Name: Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie die Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung von Mäusen-Nebennieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung multipler Proteine bei erhaltener Gewebemorphologie.

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Wir danken Dr. Mohamad Zubair für seine Anregungen und technische Hilfe bei der Schaffung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen, nationale Institute der Gesundheit Research Grant 2R01-DK062027 (zu G.D.H) unterstützt.

Alle Methoden wurden gemäß institutionell zugelassenen Protokolle unter der Schirmherrschaft des Ausschusses über Nutzung und Pflege von Tieren an der University of Michigan Universität durchgeführt.
1. Vorbereitung für die Operation
<ol><li>Am Tag vor der Operation vorbereiten 4 % Paraformaldehyd (PFA) / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fahren Sie bei gefrorenen Aliquote mit einer Auftauen und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: 4 % ist PFA nicht für mehr als 48 h stabil. Achtung: PFA ist giftig, vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen, und in einen geeigneten Behälter entsorgen.</li>
	<li>Am Tag der Operation chirurgische Instrumente durch Sterilisation der Scheren und Pinzetten mit 70 % Ethanol (EtOH) bereiten und auf einem Papiertuch trocknen lassen.</li>
	<li>Ort eine 24-Well-Platte gefüllt mit 1 X PBS (1 mL/gut ist ausreichend) in einem Eiskübel. Hinweis: Nebennieren werden nach der Operation in diesem Multi-gut Kulturschale gehalten werden.</li>
</ol>(2) Nebennieren Dissektion
<ol><li>Einschläfern der Maus nach Standardprotokolle, die durch die institutionellen Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) genehmigt. Eine sekundäre Methode der Sterbehilfe, Tod (z. B. Enthauptung) zu gewährleisten ist erforderlich.<ol>
<li>Für Euthanasie durch Isofluran Überdosis, platzieren Sie den Mauszeiger in einer Kammer gefüllt mit Isofluran dämpfen bis Atmung aufhört, dann entfernen Sie die Maus aus der Kammer, legen Sie es auf eine Oberfläche und führen Sie zervikale Dislokation. Hinweis: Die meisten Euthanasie Methoden das Tier Leid zufügen und sind nicht geeignet für Stress Studien, weil sie der konfundierenden Variablen der Aktivierung der Hypophysen-Nebennieren-Achse und medulläre catecholamin-Freisetzung hinzufügen können. In diesem Fall ist Enthauptung die vorgeschlagene Technik annehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Maus Rückenlage, Sterilisieren die Schnitt-Bereich auf den Bauch und die Flanken mit 70 % EtOH. Hinweis: Während das Fell rasieren Sterilität ansteigen wird, ist für diese spezielle Anwendung es nicht notwendig.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut in der Mitte des Bauches mit einer Schere, das Peritoneum die Haut trennen, deskin der Maus durch die Haut um den Schnitt zu kneifen und ziehen Sie ihn in zwei entgegengesetzte Richtungen (kaudalen und rostral). Dann schneiden Sie das Peritoneum bis hin zu den hinteren linken und rechten Flanken.</li>
	<li>Entfernen Sie das murine Nebenniere schneiden um das umliegende Fettgewebe zu und legen Sie sie in der 24-Multiwell-Platte mit 1 X PBS gefüllt und auf Eis gehalten.</li>
</ol>(3) Peri-Nebennieren Fettentfernung
<ol><li>Unter dem sezierenden Mikroskop legen die Nebennieren auf ein Glas base oder eine Petrischale auf den Tischeinsatz die Lichtquelle zu positionieren, wählen Sie die Vergrößerung und passen Sie den Fokus auf eine klare Sicht auf die gesamte Nebennieren zu erhalten. Hinweis: Die verwendete Vergrößerung kann je nach persönlichen Vorlieben variieren. Eine Gesamtvergrößerung von 30 X mit einem Plan Objektiv 1 X, 3 X zoom und Okular 10 X ermöglicht, um die ganze Drüse mit ein gutes Sichtfeld zu visualisieren.</li>
	<li>Schnell zu entfernen, das angrenzende Fettgewebe mit zwei 25 G Nadeln, Austrocknung der Nebennieren zu vermeiden. Wenn dies geschieht, bevor alles Fett entfernt wird, bewegen die Nebennieren wieder in den Brunnen, enthält 1 X PBS für 1 – 2 min. und dann weiter mit dem Prozess der Entfernung von Fett.</li>
	<li>Waschen Sie 2 X 2 min. 1 X PBS.</li>
</ol>(4) Gewebe Verarbeitung und Einbettung
<ol><li>Fixieren Sie das Gewebe in 4 % PFA/PBS bei 4 ° C auf eine rockende Plattform für 2 h.</li>
