wurde, dass der Benutzer jedoch die Softwareparameter entsprechend basierend auf dem einzelnen Datensatz entscheiden sollte.
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Überblick
Dieser Artikel stellt NETQUANT vor, eine vollständig automatisierte Software, die für die Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) in Immunfluoreszenzbildern entwickelt wurde. Dieses Tool zielt darauf ab, eine konsistente Bildanalyse unter verschiedenen Forschungsbedingungen zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Bildanalyse
Hintergrund
- Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort.
- Die Quantifizierung von NETs ist wesentlich für das Verständnis ihrer Funktion und Auswirkungen bei verschiedenen Krankheiten.
- Bestehende Methoden zur NET-Quantifizierung können zwischen verschiedenen Benutzern und Bedingungen inkonsistent sein.
- NETQUANT zielt darauf ab, diesen Prozess durch Automatisierung zu standardisieren.
Zweck der Studie
- Einführung einer benutzerfreundlichen Software zur Quantifizierung von NETs.
- Ermöglichung für Forscher, eine unvoreingenommene Analyse mehrerer Bilder durchzuführen.
- Erleichterung der Einzelzell-Datenanalyse und Bewertung der NET-Bildung.
Verwendete Methoden
- Installation der NETQUANT-Software aus dem Zenodo GitHub-Archiv oder der Nordonfelt Lab-Website.
- Auswahl des Quellordners für die Analyse über die Software-Oberfläche.
- Nutzung mehrerer Kriterien zur Bewertung der NET-Bildung.
- Automatisierte Verarbeitung von Immunfluoreszenzbildern zur Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- NETQUANT bietet einen optimierten Ansatz für die NET-Quantifizierung.
- Die Software ermöglicht eine konsistente Analyse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Forscher können unvoreingenommene Ergebnisse aus mehreren Bildern erhalten.
- Einzelzell-Datenanalyse verbessert das Verständnis der NET-Bildung.
Schlussfolgerungen
- NETQUANT ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die NETs untersuchen.
- Die Software verbessert die Zuverlässigkeit der Bildanalyse in Immunfluoreszenzstudien.
- Zukünftige Studien können dieses Tool für genauere Bewertungen NET-bezogener Phänomene nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated image-based quantification of neutrophil extracellular traps (NETs) addresses a critical bottleneck in immunology and inflammation research by enabling objective, high-throughput analysis of NET formation. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in drug discovery programs focused on neutrophil-mediated pathways, inflammatory diseases, and host defense mechanisms. By providing single-cell resolution data and standardized criteria for NET identification, NETQUANT enhances predictive confidence in preclinical models and facilitates cross-functional collaboration between immunology, imaging, and data science teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to NETosis pathways and neutrophil function in disease models.
- Operational Value: Provides biologically relevant parameters such as surface area increase, DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation with single-cell resolution.
- Predictive Value: Supports functional target validation by quantifying NET formation in response to stimuli like PMA, allowing assessment of compound effects on neutrophil extracellular trap release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating standardized, quantitative outputs from immunofluorescence images.
- Reproducibility: Addresses key limitations of manual and semi-automatic methods by delivering unbiased analysis across multiple users and conditions through automated threshold determination and batch processing.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse via a freely available app with a user-friendly GUI that processes image sequences in under ten minutes for experimental datasets.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by quantifying NET formation, a process implicated in autoimmune diseases, cancer metastasis, and thrombotic disorders.
- Preclinical Continuity: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative dependent variable measurements (e.g., percentage of NET-forming cells, NET area distribution) that enable comparison between control and stimulated samples.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking value through multivariate analysis of NET area versus DNA shape, helping to clarify mechanisms of action in immunomodulatory compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
NETQUANT fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, particularly in immunology and inflammation-focused programs where NETosis is a relevant pathophysiological mechanism.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling automated quantification of NET formation in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Describes assay readiness through automated processing of immunofluorescence images, quantitative outputs, and batch analysis capabilities that ensure reproducibility across experimental conditions.
- Analytics: Highlights measurements such as cell count per image, percentage of NETs per image, NET area distribution, and DNA to NET ratio that help teams compare conditions and evaluate compound effects.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through disease-relevant system analysis of NET formation, which has implications in sepsis, lupus, and cancer-associated thrombosis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, with freely available software that supports standardization across sites and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in NETosis pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of image-based NET quantification across users and sites.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in inflammation-focused drug development programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative NET formation data from preclinical models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunofluorescence microscopy and image analysis principles.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including fluorescence microscopy and compatible image file formats.
- Cross-team standardization requirements for channel naming, segmentation methods, and NET criteria application across control and stimulated samples.
- Adaptation considerations across model systems such as human vs. murine neutrophils and different stimulation conditions beyond PMA.
- Practical limitations supported by source material: users must decide on software parameters appropriately based on individual data sets, and workflow validation may require optimization for specific cell types or staining protocols.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
