Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag
1. November 2018
Wir stellen Ihnen hier eine bewährte und getestete Protokoll für die Reinigung der Chloroplasten Import Proteinkomplexe (TOC-TIC-Komplex) mit der TAP-Tag. Das einstufige Affinität-Isolierung-Protokoll kann potenziell auf jedem Protein angewendet werden und verwendet werden, um neue Interaktionspartner identifizieren durch Massenspektrometrie.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Chloroplasten zu beantworten, z. B. die Zusammensetzung der Chloroplasten-Protein-Importmaschinerie. Es ist wichtig für die Begrünung und Photosynthese und damit für die Nahrungsmittelproduktion auf dem Planeten. Die molekulare Maschine besteht aus zwei separaten Komplexen im äußeren und inneren Element des Chloroplasten namens TOC und TIC, aber die Zusammensetzung ist nicht vollständig bekannt.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Reinigung des Arabidopsis TOC/TIC-Komplexes in einer einstufigen Reinigungsmethode, der TAP-TOC-Reinigung, erfolgen kann. Es ist eine spezifische und effiziente Methode. Im Allgemeinen können Forscher, die mit dieser Methode vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht mit der Isolierung von Chloroplastenmembranfraktionen, Waschmittel, Löslichkeit oder Affinitätsreinigung vertraut sind.
Nach der Zubereitung der Arabidopsis-Pflanzen, schleifen Sie 10 Gramm der drei Wochen alten Sämlinge in flüssigem Stickstoff, mit einem kalten Mörtel und Stößel mit Sand. Fügen Sie 20 Milliliter Kaltschleifpuffer in das gemahlene Gewebe. Gut mischen und die Mischung auf Eis auftauen lassen.
Als nächstes zwei Schichten Schnellfiltrationsmaterial mit Schleifpuffer einweichen. Filtern Sie das Homogenat durch die beiden Schichten des Filtrationsmaterials in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 1,500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches, vorgekühltes 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr.
Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal unter den gleichen Bedingungen. Übertragen Sie den Überstand auf ein kaltes 38,50 Milliliter Ultrazentrifugenrohr und verladen ihn auf 35 Milliliter mit Kaltschleifpuffer. Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren zu können.
Mit einem gläsernen Teflon-Homogenisator das grüne Pellet im Schleifpuffer wieder aufhängen. Zentrifuge bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius für eine Stunde und den Überstand entsorgen. Verwenden Sie den glasigen Teflon-Homogenisator, um das grüne Pellet in 18,75 Millilitern eines x-Schleifpuffers wieder aufzuhängen.
Dann fügen Sie weitere 9,375 Milliliter eines x Schleifpuffers hinzu. Fügen Sie 9,375 Milliliter von vier x Löslichkeitslösung hinzu, um das Endvolumen auf 37,5 Milliliter zu bringen und 30 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius zu brüten. Danach verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zu zentrifugieren.
Übertragen Sie den Überstand, der die löslichen Membranen enthält, auf ein frisches 50 Milliliter-Konzentrigerohr. Nach der Zubereitung des IGG-Agaroseharzes das zuvor gewaschene IGG-Agaroseharz in das 50-Milliliter-Konustube mit den 37,5 Millilitern löslicher Membranen übertragen. Inkubieren Sie über Nacht auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird das IGG-Agaroseharz bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten abgelagert. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. War das IGG-Agaroseharz in 37,5 Milliliter Puffer A und brütete 10 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei Raumtemperatur.
Setzen Sie das Sedimentieren und Waschen des Harzes fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach das IGG-Agaroseharz in eine 500-Mikroliter-Spinsäule mit einem 35-Mikron-Filter übertragen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 300 MikroliterTEV-Elutionspuffer für den Ausgleich.
Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter TEV-Elutionspuffer hinzu, die 10 Mikroliter TEV-Protease enthalten. Die Spinsäule mit Perlen in einem Thermomixer bei 16 Grad Celsius und 350 U/min für zwei Stunden inkubieren. Öffnen Sie dann die Spin-Säule und legen Sie sie in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Rohr.