	<li>Entfernen Sie die 4 % PFA und waschen das Gewebe mit 1 X PBS, 3 X für 15 min bei 4 ° C. Achtung: PFA ist giftig und ist als gefährlicher Abfall; Es sollte mit Vorsicht unter einer chemischen Haube behandelt und in einen Behälter für gefährliche Abfälle entsorgt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Nebennieren in 50 % EtOH bei 4 ° C auf eine rockende Plattform für 2 h.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Nebennieren in 70 % EtOH bei 4 ° C auf eine rockende Plattform für ein Minimum von 2 h. Hinweis: Wenn nicht mit Gewebe Verarbeitung für die Einbettung von ausgehend, Nebennieren können gespeichert werden in 70 % EtOH bei 4 ° C. Vermeidung von Langzeitlagerung in 70 % ergibt EtOH und Sie fortfahren, um Gewebe Verarbeitung so schnell wie möglich bessere QUALITÄTSPROBEN.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nebennieren für Gewebe Verarbeitung durch in Gaze einwickeln und in einem Gewebe einbetten Kassette umschließt. Legen Sie die Kassette in ein Glas, gefüllt mit 70 % EtOH und Store bei 4 ° C bis bereit, an den Gewebe-Prozessor zu bewegen. Legen Sie die Kassette in den Gewebe-Prozessor programmiert, wie in Tabelle 1 gemeldet und führen Sie das Programm aus.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kassette in ein Einbettungs-Station gefüllt mit geschmolzenem Paraffin bei 65 ° C. Wenn eine Kühlstation nicht verfügbar ist, positionieren Sie eine kalte kühle Fach daneben.</li>
	<li>Beschriften Sie ein Einbetten von Schimmel und öffnen Sie das Gewebe einbetten Kassette zu. Mit einer Zange, packen Sie die Gaze und legen Sie die Nebennieren sanft in die gewünschte Position in der Mitte der Basis in der einbettenden Form. Gießen Sie die geschmolzene Paraffin auf die Nebennieren. Bei Bedarf halten Sie die Nebennieren mit der Pinzette, sichern ihre Position in der Form sonst, dass es in der Form bewegen kann.</li>
	<li>Sanft bewegen Sie den Einbetten von Schimmel auf den kühlenden Behälter und warten Sie, bis die Aushärtung des Paraffins. Danach zur Erleichterung der Schnitt speichern Sie einbetten Formen an einem kühlen Ort.</li>
</ol>5. Schneiden mit einem rotierenden Mikrotom
<ol><li>Check das Mikrotom sauber ist, bevor Sie beginnen, Bürsten entfernt alle weggeworfenen Paraffin Rückstände, sicherzustellen, dass die Messer (oder Klinge) geschärft ist, Öl den internen Mechanismus und vollständig einfahren den Block-Halter, bei Bedarf.</li>
	<li>Eine Reihe von Objektträger beschriften (positiv aufgeladen oder beschichtet, um Gewebe zu verhindern (siehe Tabelle der Materialien)), legen Sie diese auf eine wärmere Folien-Set bei 37 ° C, und einige autoklaviert Typ1 Reinstwasser auf jeder Folie zu verzichten.</li>
	<li>5 µm Dicke festgesetzt.</li>
	<li>Stecken Sie Mikrotom Klinge in den Klingenhalter, Steuern Sie den Winkel der Klinge zu, stellen Sie sicher, dass die Klinge fest in die Halterung befestigt ist und prüfen Sie den Abstand der paraffinblock und Block-Halter.</li>
	<li>Bringen Sie die Block-Halter in die höchste Position zu und, wenn möglich, Sperren Sie Bediengriff, entfernen Sie paraffinblock aus der Form und legen Sie sie in den Block-Halter befestigen Sie es fest mit der Klemme. Der Winkel von der Mittellinie des Blattes mit der gegenüberliegenden Fläche des Blocks sollte ca. 20° betragen. Ggf. nachjustieren der paraffinblock. Achtung: Die Klinge ist scharf.</li>
	<li>Wenn zuvor gesperrt, entsperren Sie das Handrad und senken Sie den paraffinblock, bis sein Gesicht mit der Kante des Blatts Mikrotom waagerecht steht. Drehen Sie das Handrad mit einem gleichmäßigen Rhythmus. Führen Sie erste trimmen, das Paraffin zu entfernen und die Nebennieren aussetzen.</li>
	<li>Drehen des Handrades, und Abschnitt bis zum Ende der Nebennieren. Verwenden Sie Hellfeld oder sezieren Mikroskop, um auf das Vorhandensein von Gewebe in den Abschnitten zu überprüfen. Lösen Sie das Band von der Klinge zu und mit Hilfe von ein paar Zangen legen Sie es auf dem Wasser auf dem Objektträger gelegt. Es kann nützlich sein, die Band auf eine Unterlage legen, ziehen Sie es vorsichtig und montieren Sie es auf der Folie.</li>
	<li>Lassen Sie die Folien auf der Heizplatte trocknen. Dann legen Sie sie flach auf ein Diahalter und backen bei 37 ° C über Nacht oder länger wenn Wasser noch vorhanden ist. Nach dem Trocknen, speichern Sie die Folien in einer Folie Box bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Einlagerung der Gebrauchtgeräte und reinigen das Mikrotom.</li>
</ol>(6) Immunfluoreszenz
<ol><li>Wählen Sie die Folien für Immunostaining und legen Sie sie in einen Diahalter.</li>
	<li>Bringen Sie auf einer heißen Platte einen Becher gefüllt mit 0,01 M Citrat bei pH 2.0 zu kochen. Das Volumen des Puffers hängt von der Größe der Becher und muss ausreichen, für die Deckung der Abschnitte auf den Folien während des Kochens (einige Verdunstung muss berücksichtigt werden). Das Becherglas mit Alufolie abdecken. Hinweis: Andere Methoden zum Abrufen von Antigen sind verfügbar (siehe Diskussion).</li>
	<li>Deparaffinize Folien in 100 % Xylol 2 X 5 min. lang. Die Folien mit der folgenden Serie rehydrieren: 100 % EtOH 2 X 5 min, 70 % EtOH 2 X 5 min Typ 1 Reinstwasser für 5 min. Hinweis: Nach deparaffinisierung, ist es wichtig, nicht die Abschnitte Austrocknen lassen: Gewebeschnitte müssen immer mit Puffer oder Lösungen abgedeckt werden, bis zum Ende des Verfahrens oder die Gewebestruktur kann beschädigt werden.</li>
	<li>Für Antigen-Retrieval Folien in einem metallschlitten Halter und schieben Sie es in das Becherglas mit kochendem Citrat ohne die Aluminiumfolie. 10 min kochen lassen.</li>
