Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Chloroplasten zu beantworten, z. B. die Zusammensetzung der Chloroplasten-Protein-Importmaschinerie. Es ist wichtig für die Begrünung und Photosynthese und damit für die Nahrungsmittelproduktion auf dem Planeten. Die molekulare Maschine besteht aus zwei separaten Komplexen im äußeren und inneren Element des Chloroplasten namens TOC und TIC, aber die Zusammensetzung ist nicht vollständig bekannt.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Reinigung des Arabidopsis TOC/TIC-Komplexes in einer einstufigen Reinigungsmethode, der TAP-TOC-Reinigung, erfolgen kann. Es ist eine spezifische und effiziente Methode. Im Allgemeinen können Forscher, die mit dieser Methode vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht mit der Isolierung von Chloroplastenmembranfraktionen, Waschmittel, Löslichkeit oder Affinitätsreinigung vertraut sind.

Nach der Zubereitung der Arabidopsis-Pflanzen, schleifen Sie 10 Gramm der drei Wochen alten Sämlinge in flüssigem Stickstoff, mit einem kalten Mörtel und Stößel mit Sand. Fügen Sie 20 Milliliter Kaltschleifpuffer in das gemahlene Gewebe. Gut mischen und die Mischung auf Eis auftauen lassen.

Als nächstes zwei Schichten Schnellfiltrationsmaterial mit Schleifpuffer einweichen. Filtern Sie das Homogenat durch die beiden Schichten des Filtrationsmaterials in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 1,500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches, vorgekühltes 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr.

Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal unter den gleichen Bedingungen. Übertragen Sie den Überstand auf ein kaltes 38,50 Milliliter Ultrazentrifugenrohr und verladen ihn auf 35 Milliliter mit Kaltschleifpuffer. Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren zu können.

Mit einem gläsernen Teflon-Homogenisator das grüne Pellet im Schleifpuffer wieder aufhängen. Zentrifuge bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius für eine Stunde und den Überstand entsorgen. Verwenden Sie den glasigen Teflon-Homogenisator, um das grüne Pellet in 18,75 Millilitern eines x-Schleifpuffers wieder aufzuhängen.

Dann fügen Sie weitere 9,375 Milliliter eines x Schleifpuffers hinzu. Fügen Sie 9,375 Milliliter von vier x Löslichkeitslösung hinzu, um das Endvolumen auf 37,5 Milliliter zu bringen und 30 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius zu brüten. Danach verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zu zentrifugieren.

Übertragen Sie den Überstand, der die löslichen Membranen enthält, auf ein frisches 50 Milliliter-Konzentrigerohr. Nach der Zubereitung des IGG-Agaroseharzes das zuvor gewaschene IGG-Agaroseharz in das 50-Milliliter-Konustube mit den 37,5 Millilitern löslicher Membranen übertragen. Inkubieren Sie über Nacht auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag wird das IGG-Agaroseharz bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten abgelagert. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. War das IGG-Agaroseharz in 37,5 Milliliter Puffer A und brütete 10 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei Raumtemperatur.

Setzen Sie das Sedimentieren und Waschen des Harzes fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach das IGG-Agaroseharz in eine 500-Mikroliter-Spinsäule mit einem 35-Mikron-Filter übertragen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 300 MikroliterTEV-Elutionspuffer für den Ausgleich.

Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter TEV-Elutionspuffer hinzu, die 10 Mikroliter TEV-Protease enthalten. Die Spinsäule mit Perlen in einem Thermomixer bei 16 Grad Celsius und 350 U/min für zwei Stunden inkubieren. Öffnen Sie dann die Spin-Säule und legen Sie sie in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Rohr.

Drehen Sie diese Röhre bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um das Eluat zu sammeln. In dieser Studie wird ein TAP-markierter Chloroplasten-Hüllkurvenproteinkomplex aus transgenen A.thaliana-Pflanzen gereinigt. Die Immunoblot-Analyse bestätigt, dass isolieren TAP-TOC159 mit TOC75 und TOC33 des TOC-Komplexes interagiert.

Die Chloroplasten-Außenmembrankinase KOC1, die bekanntist, um TOC159 zu phosphorylieren, ist ebenfalls koisoliert. Das Vorhandensein von TIC110 zeigt, dass der isolierte TAP-TOC159-Komplex auch die Komponenten des TIC-Komplexes enthält. Der FBN1A-Antikörper erkannte den TAP-TOC159-Komplex nicht, was auf das Fehlen von Verunreinigungen hindeutet.

Bei der Negativkontrolle isolierte das immunpräzipierte NTAP-Protein keines der TOC-, TIC-Proteine und bestätigte die Spezifität der TAP-TOC159-Reinigung. Obwohl diese Methode Einblick in Chloroplasten-Protein-Import bieten kann, Kann es potenziell auf jeden anderen Komplex im Arabidopsis thaliana Flaschensystem angewendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Western Blotting oder Massenspektrometrie angewendet werden, um entweder das Vorhandensein bekannter Komponenten zu demonstrieren oder um neue Komponenten des TOC- und TIC-Komplexes zu identifizieren.

Diese Technik ebnete den Weg für die Forschung im Bereich des Chloroplasten-Proteins, um die Funktion neuer Komponenten der TOC- und TIC-Komplexe zu erforschen.