Drehen Sie diese Röhre bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um das Eluat zu sammeln. In dieser Studie wird ein TAP-markierter Chloroplasten-Hüllkurvenproteinkomplex aus transgenen A.thaliana-Pflanzen gereinigt. Die Immunoblot-Analyse bestätigt, dass isolieren TAP-TOC159 mit TOC75 und TOC33 des TOC-Komplexes interagiert.
Die Chloroplasten-Außenmembrankinase KOC1, die bekanntist, um TOC159 zu phosphorylieren, ist ebenfalls koisoliert. Das Vorhandensein von TIC110 zeigt, dass der isolierte TAP-TOC159-Komplex auch die Komponenten des TIC-Komplexes enthält. Der FBN1A-Antikörper erkannte den TAP-TOC159-Komplex nicht, was auf das Fehlen von Verunreinigungen hindeutet.
Bei der Negativkontrolle isolierte das immunpräzipierte NTAP-Protein keines der TOC-, TIC-Proteine und bestätigte die Spezifität der TAP-TOC159-Reinigung. Obwohl diese Methode Einblick in Chloroplasten-Protein-Import bieten kann, Kann es potenziell auf jeden anderen Komplex im Arabidopsis thaliana Flaschensystem angewendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Western Blotting oder Massenspektrometrie angewendet werden, um entweder das Vorhandensein bekannter Komponenten zu demonstrieren oder um neue Komponenten des TOC- und TIC-Komplexes zu identifizieren.
Diese Technik ebnete den Weg für die Forschung im Bereich des Chloroplasten-Proteins, um die Funktion neuer Komponenten der TOC- und TIC-Komplexe zu erforschen.
Überblick
Dieser Artikel stellt ein Ein-Schritt-Affinitäts-Isolationsprotokoll zur Reinigung von Chloroplasten-Proteinimport-Komplexen (TOC-TIC-Komplex) unter Verwendung des TAP-Tags vor. Diese Methode kann neue Interaktionspartner durch Massenspektrometrie identifizieren und ist entscheidend für das Verständnis der Chloroplastenfunktion.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Chloroplastenbiologie
- Proteinreinigung
- Massenspektrometrie
Hintergrund
- Der Chloroplasten-Proteinimportapparat ist für die Photosynthese und Nahrungsproduktion unerlässlich.
- TOC- und TIC-Komplexe sind am Proteinimport beteiligt, aber ihre vollständige Zusammensetzung ist nicht gut verstanden.
- Aktuelle Methoden zur Isolierung dieser Komplexe können komplex und zeitaufwendig sein.
- Diese Studie zielt darauf ab, den Reinigungsprozess zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Ein einfaches Protokoll zur Reinigung des TOC-TIC-Komplexes zu entwickeln.
- Die Identifizierung neuer Komponenten zu erleichtern, die am Chloroplasten-Proteinimport beteiligt sind.
- Eine Methode bereitzustellen, die auf andere Proteinkomplexe in Arabidopsis thaliana angewendet werden kann.
Verwendete Methoden
- Präparation von Arabidopsis-Sämlingen und Vermahlung in flüssigem Stickstoff.
- Sequenzielle Zentrifugation zur Isolierung von Chloroplastenmembranen.
- Affinitätsreinigung unter Verwendung von IGG-Agarose-Resin.
- Immunoblot-Analyse zur Bestätigung des Vorhandenseins spezifischer Proteine.
Hauptergebnisse
- Der TAP-TOC159-Komplex wurde erfolgreich gereinigt und zeigte eine Interaktion mit TOC75 und TOC33.
- Die Ko-Isolierung von TIC110 zeigte das Vorhandensein von TIC-Komponenten im gereinigten Komplex an.
- Die Methode zeigte Spezifität, da negative Kontrollen keine Ko-Isolierung mit TOC- und TIC-Proteinen zeigten.
- Diese Technik ermöglicht eine weitere Erforschung der Chloroplasten-Proteinimportmechanismen.
Schlussfolgerungen
- Die TAP-Tag-Reinigungsmethode ist effizient und spezifisch für die Isolierung von Chloroplasten-Proteinkomplexen.
- Dieser Ansatz kann die Forschung zum Chloroplasten-Proteinimportsystem verbessern.
- Zukünftige Studien können diese Methode nutzen, um neue Komponenten der TOC- und TIC-Komplexe zu identifizieren.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