	<li>Das Becherglas von der Heizplatte entfernen und abkühlen lassen für 20 min. sorgen dafür, dass die Nebennieren Abschnitte noch mit dem Puffer bedeckt sind.</li>
	<li>Bereiten Sie die blockierende Lösung. Wenn mit den im Handel erhältlichen Färbung für die Vertreter Ergebnisse eingesetzt Kit (siehe die Tabelle der Materialien), in einem Rohr 1,25 mL 1 X PBS, 1 Tropfen (entspricht ca. 45 µL) Maus Ig Blocking Reagenz und 5 % normalem ziegenserum hinzufügen. Speichern Sie die blockierende Lösung bei 4 ° C oder auf Eis während der Arbeit. Hinweis: Das Serum verwendet richtet sich nach der Sekundärantikörper Wirtsarten. Hier wurden Sekundärantikörper wuchs in Ziege verwendet. Für andere Antikörper können unterschiedlichen Serumkonzentrationen notwendig sein. Bestimmen Sie empirisch die richtige Serum-Konzentration durch mehrere Konzentrationen testen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Folien in eine Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS und Waschen 3 x 10 min auf einer Wippe mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Feuchte Kammer für die Färbung.</li>
	<li>Schütteln Sie die PBS von einer Folie; Wischen Sie die Folie unten mit einem fusselfreiem abwischen, die überschüssige PBS zu entfernen.</li>
	<li>Mit einem speziellen Marker für Folien mit hydrophoben Eigenschaften, zeichnen Sie einen Kreis rund um jeden Nebennieren Abschnitt, um sicherzustellen, dass die Glasoberfläche zu vermeiden die Verbreitung der Tinte Lösung zum Abschnitt trocken ist. Bei Bedarf trocknen Sie sorgfältig die Oberfläche. Legen Sie die Folie in die Feuchte Kammer.</li>
	<li>Schnell, pipette, 50 µL (oder Abschnitte decken) Lösung auf jeden Abschnitt zu blockieren. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Blockiert Lösung benötigten Mengen variieren; Es ist wichtig, dass die Abschnitte mit der Lösung gut bedeckt sind.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdünnungsmittel Lösung aus dem kommerziell erhältlichen Kit mit 7,5 mL 1 X PBS, 600 µL Protein Konzentration Lager-Lösung und 5 % normalem ziegenserum (oder jede andere Serum und Konzentration in die blockierende Lösung verwendet). Speichern Sie die Verdünnungsmittel Lösung bei 4 ° C oder auf Eis während der Arbeit.</li>
	<li>Bereiten Sie die primären Antikörper Lösungen der primären Antikörper in den entsprechenden Konzentrationen in die Verdünnungsmittel Lösung verdünnen. Fügen Sie für Co Färbung eine Aliquote jedes Antikörpers in einen neuen Schlauch und mischen Sie vorsichtig. Platzieren Sie Antikörper und Antikörper Lösungen auf Eis, bis zum Gebrauch. Hinweis: Hier beschäftigten wir Anti-SF1-Antikörper in Kaninchen angehoben und Antikörpers Anti-TH in Maus angehoben. Zur Vorbereitung des Antikörpers folgen funktionierende Lösungen gerichtet.<ol>
<li>Für SF1 Arbeitslösung in eine Röhre fügen Sie 1 µL Antikörper Anti-SF1 999 µL Verdünnungsmittel Lösung (Endkonzentration von 1,5 µg/mL hinzu). Für TH-Arbeitslösung in einem Rohr fügen Sie 1 µL Anti-TH-Antikörper in 499 µL Verdünnungsmittel Lösung (geschätzte Endkonzentration von 2-6 µg/mL hinzu).</li>
		<li>Für SF1 + TH Antikörper Arbeiten Mischung in einem frischen Rohr, pipette, 250 µL Arbeitslösung SF1 und 250 µL Arbeitslösung TH. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren. Speichern Sie auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfer Folien in einem Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS und Waschen 3 X 5 min auf einer Wippe mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Ort, an dem die Rutschen in die Feuchte Kammer zurück, nach dem abwischen Übermaß an PBS, Pipette die SF1 + TH Antikörper Arbeiten Mix (oder anderen primären Antikörper-Lösung) auf die einzelnen Abschnitte schließen die Feuchte Kammer und lasse es über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Am nächsten Tag bewegen der Dias in einem Coplin jar mit 1 X PBS und Waschen 3 X 15 min. auf einer Wippe mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Beim Waschen zubereiten der Folien Sekundärantikörper Lösung in die Verdünnungsmittel Lösung unter Verwendung der entsprechenden Konzentration. Wenn Leistung Co Färbung, fügen Sie gleich Menge jeder Sekundärantikörper Lösung in einen neuen Schlauch. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren. Speichern Sie auf Eis. Die Rohre vor Licht schützen und speichern auf Eis bis zum Gebrauch. Hinweis: Hier sind die sekundären Antikörper verwendet, 488 nm fluoreszierenden Farbstoff-markierten Anti-Maus in Ziege angehoben und 549 fluoreszierenden Farbstoff-markierten Anti-Kaninchen in Ziege angehoben. Die sekundäre Antikörper-Lösung wurde vorbereitet, indem man 0,5 µL jeder Sekundärantikörper in 799 µL Verdünnungsmittel Lösung (Endkonzentrationen von 1,2 µg/mL).</li>
	<li>Legen Sie die Folien zurück in die Feuchte Kammer nach dem Entfernen der Überschuss an PBS pipette die sekundäre Antikörper-Lösung auf die Nebennieren Abschnitte, die Feuchte Kammer in der Nähe und schnell vor Licht schützen. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie der Objektträger in einem Coplin Glas mit 1 X PBS und waschen Sie 3 X 15 min. auf einer Wippe mit sanftes Schaukeln, sicherstellen, dass sie vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Bereiten Sie die 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung für nukleare Färbung: 1 µL DAPI (20 mg/mL) in 1 mL 1 X PBS. Hinweis: Blau-fluoreszierende nuklearen gegenfärbung kann auch mit Hoechst Farbstoff erreicht werden.</li>
	<li>Pipette DAPI-Lösung auf die Nebennieren Abschnitte aus Licht abdecken und bei Raumtemperatur für 7 min inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie der Objektträger in einem Coplin Glas mit 1 X PBS und waschen Sie 3 X 5 min auf einer Wippe mit sanftes Schaukeln und die Folien vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Auf einer Fläche von direktem Licht abgeschirmt legte sich ein Deckglas und pipette 60 µL oder ca. 3 Tropfen des Montage-Agents für Immunfluoreszenz entlang der Oberfläche der Glasabdeckung geeignet.</li>
	<li>Wischen Sie die Rückseite eines Dias mit einem fusselfreiem abwischen, Position die Folie verdeckt auf das Deckglas und parallel dazu, so die Gewebeschnitte das Deckglas mit dem Montage-Agent auf es Gesicht. Leicht andrücken der Folie auf das Deckglas und stellen Sie sicher, dass keine Luftblase zwischen der Folie und dem Deckglas eingeklemmt ist.<ol>
<li>Falls erforderlich, weitere Druck, Luftblasen und die Überschreitung des Montage-Agent zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Folie in einem dunklen Behälter und Heilung bei Raumtemperatur für mindestens 24 h (oder die Zeitangabe in dem Informationsblatt des Montage-Agent verwendet) und fahren Sie anschließend mit Bildbearbeitung.</li>
</ol>(7) Bildgebung
Hinweis: Ein Fluoreszenzmikroskop an eine Kamera angeschlossen ist erforderlich für die Erkennung und Erfassung der Fluoreszenz emittiert durch das Gewebe nach Anregung bei bestimmten Wellenlängen. Während es offensichtlich ist, ist es wichtig, um daran zu erinnern, wählen die sekundäre Antikörper konjugiert mit Fluorochromes deren Anregung und Emission-Spektren sind kompatibel mit den Geräten zur Verfügung. Bildgebung Einstellungen variieren je nach das Mikroskop und die Software zum Erfassen von Bildern verwendet. Es gibt einige grundlegenden Regeln, die gelten für imaging-Nebennieren Abschnitte, z. B. dafür sorgen, dass die Belichtungszeit, Kamera gain-Einstellungen und Lichtquelle Intensität konstant gehalten werden.
<ol><li>Die Lichtquelle und die Kamera schalten Sie ein, starten Sie die imaging-Software nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Die Reihenfolge der Aktionen kann je nach der Ausstattung abweichen.</li>
	<li>Die Folie auf der Bühne zu sichern, öffnen Sie den Verschluss und Blick in das Mikroskop Okulare nuklearen Färbung (DAPI) Kanal und geringer Vergrößerung (4 X) verwenden, um das Gewebe auf der Folie zu identifizieren: Nebennieren Abschnitte sind klein, und ihre Visualisierung kann einige Zeit dauern.</li>
	<li>Verschieben Sie den Fokus auf eine höhere Vergrößerung (10 X), und schließen Sie den Auslöser. Hinweis: Es ist wichtig, um unnötig lange Exposition unter dem Licht, Immunofluoreszenz, was zum Verlust des Signals verursachen können, zu vermeiden.</li>
	<li>Mit den Software-Befehlen, wählen Sie das Ziel (10 X) und der Kanal im Einsatz (DAPI), passen Sie die Belichtungszeit (1 s, eingestellt werden, wenn das Signal zu stark oder zu schwach ist). Falls verfügbar, binning für live Imaging (nicht Erwerb), "2 X 2', Konvertierung zu gewinnen,"Mitte", Anzeige Geschwindigkeit auf 20 MHz" festgelegt. Wenn die Software verwendet die Maßstabsleiste am Ende der Bildgebung nicht angezeigt wird, wählen Sie im Menü die Skalierungsoption Bar und positionieren Sie die Leiste an die gewünschte Stelle.</li>
	<li>Öffnen Sie den Auslöser, einzustellen Sie den Fokus bei Bedarf neu und Umschalten Sie der Sender (FITC, TRITC, DAPI). Wenn das Mikroskop nicht automatisiert ist, nehmen Sie ein Bild von den Nebennieren in jedem Kanal ohne bewegliche Bühne und achten Sie darauf, die Auswahl des Kanals im Einsatz anzupassen. Schließen Sie den Auslöser einmal fertig. Hinweis: Notieren Sie die Einstellungen beschäftigt, für den Fall, dass die Software sie nicht automatisch speichert.</li>
	<li>Die Bilder zu speichern. Hinweis: Zusammengeführten Bilder können oft mit dem Mikroskop-Software oder andere Grafik-Editor-Software-Pakete erstellt werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie Imaging für andere Bereiche des Abschnitts und/oder mit einer höheren Vergrößerung. Hinweis: Ein 20 X Vergrößerung oft erfordert eine kürzere Belichtungszeit (d. h. 800 ms).</li>
	<li>Am Ende der Bildgebung schalten Sie alle Geräte in der richtigen Reihenfolge.</li>
</ol>

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<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Isolierung von Maus Nebennieren zusammen mit der Vorbereitung und Färbung der geschnittenen Paraffin-eingebetteten Maus Nebennieren.
Im Vergleich zu anderen Protokollen, die wir getestet, hat dieses Immunfluoreszenz-Protokoll für die meisten der in unserem Labor verwendeten Antikörper geeignet erwiesen. In bestimmten Fällen kann es jedoch, einige Anpassungen zur Verbesserung der Färbung Ergebnisse verlangen. Eine Variable, die leicht geändert un...

Immunohistochemistry ist eine Technik zur Erkennung von gewebeanteile mit dem Einsatz von Antikörpern gegen spezifische zelluläre Moleküle und anschließende befleckenden Techniken der konjugierten Antikörpern1zu erkennen. Diese immunhistochemische Verfahren erfordert spezielle Fixierung und Verarbeitung von Geweben, die für das Antigen oft empirisch ermittelt werden, Gewebe und Antikörper verwendet2. Die Fixierung ist entscheidend für den "ursprünglichen" Zustand des Gewebes und damit Erhaltung intakten zellulären und subzellulären Strukturen und Expressionsmuster beizubehalten. Weitere sind Verarbeitung und Einbettung Verfahren erforderlich, um das Gewebe vorbereiten, schneiden in dünne Scheiben schneiden, die histologische Studien mit Immunohistochemistry verwendet werden.
Immunostaining kann mit chromogenen oder fluoreszierende Erkennung durchgeführt werden. Chromogene Erkennung erfordert die Verwendung eines Enzyms zu einem löslichen Substrat in eine unlösliche farbige Produkt umzuwandeln. Während dieses Enzym an der Antikörper erkennt das Antigen (Primärantikörper) konjugiert werden kann, ist es immer öfter an den Antikörper erkennen den primären Antikörper (d.h. der Sekundärantikörper) konjugiert. Diese Technik ist sehr empfindlich; Das farbige Produkt aus der enzymatischen Reaktion ist Photostabil und erfordert nur ein Hellfeld-Mikroskop für die Bildgebung. Jedoch kann chromogenen Immunostaining nicht geeignet wenn Sie versuchen, zwei Proteine zu visualisieren, die Co lokalisieren, da die Abscheidung einer Farbe kann die Ablagerung des anderen Maske. Im Falle von Co Färbung, hat Immunfluoreszenz mehr als vorteilhaft erwiesen. Das Aufkommen der Immunfluoreszenz wird zugeschrieben Albert Coons und Kollegen, die ein System zur Identifizierung von Gewebe-Antigene mit Antikörpern mit Fluorescein gekennzeichnet und visualisieren im geschnittenen Gewebe unter ultraviolettem Licht3entwickelt. Fluoreszenz-Detektion basiert auf einem Antikörper konjugiert mit einem Fluorophore, die nach Anregung Licht ausstrahlt. Da gibt es mehrere Fluorophore mit Emissionen bei verschiedenen Wellenlängen (mit keine oder nur geringe Überlappung), eignet sich diese Nachweismethode für die Studien von mehreren Proteinen.
Die Nebenniere ist ein gekoppelten Organ befindet sich oberhalb der Niere und zeichnet sich durch zwei embryologically verschiedene Komponenten von mesenchymalen Kapsel umgeben. Die äußeren Nebennierenrinde, abgeleitet von der mesonephric mittlere Mesoderm sondert Steroidhormone während die inneren Medulla, abgeleitet aus der Neuralleiste Katecholamine wie Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin produziert. Die Nebennierenrinde histologisch und funktional gliedert sich in drei konzentrische Zonen mit jeder Zone sezernierenden verschiedene Klassen von Steroid-Hormone: die äußeren Zona Glomerulosa (zG) produziert Mineralocorticoids, die Elektrolyt-Homöostase zu regulieren und intravasale Volumen; die mittlere Zona Fasciculata (zF), sondert direkt unterhalb der zG, Glukokortikoide, die die Stress-Reaktion durch die Mobilisierung der Energiespeicher Erhöhung der Plasma-Glukose zu vermitteln; und der inneren Zona Reticularis (zR), die synthetisiert sex Steroid Vorläufer (d. h. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Einige Variationen in NNR Zonierung ist zwischen den Arten vorhanden: z. B. Mus Musculus fehlt der zR. Die einzigartige postnatale X-Zone des M. Musculus ist ein Überrest des fetalen Kortex zeichnet sich durch kleine Lipid-Armen Zellen mit acidophilen Cytoplasma5. Die X-Zone verschwindet in der Pubertät bei männlichen Mäusen und nach der ersten Schwangerschaft bei weiblichen Mäusen oder allmählich verkommt nicht gezüchtete Weibchen6,7. Darüber hinaus markiert die schlängelung und Dicke der zG Exponate Variation zwischen den Arten, wie Organisation von peripheren Stamm- und Vorläuferzellen in und neben der zG. Die Ratte, im Gegensatz zu anderen Nagetieren verfügt über eine sichtbare undifferenzierte Zone (zU) zwischen dem zG und zF funktioniert als eine Stammzell-Zone und/oder eine vorübergehende Verstärkung Stammväter-Zone. Ob die zU einzigartig für Ratten ist oder einfach mehr prominent Cluster von Zellen organisiert ist unbekannt8,9.
Zellen der Nebennierenrinde enthalten Lipid-Tröpfchen, die Cholesterin-Ester zu speichern, die als Vorläufer der alle Steroidhormone10,11dienen.  Der Begriff "steroidgenese" definiert den Prozess der Produktion von Steroidhormonen aus Cholesterin über eine Reihe von enzymatischen Reaktionen, bei denen die Aktivität von steroidogenic Factor 1 (SF1), deren Ausdruck ein Marker für steroidogenic Potenzial ist. In der Nebenniere ist Sf1 Ausdruck nur in den Zellen der Hirnrinde12vorhanden. Eine interessante Studie fand den Ausdruck der endogene Biotin in NNR Zellen mit steroidogenic potenzielle13. Während dies kann die Ursache für einen höheren Hintergrund in Biotin/Streptavidin-basierte Färbung Methoden, durch die Erkennung von endogenen Biotin durch Antikörper konjugiert mit Streptavidin, könnte dieses Merkmal auch eingesetzt werden, um den steroidogenic unterscheiden Zellen aus anderen Populationen innerhalb der Nebenniere, d. h., Endothelzellen, Kapsel und Medulla Zellen.
Sympathische neuroendokrine Neuronen innerviert, zeichnet sich das Nebennierenmark durch basophile Zellen mit einem körnigen Zytoplasma, Adrenalin und Noradrenalin enthalten. Medulla Zellen sind aufgrund des hohen Gehaltes an Katecholaminen, die braunes Pigment nach Oxidation14 bilden"chromaffin" benannt. Tyrosin-Hydroxylase (TH) ist das Enzym das katalysiert die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der Synthese der Katecholamine und in der Nebenniere, äußert sich nur in der Medulla15.
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung der Maus Nebennieren, deren Verarbeitung für die Einbettung in Paraffin-Schnitt und eine Methode durchzuführen Immunfluoreszenz-Färbung auf Nebennieren Abschnitte um die zelluläre Arten bilden die Nebennierenrinde und Medulla. Dieses Protokoll ist ein Standard in unserem Labor für Immunostaining mit mehreren Antikörpern routinemäßig in unserer Forschung verwendet.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>Einmalkanülen 25 G x 5/8"</td> <td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&nbsp;</td><td>McCormik Scientific</td><td>39502004</td><td>Paraffin für die Gewebeeinbettung</td></tr><tr><td>Shandon-Biopsiekassetten II mit aufgesetztem Deckel</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>1001097</td><td>Kassetten für die Gewebeverarbeitung</td></tr><tr><td>Hochprofil-Mikrotomklingen</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>Einwegklingen aus Edelstahl</td></tr><tr><td>Einweg-Einbettungsformen aus Kunststoff</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>Abgeschnitten, 22 mm quadratisch oben verjüngt auf 12 mm unten</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certi-Pad Mull-Pads&nbsp;</td><td>Zertifizierte Sicherheit Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3" x 3. Sterile latexfreie Mullbinden</td></tr><tr><td>M.O.M. Kit&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>Zum Nachweis von primären Maus-Antikörpern auf Mausgewebe</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Wipes 4,4 Zoll x 8,4 Zoll</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>Stift zum Zeichnen auf Objektträgern</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>Größe: 22 x 50 x 1,5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(Hergestellt in 20 mg/mL Stamm)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P36930</td><td>Eindeckmittel für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>X-cite series 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>Lichtquelle</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Verarbeiter von Gewebe&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-SF1</td><td>Ab Proteintech Gruppe (PTGlabs)</td><td> kundenspezifischer</td><td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Alexa-488 Maus IgG&nbsp; gezüchtete Ziege</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003&nbsp;</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Dylight-549 Kaninchen IgG aufgezogen Ziege</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Citrat Säure wasserfrei</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Grundlagenforschung&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software für die Bildgebung</td></tr></tbody></table>

isolierung, fixierung und immunfluoreszenz imaging der maus nebennieren

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunfluoreszenz ist eine etablierte Methode zur Erkennung von Antigenen in Geweben mit der Beschäftigung von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern und verfügt über ein breites Spektrum an Anwendungen. Erkennung von Antigenen ermöglicht die Charakterisierung und Identifizierung von mehreren Zelltypen. Oberhalb der Nieren und durch eine Schicht von mesenchymalen Zellen eingekapselt, ist der Nebenniere eine endokrine Organ, bestehend aus zwei verschiedenen Geweben mit unterschiedlicher embryologischen Herkunft, der mesonephric mittlere Mesoderm abgeleitet äußere Rinde und der neuronalen Kamm-abgeleiteten inneren Medulla. Die Nebennierenrinde sondert Steroide (d. h. Mineralocorticoids, Glukokortikoide, Sexualhormone), während das Nebennierenmark Katecholamine (z.B. Adrenalin, Noradrenalin) produziert. Während der Nebennieren forschen, ist es wichtig, einzigartige Zellen mit unterschiedlichen Funktionen unterscheiden zu können. Hier bieten wir ein Protokoll entwickelt, die in unserem Labor, das beschreibt eine Reihe von aufeinander folgenden Schritten erforderlich für den Erhalt der Immunfluoreszenz-Färbung, die Zelltypen der Nebenniere zu charakterisieren. Wir konzentrieren uns zunächst auf die Zerlegung der Nebennieren Maus die mikroskopische Entfernung von Periadrenal Fett, gefolgt von der Fixierung, die Verarbeitung und das Paraffin Einbettung des Gewebes. Wir beschreiben der Gewebe Blöcke mit einer rotierenden Mikrotom schneiden. Zu guter Letzt zeigen wir ein Protokoll für immunofluorescent Färbung der Nebennieren, die wir entwickelt haben, um unspezifische Antikörperbindung und Autofluoreszenz zu minimieren, um ein optimales Signal zu erreichen.

Abbildung 1 stellt eine schematische Darstellung des das gesamte Protokoll beschriebenen. Nebennieren werden geerntet, von Mäusen, angrenzende Fettgewebe wird entfernt, unter dem sezierenden Mikroskop und die Nebennieren sind dann fixiert, in 4 % PFA. Nach diesem Schritt sind Nebennieren verarbeitet und in Paraffin eingebettet und geschnitten mit ein Mikrotom, die Orgel in dünne Scheiben schneiden, die auf Objektträger abgelegt werden. Nach dem Trocknen der A...

Hier präsentieren wir eine Methode, um die Nebennieren von Mäusen zu isolieren, das Gewebe zu beheben, sie Abschnitt und durchführen Immunfluoreszenz-Färbung.

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunfluoreszenz ist eine grundlegende Methode, die helfen kann, wichtige Fragen im Nebennierenfeld über Nebennierenzonation, Zellidentität und Funktion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das Studium mehrerer Proteine ermöglicht und gleichzeitig die Morphologie des Nebennierengewebes bewahrt. Um die murine Nebenniere zu entfernen, schneiden Sie das umgebende Fettgewebe um und legen Sie die Drüse in einen Brunnen einer 24-Multiwell-Platte mit frischen PBS auf Eis.Übertragen Sie die Drüse auf eine Petrischale oder Glasstütze unter einem Seziermikroskop und verwenden Sie zwei 25-Meter-Nadeln, um das angrenzende Fettgewebe zu entfernen. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Drüse mit drei 15-minütigen Wäschen bei vier Grad Celsius in ein bis zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die Drüse in zwei sequenziellen Ethanol-Eintauchen bei vier Grad Celsius mit Schaukeln für zwei Stunden pro Inkubation dehydrieren. Um das Nebennierengewebe für die Verarbeitung vorzubereiten, wickeln Sie die Drüse in Gaze

isolation-fixation-immunofluorescence-imaging-mouse-adrenal

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Nebennierenmarks chromaffinen Zellkultur-Systeme sind äußerst nützlich für die Untersuchung der Anregungs-Sekretion Kopplung in einem in vitro-Einstellung. Dieses Protokoll stellt das Verfahren verwendet werden, um den Nebennieren zu sezieren und dann isolieren medulläre Region durch Abstreifen der Nebennierenrinde. Die Verdauung der Medulla in einzelne chromaffinen Zellen wird dann demonstriert.

Maus Adrenal Chromaffin Zellisolation

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Multiplex-Immunfärbungen mit primären Antikörpern derselben Wirtsspezies. Bei dieser Methode wird ein Abschnitt aus Nebennierengewebe einem zweistufigen Immunfärbeprozess unterzogen. Zunächst wird der Schnitt mit Antikörpern gefärbt, die spezifisch für Marker in der Hirnrinde sind, gefolgt von der Abstreifung des gebundenen Antikörpers und der erneuten Färbung mit Antikörpern, die für Marker in der Medulla spezifisch sind.

Eine Multiplex-Immunfärbemethode unter Verwendung von Primärantikörpern derselben Wirtsspezies

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Nach der Exozytose wird die fusionierte Plasmamembran durch einen Prozess gewonnen, der als Endozytose bekannt ist. Dieser Mechanismus reformiert neue synaptische Vesikel für die nächste Runde der Freisetzung. Einzelne endozytäre Ereignisse werden durch die Verwendung der zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in chromaffinen Nebennierenzellen der Maus erfasst und analysiert.

Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Hypophyse zu sezieren und bereiten Hypophyse koronalen Abschnitte von Mäusen zu entwickeln.

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

Für multipleX-Immunostaining mit primärer Antikörper aus der gleichen Wirtsart wurden verschiedene Methoden etabliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Mikrowellen-vermittelten Antikörper-Stripping und von Fluorophor-Tyramid, um Antikörper-Kreuzreaktivität während multiplex-immunostaining auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Mausnebennierenabschnitten zu blockieren.

Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs) des Skelett- und Herzmuskels aus stacheligen Mäusen (Acomys) durch enzymatische Dissoziation und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die aus diesem Protokoll gewonnenen FAPs können effektiv zu Myofibroblasten und Adipozyten erweitert und differenziert werden.

Isolierung, Expansion und Differenzierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus dem Modell der stacheligen Maus

Ein robuster und reproduzierbarer Ansatz zur Etablierung von 2D-Primärkulturen von Zona-Glomerulosa- und Zona-Fasciculata-angereicherten Zellen wurde für den Nebennieren-Cortex der Maus entwickelt. Dieses System bewahrt wichtige molekulare und funktionelle Merkmale jeder Zone und ermöglicht so eine gezielte Untersuchung von Signalwegen, Hormonproduktion und dem Verhalten der Nebennierenkortikale Zellen ex vivo.

Etablierung von zonenangereicherten Primärkulturen aus dem Nebennierenkortex der Maus

Lernen Sie die Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung von Mäusen-Nebennieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung multipler Proteine bei erhaltener Gewebemorphologie.

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

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